本發(fā)明涉及醫(yī)藥原料生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一種降解含β-1,3-糖苷鍵的大分子量多糖的方法。
背景技術(shù)：
多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)，活性多糖是指某種具有特殊生理活性的多糖化合物，具有調(diào)節(jié)人體生理節(jié)奏的功能。多糖中的單糖以糖苷鍵連接，糖苷鍵包括β-1,4-糖苷鍵，α-1,3-糖苷鍵，β-1,3-糖苷鍵等。
研究表明，多糖的生物活性與其分子量密切相關(guān)，分子量越大，分子體積越大，且溶解性差，隨著分子量的增大，多糖溶液的粘度增高，不利于多糖跨越多重細胞膜障礙進入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學活性。因此，對大分子量多糖進行降解獲得低分子量多糖，使其更好的發(fā)揮生物學活性，具有重要的價值。
現(xiàn)有技術(shù)報道的多糖降解方法有物理降解法、化學降解法和酶降解法。物理降解法如超聲波法，可以把大分子量的多糖降解，但此法對設(shè)備要求較高，無法達到工業(yè)化生產(chǎn)。酶降解法是用專一性的糖苷酶斷開多糖分子中的一個糖苷鍵來達到降解多糖的目的，或用非專一性的其他酶對多糖進行降解。酶降解法反應(yīng)條件溫和，無需加入其他反應(yīng)試劑，且沒有副產(chǎn)物生成，但目前沒有成熟的酶，能夠用于工業(yè)化降解；化學降解法主要包括酸降解法和過氧化氫降解法。酸降解法是利用酸性條件下多糖分子的糖苷鍵水解而造成糖鏈斷裂的方法，一般采用鹽酸，硫酸水解，此外，也有用三氟乙酸，乙酸，氫氟酸等水解多糖，是較為經(jīng)典的降解多糖的方法。但是，酸降解法糖苷鍵斷裂是隨機的，產(chǎn)物分子量分布范圍較廣，對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和活性具有破壞性。過氧化氫降解法需要使用過氧化氫，過氧化氫在貯存和運輸過程中存在著潛在的危險、且降解率低，不適宜工業(yè)化擴大生產(chǎn)。
因此，針對特定的單糖連接方式，如β-1,3-糖苷鍵，提出一種較通用的多糖降解方法很有意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種降解含β-1,3-糖苷鍵的大分子量多糖的方法，該方法能夠很好的克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，具有易于工業(yè)化，降解率高，降解得到的產(chǎn)物分子量范圍分布窄的優(yōu)勢。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種降解含β-1,3-糖苷鍵的大分子量多糖的方法，采用電Fenton法降解，所述電Fenton法的操作為：
將濃度為60-200mg/mL的含β-1,3-糖苷鍵的大分子量多糖溶液通入設(shè)有陰、陽極的電解槽中，調(diào)節(jié)溶液為酸性，按照4.0-8.0L氧氣/L多糖溶液的量向陰極通入氧氣，通入直流電并控制陰極電流密度為9-14mA/cm2，在此條件下，進行降解，收集電解液，即得。
優(yōu)選地，所述含β-1,3-糖苷鍵的大分子量多糖溶液通過如下方法配制而成：用相當于所述多糖重量0.8-2倍重量的乙醇分散所述多糖，然后加入水使多糖相對于水的濃度為60-200mg/mL，即得。
本發(fā)明先將多糖分散在乙醇中，可以形成均勻的多糖懸濁液，然后再加入水，此種情況下，多糖能夠均勻分散在水中，解決了由于多糖分子量大、粘度大造成的溶解度低的問題，極大促進了后續(xù)電解的進行。
采用本發(fā)明的電Fenton法條件對60-200mg/mL濃度范圍內(nèi)的多糖溶液具有良好的降解效果，濃度高于該范圍時，降解率較低，且所得低分子量多糖的平均分子量較該濃度范圍降解得到的產(chǎn)品平均分子量大；濃度低于該范圍時，雖然能夠得到低分子量多糖，但降解效率較低，企業(yè)能耗較大，成本較高。
發(fā)明人進一步研究發(fā)現(xiàn)，pH值對含β-1,3-糖苷鍵的多糖的降解有重要影響，pH值偏高或偏低時，多糖降解率低。當pH為2-4時，降解率較高；當pH為2.5-3.5，尤其為3時，降解效率最高，因此，本發(fā)明優(yōu)選的pH值為2-4，進一步優(yōu)選為2.5-3.5，最優(yōu)選為3。
在生產(chǎn)過程中，可以采用曝氣裝置向電解槽中鼓入氧氣。優(yōu)選地，采用含有至少一個通氣孔的曝氣裝置向所述陰極通入氧氣，通氣孔的數(shù)量依據(jù)電解的規(guī)模而定，即當電解的多糖溶液量大時，可采用多個通氣孔同時鼓入氧氣的方式，電解的多糖溶液少時，可采用較少通氣孔同時鼓入氧氣的方式。多個通氣孔同時鼓氣有助于氧氣均勻分布在陰極極片周圍均勻產(chǎn)生HO·。進一步優(yōu)選地，每個通氣孔中氧氣的通入速度為0.2-1.0L/min(優(yōu)選0.6-0.8L/min，最優(yōu)選0.7L/min)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，用空氣替代氧氣同樣可以實現(xiàn)上述目的，在具體應(yīng)用時，可采用增大空氣通入量的手段達到與通入純氧氣量相同的目的。
優(yōu)選地，在電解時，可在所述多糖溶液中加入電解質(zhì)，加入電解質(zhì)可增加溶液的導(dǎo)電性，有助于電解的順利進行。針對于本發(fā)明60-200mg/mL酸性含β-1,3-糖苷鍵的多糖溶液，優(yōu)選采用硫酸鈉或氯化鈉作為電解質(zhì)，且當電解質(zhì)的濃度為0.01-0.3mol/L(優(yōu)選0.02-0.1mol/L)時，電解效果最佳。
優(yōu)選地，所述陽極材質(zhì)為鐵，所述陰極材質(zhì)為石墨。陰極材質(zhì)進一步優(yōu)選為多孔石墨。
優(yōu)選地，上述電Fenton操作在攪拌條件下進行，攪拌狀態(tài)有助于多糖分子更充分的與HO·接觸，促進降解。攪拌速度優(yōu)選為100-600rpm。
本發(fā)明較佳的電Fenton操作包括如下步驟：
(1)配制多糖溶液：先用相當于所述β-1,3-糖苷鍵的大分子量多糖0.8-2倍重量的乙醇分散多糖，然后加入水使多糖相對于水的濃度為60-200mg/mL，調(diào)節(jié)pH值為2-4，即得；
(2)電解：以鐵為陽極，石墨為陰極，將配制好的多糖溶液加入電解槽中，加入硫酸鈉或氯化鈉，并調(diào)節(jié)其濃度為0.02-0.1mol/L；按照4.0-8.0L氧氣/L多糖溶液的量向陰極通入氧氣，并控制陰極電流密度為9-14mA/cm2，攪拌狀態(tài)下，進行電解，收集電解液，即得。
本發(fā)明所述的方法適用于降解任何含有β-1,3-糖苷鍵的大分子量多糖，尤其對香菇多糖，云芝多糖，或茯苓多糖有極佳的降解效果。其中，香菇多糖具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等作用，云芝多糖具有極強烈的抑制癌細胞活性的功效，茯苓多糖具有免疫增強活性，可用于抗病毒，抗腫瘤，減輕放、化療副作用的功效。因此，得到分子量分布更窄的上述低分子量多糖，對于疾病的預(yù)防和治療具有極大的意義。
本發(fā)明所述的香菇多糖，云芝多糖，或茯苓多糖可采用普通市售產(chǎn)品，或者，可按照現(xiàn)有技術(shù)公開的手段提取得到。一般而言，本發(fā)明所述的電Fenton法條件對多糖的分子量沒有特殊限制，對普通市售產(chǎn)品或按照現(xiàn)有技術(shù)公開手段提取得到的產(chǎn)品具有的分子量均具有良好的降解效果。特別地，本發(fā)明所述的電Fenton法條件對分子量為100-600KDa的多糖具有良好的降解效果，具有降解率高，降解得到的低分子量多糖的分子量分布窄，藥理活性好的特點。更特別地，本發(fā)明所述的方法對分子量為400-600KDa的香菇多糖或云芝多糖，或分子量為100-500KDa的茯苓多糖有極佳的降解效果。
發(fā)明人經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)，針對不同的多糖類型，通過對反應(yīng)條件的進一步優(yōu)化，能夠取得最佳的降解效果。具體而言：
當所述多糖為香菇多糖時，多糖溶液濃度為90-160mg/mL，通入氧氣的量為：4.0-8.0L/L多糖溶液，陰極電流密度為10.0-12.0mA/cm2；
當所述多糖為茯苓多糖時，多糖溶液濃度為80-200mg/mL所述通入氧氣的量為：6.0-8.0L/L多糖溶液，陰極電流密度為12-14mA/cm2；
當所述多糖為云芝多糖時，多糖溶液濃度為110-130mg/mL，所述通入氧氣的量為：6.0-8.0L/L多糖溶液，陰極電流密度為12-14mA/cm2。
本發(fā)明所述的方法還包括從電解液中提取低分子量多糖的步驟，所述“提取”可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，本發(fā)明優(yōu)選采用超濾膜過濾法進行提取，進一步優(yōu)選采用截留分子量10KDa-30KDa的超濾膜超濾所述電解液。超濾過后，收集濃縮液，經(jīng)冷凍干燥，即得。
優(yōu)選地，為了降低損耗，在超濾提取前，首先調(diào)節(jié)電解液為中性。
本發(fā)明針對含β-1,3-糖苷鍵的多糖，通過對其降解方法的摸索，確定了最佳的降解方法，該方法工藝操作簡單，省時高效，有利于擴大規(guī)模生產(chǎn)；且反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境污染??；重要的是，與酸法降解和過氧化氫降解法相比，電Fenton法對多糖的降解率可達23-31％，降解分子量相當?shù)亩嗵堑那闆r下，得到的低分子量多糖的分子量范圍更窄，藥理活性更好。
在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，即得本發(fā)明各較佳實施例。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。涉及到的原料或試劑均為已知物質(zhì)，涉及到的操作如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。
實施例1
一種采用電Fenton法降解香菇多糖的方法：稱取1600g香菇多糖(分子量500KDa)，分散到1.6Kg無水乙醇中，加入到10L蒸餾水中，制成濃度為160mg/ml的糖溶液，裝入體積為30L的電解槽中，稱取85.2g硫酸鈉溶解于多糖溶液中，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至3。以30cm×20cm鐵絲網(wǎng)為陽極，30cm×20cm多孔石墨為陰極，兩極間距離為6cm，通入13V直流電，電流密度為10mA/cm2，并用曝氣裝置以2.0L/min的速度通入凈化空氣(或以0.6L/min的速度通入氧氣，曝氣裝置含兩個通氣孔，兩個通氣孔同時鼓入氧氣)，每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為24L(每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為7.2L)，攪拌器以250rpm的速度攪拌，室溫條件下電解60min后，停止通電通氣，將電解液用1M的氫氧化鈉溶液中和至中性后用截留分子量10KDa-50KDa的超濾膜超濾，收集濃縮液，冷凍干燥，得香菇多糖475.68g，用凝膠排阻色譜法測定平均分子量為27.9KDa，降解率為29.73％。
實施例2
一種采用電Fenton法降解香菇多糖的方法：稱取900g香菇多糖(分子量500KDa)，分散到0.72Kg無水乙醇中，加入到10L蒸餾水中，制成濃度為90mg/ml的糖溶液，裝入體積為30L的電解槽中，稱取71g硫酸鈉溶解于多糖溶液中，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至3。以20cm×20cm鐵絲網(wǎng)為陽極，20cm×20cm多孔石墨為陰極，兩極間距離為5cm，通入13V直流電，電流密度為12mA/cm2，并用曝氣裝置以0.5L/min的速度通入氧氣，曝氣裝置含兩個通氣孔，兩個通氣孔同時鼓入氧氣，每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為4.0L，攪拌器以250rpm的速度攪拌，室溫條件下電解40min后，停止通電通氣，將電解液用1M的氫氧化鈉溶液中和至中性后用截留分子量10KDa-30KDa的超濾膜超濾，收集濃縮液，冷凍干燥，得香菇多糖212.49g，用凝膠排阻色譜法測定平均分子量為18.6KDa，降解率為23.61％。
實施例3
一種采用電Fenton法降解茯苓多糖的方法：稱取2000g茯苓多糖(平均分子量452KDa)，分散到2.4Kg無水乙醇中，加入到10L蒸餾水中，制成濃度為200mg/ml的糖溶液，裝入體積為30L的電解槽中，稱取99.4g硫酸鈉溶解于多糖溶液中，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至3。以30cm×30cm鐵絲網(wǎng)為陽極，30cm×30cm多孔石墨為陰極，兩極間距離為5cm，通入13V直流電，電流密度為14mA/cm2，并用曝氣裝置以0.6L/min的速度通入氧氣，曝氣裝置含兩個通氣孔，兩個通氣孔同時鼓入氧氣，每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為7.2L，攪拌器以250rpm的速度攪拌，室溫條件下電解60min后，停止通電通氣，將電解液用1M的氫氧化鈉溶液中和至中性后用截留分子量10KDa-50KDa的超濾膜超濾，收集濃縮液，冷凍干燥，得茯苓多糖628g，用凝膠排阻色譜法測定平均分子量為32.1KDa，降解率為31.4％。
實施例4
一種采用電Fenton法降解云芝多糖的方法：稱取1800g云芝多糖(平均分子量501KDa)，分散到2.7Kg無水乙醇中，加入到15L蒸餾水中，制成濃度為120mg/ml的糖溶液，裝入體積為24L的電解槽中，稱取127.8g硫酸鈉溶解于多糖溶液中，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至3，以30cm×30cm鐵絲網(wǎng)為陽極，30cm×30cm多孔石墨為陰極，兩極間距離為7cm，通入13V直流電，電流密度為14mA/cm2，并用曝氣裝置以0.6L/min的速度通入氧氣，曝氣裝置含三個通氣孔，三個通氣孔同時鼓入氧氣，每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為6.0L，攪拌器以250rpm的速度攪拌，室溫條件下電解50min后，停止通電通氣，將電解液用1M的氫氧化鈉溶液中和至中性后用截留分子量10KDa-30KDa的超濾膜超濾，收集濃縮液，冷凍干燥，得云芝多糖543.6g，用凝膠排阻色譜法測定平均分子量為19.3KDa，降解率為30.2％。
對比例1酸法降解香菇多糖
稱取香菇多糖225g(分子量500KDa)，分散到225g無水乙醇中，加入到15L蒸餾水中，制成濃度為15mg/ml的糖溶液，用1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至2，室溫條件下攪拌水解3.5h，溶液粘度顯著降低后，用截留分子量10KDa-50KDa的超濾膜超濾，收集濃縮液，冷凍干燥，用凝膠排阻色譜法測定平均分子量。
對比例2過氧化氫法降解香菇多糖
稱取300g香菇多糖(分子量500KDa)，分散到300g無水乙醇中，加入到15L蒸餾水中，制成濃度為20mg/ml的糖溶液，加入66.05g抗壞血酸，過氧化氫45.15ml(密度為1.13g/ml)，硫酸亞鐵104.26g，室溫條件下攪拌反應(yīng)2h，用截留分子量10KDa-50KDa的超濾膜超濾，收集濃縮液，冷凍干燥，用凝膠排阻色譜法測定平均分子量。
對比例3
一種采用電Fenton法降解香菇多糖的方法：稱取200g香菇多糖(分子量500KDa)，分散到200g無水乙醇中，加入到10L蒸餾水中，制成濃度為20mg/ml的糖溶液，裝入體積為30L的電解槽中，稱取85.2g硫酸鈉溶解于多糖溶液中，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至3。以30cm×20cm鐵絲網(wǎng)為陽極，30cm×20cm多孔石墨為陰極，兩極間距離為6cm，通入13V直流電，電流密度為10mA/cm2，并用曝氣裝置以2.0L/min的速度通入凈化空氣(或以0.6L/min的速度通入氧氣，曝氣裝置含兩個通氣孔，兩個通氣孔同時鼓入氧氣)，每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為24L(每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為7.2L)，攪拌器以250rpm的速度攪拌，室溫條件下電解60min后，停止通電通氣，將電解液用1M的氫氧化鈉溶液中和至中性后用截留分子量5000Da的超濾膜超濾，收集濃縮液，冷凍干燥，得香菇多糖11.6g，用凝膠排阻色譜法測定平均分子量為6.7KDa，降解率為5.8％。
對比例4
一種采用電Fenton法降解香菇多糖的方法：稱取1600g香菇多糖(分子量500KDa)，分散到1.6Kg無水乙醇中，加入到10L蒸餾水中，制成濃度為160mg/ml的糖溶液，裝入體積為30L的電解槽中，稱取85.2g硫酸鈉溶解于多糖溶液中，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至5。以30cm×20cm鐵絲網(wǎng)為陽極，30cm×20cm多孔石墨為陰極，兩極間距離為6cm，通入13V直流電，電流密度為10mA/cm2，并用曝氣裝置以2.0L/min的速度通入凈化空氣(或以0.6L/min的速度通入氧氣，曝氣裝置含兩個通氣孔，兩個通氣孔同時鼓入氧氣)，每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為24L(每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為7.2L)，攪拌器以250rpm的速度攪拌，室溫條件下電解60min后，停止通電通氣，將電解液用1M的氫氧化鈉溶液中和至中性后用截留分子量10KDa-50KDa的超濾膜超濾，收集濃縮液，冷凍干燥，得香菇多糖29.44g，用凝膠排阻色譜法測定平均分子量為48.9KDa，降解率為1.84％。
對比例5
一種采用電Fenton法降解香菇多糖的方法：稱取1600g香菇多糖(分子量500KDa)，分散到1.6Kg無水乙醇中，加入到10L蒸餾水中，制成濃度為160mg/ml的糖溶液，裝入體積為30L的電解槽中，稱取85.2g硫酸鈉溶解于多糖溶液中，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至3。以30cm×20cm鐵絲網(wǎng)為陽極，30cm×20cm多孔石墨為陰極，兩極間距離為6cm，通入13V直流電，電流密度為10mA/cm2，并用曝氣裝置以0.6L/min的速度通入氧氣(曝氣裝置含一個通氣孔)，每升粗香菇多糖溶液通入空氣的量約為3.6L，攪拌器以250rpm的速度攪拌，室溫條件下電解60min后，停止通電通氣，將電解液用1M的氫氧化鈉溶液中和至中性后用截留分子量10KDa-50KDa的超濾膜超濾，收集濃縮液，冷凍干燥，得香菇多糖412.8g，用凝膠排阻色譜法測定平均分子量為38.3KDa，降解率為25.8％。
將實施例1-4，對比例1-5的結(jié)果如表1所示：
表1：實施例1-4，對比例1-5的結(jié)果數(shù)據(jù)對比
降解率(％)＝(低分子量多糖/多糖重量)×100
從上述結(jié)果可以看出：相對于酸法降解和過氧化氫法降解，本發(fā)明所得的多糖降解率高，平均分子量低，且用時較短，有更好的工業(yè)應(yīng)用價值。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。