本發(fā)明涉及利用下腳料制備類肝素的方法，屬于黏多糖生物制藥技術領域。

背景技術：

類肝素（heparinoid）即類似肝素的物質，是在化學結構上與肝素有一定程度的類似、具有抗凝血活性的酸性黏多糖類物質。類肝素具有抗血栓形成、消炎、止痛、改善患處血液循環(huán)、吸收滲出物、治愈水腫及浮腫、促進組織修復等作用。與肝素相比，類肝素的抗凝血作用弱而緩和，產(chǎn)生抗栓作用時出血可能性小，半衰期長等特點，用藥安全，長期使用副作用少。該產(chǎn)品廣泛用于軟膏制劑、口服保健品、化妝品等。類肝素是一類混合物，它由乙酰肝素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸軟骨素和少量其他雜多糖組成，其中乙酰肝素和硫酸皮膚素為其主要成分。各組分所占比例不同，所組成的類肝素質量特性不同，表現(xiàn)為比旋度與效價值有所差異。目前此產(chǎn)品主要銷往歐洲市場，價格區(qū)間一般在700～1600美元／公斤，其價格的高低與類肝素的比旋度和效價高低密切相關。目前此種類肝素產(chǎn)品在市場上供不應求，具有很好的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種利用肝素鈉下腳料制備正比旋類肝素和負比旋類肝素的方法。

本發(fā)明目的是通過以下步驟實現(xiàn)的：

a. 粗分

將肝素鈉下腳料按濕重5～30%w/v濃度加入純化水后再加入2～10%w/v氯化鈉，氯化鈉溶解后，調整藥液pH4～8后加入乙醇，當藥液中乙醇濃度為30～38%v/v時，在10～30℃下靜置沉淀，沉淀2～10小時后收集沉淀得到類肝素粗品；

b. 精制

將上述類肝素粗品按濕重5～30%w/v濃度加入純化水后再加入2～10%w/v氯化鈉，氯化鈉溶解后，調整藥液pH4～8后加入乙醇，當藥液中乙醇濃度為32～35%v/v時，在10～30℃下靜置沉淀，沉淀2～10小時后收集沉淀制得正比旋類肝素；在上清液中加入乙醇，當上清液中乙醇濃度為34～43%v/v時，在10～30℃下靜置沉淀，沉淀2～10小時后收集沉淀制得負比旋類肝素；

c. 氧化脫色

將上述精制的正比旋類肝素濕品按濕重10～50%w/v濃度加入純化水溶解后，在25～35℃下調整藥液pH9.0～12.0后，加入0.5～4.0%v/v過氧化氫進行反應；

將上述精制的負比旋類肝素濕品按濕重10～50%w/v濃度加純化水溶解后，在25～35℃下調整溶液pH9.0～12.0后，加入0.5～4.0%v/v過氧化氫進行反應；

d. 沉淀

上述正比旋類肝素氧化反應8～36小時后，按質量體積比向藥液中加入1～6%的氯化鈉，氯化鈉溶解后，調整藥液pH4～8，再加入1.5～3.0倍藥液體積的乙醇，然后在10～30℃下靜置沉淀，沉淀8～24小時后收集沉淀物正比旋類肝素；

上述負比旋類肝素氧化反應8～36小時后后，按質量體積比向藥液中加入1～6%的氯化鈉，氯化鈉溶解后，調整藥液pH4～8，再加入1.5～3.0倍藥液體積的乙醇，然后在10～30℃下靜置沉淀，沉淀8～24小時后收集沉淀物負比旋類肝素；

e. 冷凍干燥

將上述正比旋類肝素沉淀物按濕重30～45%濃度加入純化水溶解后降溫，降溫至-50～-60℃時抽真空，當真空度≤15Pa后緩慢加熱，加熱至50～55℃后保溫，保溫3～5小時后制得比旋度為0°～＋40°、效價≥50.0 USPU/mg的正比旋類肝素；

將上述負比旋類肝素沉淀物按濕重30～45%濃度加入純化水溶解后降溫，降溫至-50～-60℃時抽真空，當真空度≤15Pa后緩慢加熱，加熱至50～55℃后保溫，保溫3～5小時后制得比旋度為-15°～0°、效價≥50.0 USPU/mg的負比旋類肝素。

本發(fā)明取得的技術進步：

本發(fā)明建立的方法主要是從肝素鈉下腳料中通過乙醇分級沉淀，得到類肝素原料粗品；然后通過乙醇分級沉淀從類肝素原料中制備出正比旋類肝素和負比旋類肝素。

本發(fā)明采用從粗品肝素鈉到精品肝素鈉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的下腳料為原料，從下腳料中進一步深加工，采用乙醇分級沉淀獲得比旋度為0°～＋40°、效價≥50.0 USPU/mg的正比旋類肝素和比旋度為-15°～0°、效價≥50.0 USPU/mg的負比旋類肝素，實現(xiàn)了將下腳料變廢為寶的過程，可以為企業(yè)創(chuàng)造出較大的額外收益，使企業(yè)年可獲利2500萬元，工藝步驟簡易，綠色環(huán)保，不產(chǎn)生有毒有害物質，成本低廉，易于規(guī)模化生產(chǎn)。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1：a. 粗分 取生產(chǎn)肝素鈉精品2kg下腳料濕品加純化水溶解并定容至40L后，加入3.2kg氯化鈉，氯化鈉溶解后，再用3mol/L鹽酸溶液調整溶液pH6.0后加入乙醇，使溶液中乙醇的濃度為37.5%L/L，然后在15±1℃靜置沉淀，沉淀8小時后收集沉淀得到類肝素粗品0.8kg；

b. 精制 將上述0.8kg類肝素粗品加純化水溶解并定容至10L，再加入0.8kg氯化鈉，氯化鈉溶解后，用3mol/L鹽酸調整溶液pH6.0，再加入乙醇使溶液中乙醇的濃度為34.5%L/L，然后在15±1℃靜置沉淀，沉淀8小時后收集沉淀得到0.3kg正比旋類肝素濕品；在上清液中補加乙醇，使得溶液中乙醇的濃度38%L/L，然后在15±1℃靜置沉淀，沉淀8小時后收集沉淀得到0.6kg負比旋類肝素濕品；

將所制得的正比旋類肝素和負比旋類肝素分別取樣測定比旋度和效價，測定結果為：正比旋類肝素比旋度為+7.8°，效價為69.5USPU/mg；負比旋類肝素比旋度為-6.9°，效價為56.0USPU/mg；

取樣檢測如果正比旋類肝素若不能滿足比旋度為0～＋40°，效價≥50.0 USPU/mg的標準，須重復上述正比旋類肝素沉淀過程；如果負比旋類肝素樣品不能滿足比旋度為-15～0°，效價≥50.0 USPU/mg的標準，須重復上述負比旋類肝素沉淀過程，當正比旋類肝素樣品和負比旋類肝素樣品比旋度和效價符合要求后，則可進行以下氧化脫色；

c. 氧化脫色

將精制的0.3kg正比旋類肝素濕品加純化水溶解并定容至1L后，將溶液溫度調整為30±1℃，再用3mol/L氫氧化鈉溶液調整溶液pH10.2后，加入10ml 30%過氧化氫進行反應；

將精制的0.6kg負比旋類肝素濕品加純化水溶解并定容至2L后，將溶液溫度調整為30±1℃，再用3mol/L氫氧化鈉溶液調整溶液pH9.8，然后加入20ml 30%過氧化氫進行反應；

d. 沉淀

上述正比旋類肝素反應結束即反應10小時后，向藥液中加入35g氯化鈉，氯化鈉溶解后用3mol/L鹽酸溶液調整藥液pH6.3，再加入2L乙醇，然后在15±1℃靜置沉淀，沉淀10小時后收集正比旋類肝素沉淀；

上述負比旋類肝素反應結束即反應10小時后，向藥液中加入70g氯化鈉溶解，氯化鈉溶解后用3mol/L鹽酸溶液調整藥液pH6.0，再加入4L乙醇，然后在15±1℃靜置沉淀，沉淀10小時后收集負比旋類肝素沉淀；

e. 冷凍干燥

向上述正比旋類肝素沉淀中加入500ml純化水攪拌溶解后，補加純化水定容至800ml，然后將藥液裝入凍干盤放入凍干機中，開始對藥液降溫，當制品溫度降至-57℃后，對整個系統(tǒng)抽真空，當干燥箱內真空度為14Pa后對制品緩慢加熱，當制品溫度升至51℃后保溫，保溫3.5小時后停止凍干，制得正比旋類肝素86g，經(jīng)檢測，比旋度為+8.0°，效價為69.8USPU/mg；

向上述負比旋類肝素沉淀中加入1200ml純化水攪拌溶解后，補加純化水定容至1500ml，然后將藥液裝入凍干盤放入凍干機中，開始對藥液降溫，當制品溫度降至-55℃后，對整個系統(tǒng)抽真空，當干燥箱內真空度為12Pa后對制品緩慢加熱，當制品溫度升至53℃后保溫，保溫5小時后停止凍干，制得負比旋類肝素200g，經(jīng)檢測，比旋度為-7.1°，效價為56.5USPU/mg。

實施例2：本實施例與實施例1不同之處是，

a. 粗分 取生產(chǎn)肝素鈉精品4kg下腳料濕品加純化水溶解并定容至40L后，加入2.0kg氯化鈉，氯化鈉溶解后，再用3mol/L鹽酸溶液調整溶液pH5.8后加入乙醇，使溶液中乙醇的濃度為35.4%L/L，然后在11±1℃靜置沉淀，沉淀6小時后收集沉淀得到類肝素粗品2.0kg；

b. 精制 將上述2.0kg類肝素粗品加純化水溶解并定容至10L，再加入0.3kg氯化鈉溶解后，用3mol/L鹽酸調整溶液pH4.5，再加入乙醇使溶液中乙醇的濃度為32.7%L/L，然后在11±1℃下靜置沉淀，沉淀10小時后收集沉淀得到0.9kg正比旋類肝素濕品；在上清液中補加乙醇，使得溶液中乙醇的濃度34.8%L/L，然后在11±1℃下靜置沉淀，沉淀10小時后收集沉淀得到1.4kg負比旋類肝素濕品；

將所制得的正比旋類肝素和負比旋類肝素分別取樣測定比旋度和效價，測定結果為：正比旋類肝素比旋度為+6.5°，效價為60.4USPU/mg；負比旋類肝素比旋度為-7.4°，效價為 54.2USPU/mg；

取樣檢測如果正比旋類肝素若不能滿足比旋度為0～＋40°，效價≥50.0 USPU/mg的標準，須重復上述正比旋類肝素沉淀過程；如果負比旋類肝素樣品不能滿足比旋度為-15～0°，效價≥50.0 USPU/mg的標準，須重復上述負比旋類肝素沉淀過程。當正比旋類肝素樣品和負比旋類肝素樣品比旋度和效價符合要求后，則可進行以下氧化脫色；

c. 氧化脫色

將精制的0.9kg正比旋類肝素濕品加純化水溶解并定容至4.5L后，將溶液溫度調整為26±1℃，再用3mol/L氫氧化鈉溶液調整溶液pH11.0后，加入90ml 30%過氧化氫進行反應；

將上述精制的1.4kg負比旋類肝素濕品加純化水溶解后并定容至7L后，將溶液溫度調整為26±1℃，再用3mol/L氫氧化鈉溶液調整溶液pH9.8后加入140ml 30%過氧化氫進行反應；

d. 沉淀

上述正比旋類肝素反應結束即反應12小時后，向藥液中加入225g氯化鈉，氯化鈉溶解后用3mol/L鹽酸溶液調整藥液pH5.9，再加入12L乙醇，然后在11±1℃下靜置沉淀，沉淀8小時后收集正比旋類肝素沉淀；

上述負比旋類肝素反應結束即反應8小時后，向藥液中加入350g氯化鈉溶解，氯化鈉溶解后用3mol/L鹽酸溶液調整藥液pH4.6，再加入18L乙醇，然后在11±1℃下靜置沉淀8小時后收集負比旋類肝素沉淀；

e. 冷凍干燥

向上述正比旋類肝素沉淀中加入2000ml純化水攪拌溶解后，補加純化水定容至2500ml，然后將藥液裝入凍干盤放入凍干機中后，開始對藥液降溫，當制品溫度降至-51℃后，對整個系統(tǒng)抽真空，當干燥箱內真空度為11Pa后，對制品緩慢加熱，當制品溫度升至54℃后保溫，保溫4小時后停止凍干，制得正比旋類肝素275g，經(jīng)檢測，比旋度為+6.4°，效價為60.8USPU/mg；

向上述負比旋類肝素沉淀中加入3500ml純化水攪拌溶解后，補加純化水定容至4000ml，然后將藥液裝入凍干盤放入凍干機中，開始對藥液降溫，當制品溫度降至-52℃后，對整個系統(tǒng)抽真空，當干燥箱內真空度為15Pa后，對制品緩慢加熱，當制品溫度升至55℃后保溫，保溫5小時后停止凍干，制得負比旋類肝素456g，經(jīng)檢測，比旋度為-7.6°，效價為54.5USPU/mg。

實施例3：本實施例與實施例1、實施例2不同之處是，

a. 粗分 取生產(chǎn)肝素鈉精品10kg下腳料濕品加純化水溶解并定容至40L后，加入0.8kg氯化鈉，氯化鈉溶解后，再用3mol/L氫氧化鈉溶液調整溶液pH7.0后加入乙醇，使溶液中乙醇的濃度為32.3%L/L，然后在20±1℃下靜置沉淀，沉淀3小時后收集沉淀得到類肝素粗品5.2kg；

b. 精制 將上述5.2kg類肝素粗品加純化水溶解并定容至20L，再加入0.4kg氯化鈉溶解后，用3mol/L氫氧化鈉調整溶液pH7.1后加入乙醇，當溶液中乙醇濃度為33.3%L/L時，在20±1℃下靜置沉淀，沉淀4小時后收集沉淀得到2.1kg正比旋類肝素濕品；在上清液中補加乙醇，當上清液中乙醇濃度為42.4%L/L時，在20±1℃下靜置沉淀，沉淀4小時后收集沉淀得到2.8kg負比旋類肝素濕品；

將所制得的正比旋類肝素和負比旋類肝素分別取樣測定比旋度和效價，測定結果為：正比旋類肝素比旋度為+8.5°，效價為72.4USPU/mg；負比旋類肝素比旋度為-5.5°，效價為58.3USP U/mg；

取樣檢測如果正比旋類肝素若不能滿足比旋度為0～＋40°，效價≥50.0 USPU/mg的標準，須重復上述正比旋類肝素沉淀過程；如果負比旋類肝素樣品不能滿足比旋度為-15～0°，效價≥50.0 USPU/mg的標準，須重復上述負比旋類肝素沉淀過程。當正比旋類肝素樣品和負比旋類肝素樣品比旋度和效價符合要求后，則可進行以下氧化脫色；

c. 氧化脫色

將精制的2.1kg正比旋類肝素濕品加純化水溶解并定容至5L后，將溶液溫度調整為34±1℃，再用3mol/L氫氧化鈉溶液調整溶液pH12.0后，加入150ml 30%過氧化氫進行反應；

將上述精制的2.8kg負比旋類肝素濕品加純化水溶解后并定容至6.5L后，將溶液溫度調整為34±1℃，再用3mol/L氫氧化鈉溶液調整溶液pH12.0后加入195ml 30%過氧化氫進行反應；

d. 沉淀

上述正比旋類肝素反應結束即反應36小時后，向藥液中加入50g氯化鈉，氯化鈉溶解后用3mol/L氫氧化鈉溶液調整藥液pH8.0，再加入7.5L乙醇，然后在20±1℃下靜置沉淀，沉淀24小時后收集正比旋類肝素沉淀；

上述負比旋類肝素反應結束即反應36小時后，向藥液中加入65g氯化鈉溶解，氯化鈉溶解后用3mol/L氫氧化鈉溶液調整藥液pH8.0，再加入10L乙醇，然后在20±1℃下靜置沉淀，沉淀24小時后收集負比旋類肝素沉淀；

e. 冷凍干燥

向上述正比旋類肝素沉淀中加入6000ml純化水攪拌溶解后，補加純化水定容至7000ml，然后將藥液裝入凍干盤放入凍干機中，開始對藥液降溫，當制品溫度降至-58℃后，對整個系統(tǒng)抽真空，當干燥箱內真空度為14Pa后，對制品緩慢加熱，當制品溫度升至55℃后保溫，保溫5小時后停止凍干，制得正比旋類肝素672g，經(jīng)檢測，比旋度為+8.7°，效價為72.8USPU/mg；

向上述負比旋類肝素沉淀中加入8000ml純化水攪拌溶解后，補加純化水定容至9000ml，然后將藥液裝入凍干盤放入凍干機中，開始對藥液降溫，當制品溫度降至-55℃后，對整個系統(tǒng)抽真空，當干燥箱內真空度為13Pa后，對制品緩慢加熱，當制品溫度升至51℃后保溫，保溫3小時后停止凍干，制得負比旋類肝素905g，經(jīng)檢測，比旋度為-5.2°，效價為58.5USPU/mg。