本發(fā)明涉及一種枸杞多糖的制備方法，具體涉及一種超聲波耦合膜分離分級制備不同分子量枸杞多糖的方法。
技術背景
枸杞(Lycium bararumL ) 是我國傳統(tǒng)藥食同源中藥材，有滋陰補腎、養(yǎng)肝明目等功效。近年來，青海柴達木盆地人工栽培枸杞發(fā)展迅速，至2015年總種植面積達30萬畝，超過了寧夏。柴達木盆地獨特的自然條件和潔凈的生態(tài)環(huán)境，方圓百公里范圍無任何污染，晝夜溫差較大，病蟲害輕，施藥次數少，農殘檢出率低，使柴達木枸杞具有顆粒大而飽滿，肉質肥厚而核少，色澤鮮艷而味甘等特性，被譽為青藏高原“紅寶石”，業(yè)內有“中國枸杞在寧夏，精品枸杞在青?！敝f。新鮮枸杞在生產過程中，將會出現大量的枸杞果渣，通常這部分果渣將會被當作廢品棄去，造成了很大的浪費，同時增加了企業(yè)的生產成本。經檢測枸杞果渣中多糖含量達10.09%，枸杞多糖含量豐富，功效明確，逐步得到國內外的認可，應用領域不斷擴展，具備廣闊的市場前景。
枸杞多糖(Lycium Bararum polysaccharide，LBP) 是枸杞的主要功效成分，具良好的抗氧化活性，其主要藥理作用有抗衰老、降血糖、降血脂、增強免疫功能、抗疲勞及抗腫瘤等，因此LBP作為天然抗氧化劑具很高的開發(fā)利用價值。LBP組成較為復雜，分子量可從幾千到幾十萬。黃琳娟等從制備枸杞多糖LBP經DEAE-cellulose，Sephadex柱層析得到均一組分LbGP3、LbGP4和LbGP5，分子量分別為 2.37×104、9.25×104、21.48×104；其中LbGP4枸杞子糖綴合物LbGp4經U-消除、柱層析分離后得到一條分子量高達180800的分支多糖化合物LbGp4-OL。LbGp4-OL糖基組成為n(Rha)∶n(Ara)∶n(Gal)= 0.05∶1.33∶1。根據甲基化、部分酸水解及1HNMR、13CNMR分析，確定了其主要的結構，并對LbGp4和LbGp4-OL的免疫活性進行了研究。研究發(fā)現：純化后的糖綴合物LbGp4及糖鏈LbGp4-OL不僅對正常小鼠脾細胞增殖反應有明顯的促進作用，而且對快速老化模型小鼠SAMP8和SAMR1免疫功能低下也有明顯的改善作用，表明枸杞多糖具有直接促脾細胞增殖的作用。從它們的化學性質和分子結構來看，枸杞子糖綴合物LbGp4及其糖鏈LbGp4-OL的分子量都較大,并且糖鏈具有密集的分支,這在一般的植物多糖中是罕見的。因此,它具有較強的免疫調節(jié)作用可能與這種結構有關（黃琳娟等，藥學學報，1998.33（7）:512-516；高等學校化學學報，2001.3（22）：407-411）。彭雪梅等采用柱色譜法得到枸杞糖綴合物LbGp2，經HPLC,CE,GC,SE及糖含量分析、元素分析和氨基酸分析等研究其理化性質，并用半體內法、形態(tài)學計數法和比色法等研究Lbp2對腹腔巨噬細胞吞噬功能、淋巴細胞的轉化以及對小鼠血清半數溶血等的影響。結果發(fā)現LbGp2是均一組份，其分子量為6.8×104，糖含量為90.7%，糖組成為Ara-Gal 3∶4(摩爾比)，并含有18種天然氨基酸。免疫活性試驗表明Lbp2具有顯著的免疫增強作用；還具有很好的抗氧化作用。田庚元等從寧夏枸杞子提取得到的粗多糖，經DEAE-Cellulose和Sepadexe-100柱層析，得到均一的枸杞子糖蛋白LbGP。分子量由SDS-PAGE測定為88kd，糖含量為70%，糖組成為:Gal:Gl＝2.5:1.0:1.0(摩爾比)，并含有其他18種天然氨基酸（田庚元等，生物化學與生物物理學報，1995，27（2）:201-206）。姚瑞祺等用5種不同截留分子量(MWCO)的超濾膜分離LBP，苯酚-硫酸法測定不同分子量多糖的含量，鐵離子還原力(FRAP)法測定抗氧化活性。結果得到了6種不同分子量的LBP樣品液。分子量在5000以下的LBP占多數，達到74.5%;分子量大于3萬的較低，尚不到7%。ＭＷ3萬-10萬的LBP抗氧化活性最強，其他5種LBP也都有一定程度的抗氧化活性（姚瑞祺等，食品工業(yè)科技，2008,29:89-91）。
植物多糖的提取多種多樣，但是提取活性多糖的方法卻基本相似，都是利用多糖易溶于水、酸、堿而不溶于醇等有機溶劑的特點，但符合綠色、環(huán)保、無毒、具備較高提取效率的活性多糖的工業(yè)化提取、純化的方法很少。
水溶性枸杞多糖的純化方法一般有乙醇沉淀法、柱層析法和Sevage去除蛋白質法。乙醇沉淀法利用多數糖類物質不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑這一性質通過添加有機溶劑把不溶于溶劑的多糖類物質沉淀出來，從而達到和可溶性小分子物質（比如色素小分子、鹽類小分子等）分離的目的得到多糖粗品；柱層析具有較高的分離效能，但凝膠柱價格昂貴，通常應用在實驗室中制備少量的純品，不適合在工業(yè)上大規(guī)模使用；Sevage去除蛋白質法存在有機試劑消耗大，操作復雜，多糖損失嚴重等缺點。超濾法提取純化多糖具有工藝流程簡單、產品純度高等特點。膜分離技術由于具有無相變過程、無污染等優(yōu)點，逐步在工業(yè)化生產中使用。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的是提供一種超聲波耦合膜分離分級制備不同分子量枸杞多糖的方法，該方法具有節(jié)能、綠色、環(huán)保、無污染的特點。本發(fā)明的方法使枸杞渣多糖下游分級提取制備，能夠根據枸杞粗多糖的特點，充分利用無機尼龍網和有機超濾膜的特點，選擇性的截留純化濃縮枸杞多糖，滿足大規(guī)模制備高純度、不同應用效果的枸杞多糖的工業(yè)化生產需求。
本發(fā)明的技術方案是：一種超聲波耦合膜分離分級制備不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步驟：
步驟1，將枸杞渣晾干，用粉碎機粉碎，獲得枸杞渣粉末；
步驟2，對步驟1枸杞渣粉末按質量體積比為1:20-30加入溶劑，室溫浸泡3h，得料液；料液在超聲功率為200-300w，超聲波提取枸杞渣3次，每次20-30min，合并濾液，獲得枸杞多糖提取液；
步驟3，對步驟2的枸杞多糖提取液，經60-75目8層尼龍網過濾，除去枸杞籽及不溶物；
步驟4，對步驟3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液靜置24小時，收集上清液，棄渣；
步驟5，對步驟4收集的上清液在離心分離機上，以7000-9000轉、離心15-25min進行固液分離，收集上清液，棄渣，獲得枸杞多糖清液；
步驟6，對步驟5所得的枸杞多糖清液再經過不同分子量的膜分離分級純化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分離分級純化是指先用6.7萬分子量的超濾膜超濾，獲得透過液和截留液，截留液再用10萬分子量的超濾膜超濾，獲得透過液和截留液，即分別收集到分子量小于6.7萬、6.7萬-10萬和大于10萬的超濾液；
步驟7，對步驟6所得的超濾液經濃縮后干燥，分別制得分子量小于6.7萬的水溶性枸杞多糖粉、分子量為6.7-10萬之間的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10萬的水溶性枸杞多糖粉。
所述步驟1中的枸杞渣是枸杞生產企業(yè)制備枸杞系列產品過程中的殘渣。
所述步驟2中的溶劑為水。
所述步驟2中的超聲波提取所用的提取設備為超聲波清洗器。
所述步驟6中的膜分離采用中空纖維膜小試設備。
所述步驟7中的超濾液的濃縮時，濃縮采用的設備是真空濃縮設備。
所述步驟7中的干燥為噴霧干燥或真空冷凍干燥。
本發(fā)明的優(yōu)點是：本發(fā)明采用膜分離技術進行分離，根據枸杞多糖分子量的大小，選擇分子截流量不同的膜進行分離，可以得到分子量大小不同的枸杞多糖，突出每種枸杞多糖的應用效果，拓寬了枸杞多糖的應用范圍。同時協(xié)同超聲波提取提高了枸杞多糖提取效果，而且省時、高效、節(jié)能、綠色和環(huán)保。
下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但不作為本發(fā)明的限定。
具體實施方式
實施例1
一種超聲波耦合膜分離分級制備不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步驟：
步驟1，將枸杞渣晾干，用粉碎機粉碎，獲得枸杞渣粉末；
步驟2，對步驟1枸杞渣粉末按質量體積比為1:20加入溶劑，室溫浸泡3h得料液；料液在超聲功率為200w，超聲波提取枸杞渣3次，每次20min，合并濾液，獲得枸杞多糖提取液；所述溶劑為水；
步驟3，對步驟2的枸杞多糖提取液，經60目8層尼龍網過濾，除去枸杞籽及不溶物；
步驟4，對步驟3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液靜置24小時，收集上清液，棄渣；
步驟5，對步驟4收集的上清液在離心分離機上，以7000轉、離心15min進行固液分離，收集上清液，棄渣，獲得枸杞多糖清液；
步驟6，對步驟5所得的枸杞多糖清液再經過不同分子量的膜分離分級純化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分離分級純化是指先用6.7萬分子量的超濾膜超濾，獲得透過液（分子量小于6.7萬的超濾液）和截留液（分子量大于6.7萬的超濾液），截留液再用10萬分子量的超濾膜超濾，獲得透過液（分子量在6.7-10萬的超濾液）和截留液（分子量大于10萬的超濾液），即分別收集到分子量小于6.7萬、分子量6.7萬-10萬和分子量大于10萬的超濾液；
步驟7，對步驟6所得的超濾液經濃縮后干燥，分別制得分子量小于6.7萬的水溶性枸杞多糖粉、分子量為6.7-10萬之間的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10萬的水溶性枸杞多糖粉。以葡萄糖為標品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量；以牛血清蛋白為標樣，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量；以半乳糖醛酸為標樣，采用咔唑-硫酸法測定樣品中的半乳糠醛酸含量，結果見表1。
表1不同分子量枸杞多糖的多糖、蛋白質、半乳糠醛酸的含量
實施例2
一種超聲波耦合膜分離分級制備不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步驟：
步驟1，將枸杞渣晾干，用粉碎機粉碎，獲得枸杞渣粉末；
步驟2，對步驟1枸杞渣粉末按質量體積比為1:25加入溶劑，室溫浸泡4h，得料液；料液在超聲功率為250w，超聲波提取枸杞渣3次，每次25min，合并濾液，獲得枸杞多糖提取液；所述溶劑為水；
步驟3，對步驟2的枸杞多糖提取液，經65目8層尼龍網過濾，除去枸杞籽及不溶物；
步驟4，對步驟3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液靜置24小時，收集上清液，棄渣；
步驟5，對步驟4收集的上清液在離心分離機上，以8000轉、離心20min進行固液分離，收集上清液，棄渣，獲得枸杞多糖清液；
步驟6，對步驟5所得的枸杞多糖清液再經過不同分子量的膜分離分級純化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分離分級純化是指先用6.7萬分子量的超濾膜超濾，獲得透過液（分子量小于6.7萬的超濾液）和截留液（分子量大于6.7萬的超濾液），截留液再用10萬分子量的超濾膜超濾，獲得透過液（分子量在6.7萬-10萬的超濾液）和截留液（分子量大于10萬的超濾液），即分別收集到分子量小于6.7萬、分子量6.7萬-10萬和大于10萬分子量的超濾液；
步驟7，對步驟6所得的超濾液經濃縮后干燥，分別制得分子量小于6.7萬的水溶性枸杞多糖粉、分子量為6.7萬-10萬之間的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10萬的水溶性枸杞多糖粉。以葡萄糖為標品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量；以牛血清蛋白為標樣，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量；以半乳糖醛酸為標樣，采用咔唑-硫酸法測定樣品中的半乳糠醛酸含量，結果見表2。
表2不同分子量枸杞多糖的多糖、蛋白質、半乳糠醛酸的含量
實施例3
一種超聲波耦合膜分離分級制備不同分子量枸杞多糖的方法，其特征在于包括步驟：
步驟1，將枸杞渣晾干，用粉碎機粉碎，獲得枸杞渣粉末；
步驟2，對步驟1枸杞渣粉末按質量體積比為1:30加入溶劑，室溫浸泡5h，得料液；料液在超聲功率為300w，超聲波提取枸杞渣3次，每次30min，合并濾液，獲得枸杞多糖提取液；所述溶劑為水；
步驟3，對步驟2的枸杞多糖提取液，經70目8層尼龍網過濾，除去枸杞籽及不溶物；
步驟4，對步驟3除去枸杞籽及不溶物后的枸杞多糖提取液靜置24小時，收集上清液，棄渣；
步驟5，對步驟4收集的上清液在離心分離機上，以9000轉、離心30min進行固液分離，收集上清液，棄渣，獲得枸杞多糖清液；
步驟6，對步驟5所得的枸杞多糖清液再經過不同分子量的膜分離分級純化，得到不同分子量的枸杞多糖溶液；所述的不同分子量的膜分離分級純化是指先用6.7萬分子量的超濾膜超濾，獲得透過液（分子量小于6.7萬的超濾液）和截留液（分子量大于6.7萬的超濾液），截留液再用10萬分子量的超濾膜超濾，獲得透過液（分子量在6.7萬-10萬的超濾液）和截留液（分子量大于10萬的超濾液），即分別收集到分子量小于6.7萬、分子量6.7萬-10萬和大于10萬的超濾液；
步驟7，對步驟6所得的超濾液經濃縮后干燥，分別制得分子量小于6.7萬的水溶性枸杞多糖粉、分子量為6.7萬-10萬之間的水溶性枸杞多糖粉和分子量大于10萬的水溶性枸杞多糖粉。以葡萄糖為標品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量；以牛血清蛋白為標樣，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量；以半乳糖醛酸為標樣，采用咔唑-硫酸法測定樣品中的半乳糠醛酸含量，結果見表3。
表3.不同分子量枸杞多糖的多糖、蛋白質、半乳糠醛酸的含量
實施例4
比較例：方法1是以實施例3制備不同分子量枸杞多糖；方法2與實施例3制備枸杞多糖的步驟基本相同，不同的是方法2醇沉代替了膜分離；方法3與實施例3制備枸杞多糖的步驟基本相同，不同的是方法3沒有醇沉或膜分離。
對比試驗表4
對比試驗表4顯示，從多糖含量來看，醇沉>膜分離>不醇沉，通過化學試劑制備的多糖和膜分離制備的多糖相差不太大；從蛋白質含量來看，不醇沉>醇沉和膜分離，膜分離制備的多糖和化學試劑制備的多糖蛋白質含量接近；從半乳糖醛酸含量來看，不醇沉>醇沉和膜分離，膜分離制備的多糖和化學試劑制備的多糖半乳糖醛酸含量接近。表明沒有任何化學試劑的膜分離制備工藝可行。
從上述對比試驗表4說明，采用本發(fā)明的一種超聲波耦合膜分離分級制備不同分子量枸杞多糖的方法效果好。
本發(fā)明方法獲得的多糖，具有節(jié)能、省時、無污染、綠色、環(huán)保等優(yōu)點，可用用于工業(yè)化生產，膜分離后分級純化的各種分子量的枸杞多糖適用于不同的食品行業(yè)，拓寬了應用范圍，效果明顯。
本實施例沒有詳細敘述的工藝步驟或部件屬本行業(yè)的常用手段或公知結構，這里不一一敘述。