專(zhuān)利名稱(chēng)：硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和應(yīng)用的制作方法
硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)城
本發(fā)明屬于硒化多糖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和在制備 抗癌藥物、抗氧化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多糖類(lèi)是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外又一類(lèi)重要的生物大分子，具有抗感染、免疫促進(jìn)、 腫瘤防治、病毒性肝炎、類(lèi)風(fēng)濕癥、艾滋病等免疫損傷或免疫缺損癥和抗氧化等多方面功能 和生物活性。影響多糖生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)因素包括多糖的主鏈性質(zhì)、支鏈性質(zhì)和多糖分子的 髙級(jí)結(jié)構(gòu),其中多糖主鏈的糖單元組成、糖苷鍵類(lèi)型均直接決定多糖的活性，多糖支鏈的類(lèi)型、 聚合度、支鏈在多糖鏈上的分布及其取代度決定了多糖的活性大小，多糖分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)如鏈 的柔韌性和空間構(gòu)像與多糖的活性緊密相關(guān)。為提高多糖的生物活性，多糖的分子修飾和結(jié)構(gòu) 改造具有重要意義。近年來(lái)，有關(guān)多糖的分子修飾研究已大有進(jìn)展。利用糖殘基上的羥基、羧 基、氨基等基團(tuán)運(yùn)用化學(xué)方法進(jìn)行修飾,有可能提高多糖的活性。修飾的方法很多，有硫酸化、 羧甲基化、硒化、甲基化、氧化、部分水解、磷酸酯化、雙基團(tuán)衍生化等。
硫酸化多糖也稱(chēng)多糖硫酸酯或多糖硫酸酯，是指糖羥基上帶有硫酸根的多糖，是抗病毒多 糖中研究最多的一類(lèi)天然或化學(xué)修飾多糖,包括從動(dòng)植物中提取的各種硫酸多糖、肝素、天然 中性多糖的硫酸衍生物及人工合成、半合成的各種硫酸多糖，如硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖、硫 酸木聚糖、硫酸香菇多糖、巖藻依聚糖、卡拉膠硫酸軟骨素等。硫酸多糖因具有廣泛的生物 學(xué)性質(zhì)，包括抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病、對(duì)免疫系統(tǒng)作用和抗凝活性,而受到極大關(guān)注。
硒元素是生命活動(dòng)的必需元素,其存在形式有無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒兩種，常見(jiàn)的無(wú)機(jī)硒有亞硒 酸鈉和硒酸鈉，有機(jī)硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能構(gòu)成若干氧化酶的活性中心，可增強(qiáng)機(jī)體 的抗氧化能力和對(duì)相關(guān)疾病的.抵抗能力，這說(shuō)明了硒與人體健康的直接關(guān)系。多糖具有多種生 理功能,與抗衰老、防治癌癥等密切有關(guān)。無(wú)機(jī)硒具有蓄積性毒性和致突變作用，使用時(shí)劑量 難以控制，而有機(jī)硒的毒性低，副作用小，不但能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反應(yīng) 上比無(wú)機(jī)硒顯著，因此，將無(wú)機(jī)硒與多糖有機(jī)結(jié)合使之轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒化合物硒多糖，將會(huì)使硒 和多糖的生理和藥理功能得到優(yōu)化。
硒多糖硫酸酯是利用多糖硫酸酯將其中部分硫用硒取代而半合成的有機(jī)硒化合物，由我 國(guó)首次合成。研究發(fā)現(xiàn)，它可提高血液谷胱甘肽過(guò)氧物酶的活力、血紅蛋白的含量、紅細(xì)胞對(duì)
HA,的穩(wěn)定性及抗自由基的能力，還發(fā)現(xiàn)它能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。有關(guān)硒的抗癌、防癌作用 的研究也已有報(bào)道。
隨著生活水平的提高，各個(gè)保健食品公司、醫(yī)藥公司fF發(fā)的富硒食品、富硒藥品己成為
了熱潮。近年來(lái)關(guān)于富硒的產(chǎn)品和專(zhuān)利也出現(xiàn)了許多。如公開(kāi)號(hào)CN1038454A，硒化卡拉膠 的制法。該方法是以硒粉為原料，用硝酸將其溶解制備成濃度為0.5-1.0mg/ml的硒液，在 將其加入到濃度為0. 5-5。％的卡拉膠中，再加入Kappa-角叉菜膠或Lambda角叉菜膠溶膠溶液， 進(jìn)行硒化反應(yīng)，在經(jīng)過(guò)乙醇沉析后得到粗品硒化卡拉膠。該方法制備的硒化卡拉膠，硒含量 較低，并且在制備方法上使用硒粉和濃硝酸可以生成如硒化氫等有毒的負(fù)產(chǎn)物。專(zhuān)利公開(kāi)號(hào) CN1069495，專(zhuān)利名稱(chēng)為硒多糖其制造方法。該方法通過(guò)發(fā)酵制備富硒酵母，再經(jīng)過(guò)分離提取, 加堿勻漿、中和、濃縮、乙醇沉淀等制成。該方法制備繁瑣，得到的硒含量也很低。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和在制備 抗癌藥物、抗氧化藥物中的應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。
本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下
—種硒化多糖硫酸酯化合物，其特征在于硒化多糖硫酸酯化合物包含吡喃型糖單元， 其結(jié)構(gòu)式為
CH廣Re
R廣R4、 Re至少有一個(gè)為亞硒酸酯基及其鹽，和
R廣R4、 Re相同或者不同，是羥基、亞硒酸酯基及其鹽、硫酸酯基及其鹽或者糖苷鍵中 的一種
或者/和包含呋喃型糖單元，其結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 5</formula>
R廣Re至少有一個(gè)為亞硒酸酯基及其鹽，和
R廣Re相同或者不同，是羥基、亞硒酸酯基及其鹽、硫酸酯基及其鹽或者糖苷鍵中的一種。
硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是本質(zhì)上由多糖硫酸酯和硒化試劑反應(yīng)制備。
所述的硒化試劑是亞硒酸及其鹽；硒化試劑與多糖硫酸酯中的硫酸酯基團(tuán)的摩爾比是1-0.1-10。
所述的硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是包括下列步驟-
(1) 硒化反應(yīng)將多糖硫酸酯與亞硒酸或其鹽在酸性溶液中經(jīng)鋇離子的催化作用下，并
加熱10-100X:，恒溫反應(yīng)1-100小時(shí)，該反應(yīng)是在糖單元上的取代反應(yīng)，或在3， 6-內(nèi)醚-D 一半乳糖單元上的加成反應(yīng)，而生成多糖硫酸酯化合物；反應(yīng)完畢，降溫至室溫；
(2) 除去Ba&離子將反應(yīng)液逐步滴加硫酸溶液，使反應(yīng)液中的Ba&離子成為硫酸鋇
沉淀；
(3) 除去未反應(yīng)的亞硒酸根離子濾去沉淀，取濾液，再加入氯化鐵溶液，調(diào)節(jié)pH值 3-12,攪拌，反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)濾沉淀，取濾液；
(4) 乙醇沉淀濾液用15M的醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH3—9，按反應(yīng)液的1-5倍體積量加入 95%乙醇，過(guò)濾，然后依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇洗滌濾出物，將濾出物干燥；
(5) 按需要精制成硒化多糖硫酸酯精品。 硒化多糖硫酸酯化合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。 硒化多糖硫酸酷化合物在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明具有的有益效果如下
1) 本發(fā)明在催化劑鋇離子和氯離子、硝酸根的作用下，亞硒酸與在糖單元硫酸根發(fā)生取 代反應(yīng)，而生成本發(fā)明的硒化多糖硫酸酯，產(chǎn)品得率和質(zhì)量均比其它的方法高。
2) 利用本發(fā)明的硒化多糖硫酸酯的制法，制備的硒化多糖硫酸酯，其最高硒含量可達(dá) 45%。然而目前有文獻(xiàn)報(bào)道的最髙硒含量為12.5%。
3) 本發(fā)明制備硒化多糖硫酸酯的技術(shù)與其它的方法相比，避免了硒粉和硝酸反應(yīng)這一有 劇毒物產(chǎn)生的操作，而以亞硒酸這一穩(wěn)定性的化合物作為硒化劑，用氯化鋇和硝酸作為催化 劑，操作對(duì)人體無(wú)害。
4) 在分子結(jié)構(gòu)中引入亞硒酸根，其中硒是正四價(jià)，硒是處于中間價(jià)態(tài)，既可以被氧化也 可以被還原，因此本發(fā)明的硒化多糖硫酸酯在人體內(nèi)具有廣泛的生理功能。
具體實(shí)H^r式
實(shí)施例1MTT法體外檢測(cè)硒化多糖硫酸酯抗癌藥敏試驗(yàn)
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用含10。/。胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋為2.0 X 106個(gè)mL-l， 接種于96孔板中，每孔IOO ^L，之后依次加入待測(cè)藥物、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組，并保 留僅加培養(yǎng)基的空白組。隨后在37C、 5% C02的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24h，然后每孔加入5 mg'mL-l的MTT溶液10 ，連續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清液，每孔加入DMSO 100 jiL,在
570nrn波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)吸收度(A)值。用下面的公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，并利用公式 T/C(%)=100 X A明tt/A糊做回歸計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)抑制率-(A s自一A維)/ A空白
各濃度對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞S180、 H22及人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖均有顯著的抑制作用， 且呈良好的量效關(guān)系。
實(shí)施例2抗氧化活性研究
1. 對(duì)CV的清除作用
含有硒化多糖硫酸酯(lmg"inL")pH8.2的Tris—HC1緩沖液于25"C溫育20分鐘后，加入 0.1mohl^連苯三酚的10mmol"L"鹽酸溶液，快速搖勻，于25X:測(cè)定319nm處的吸收度，持 續(xù)測(cè)定Ap。
不加硒化多糖硫酸酯，同上操作處理，測(cè)定其對(duì)比吸光值A(chǔ)s。測(cè)試表明吸光度Ap相對(duì) 比吸光值A(chǔ)s減少。
結(jié)果表明確化多糖硫酸酯能有效地清除活性氧。
2. 對(duì)羥自由基的清除作用和保護(hù)DNA的作用
采用Fenton體系，取0.2mLF eS04-EDTA混合液(10mmol，I^)于試管中，加人0.5m L的 DNA(10mmohi;1)，然后加硒化多糖硫酸酯(lmgrmi;1)，用磷酸緩沖液(pH 7.4,0.1 mol，L")定容 至1.8ML,再加人0.2mLH2O2(10mmohi;10, 混合后置于37"恒溫水浴中反應(yīng)lh,然后加 人2.8%(質(zhì)量百分比)三氯乙酸溶液1.0 ML， 1.0。/。(質(zhì)量百分比)硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0 ML,混勻后置沸水浴反應(yīng)15min，冷卻后用在波長(zhǎng)532 nm處測(cè)吸光度Ap。
不加硒化多糖硫酸酯，同上操作處理，測(cè)定其對(duì)比吸光值A(chǔ)s。測(cè)試表明吸光度Ap則相 對(duì)比吸光值A(chǔ)s減少。
結(jié)果表明硒化多糖硫酸酯能有效地清除羥自由基，對(duì)DNA鏈具有良好的保護(hù)作用。
實(shí)施例3多糖硫酸酯的化學(xué)合成。
在&保護(hù)下，lg多糖加入到150 mL四氫呋喃'(N,N-dimethylfor腿ide， DMF)中，室 溫下攪拌14 h。 N2保護(hù)下，邊攪拌便加入三氧化硫 吡啶(三氧化硫，吡啶與多糖中的羥基 基團(tuán)的摩爾比是10: 1),然后在40匸反應(yīng)10h。用500ml甲醇處理并攪拌1小時(shí)，制備 出粗制多糖硫酸酯吡啶鹽。用裝有吸引器的燒結(jié)玻璃漏斗濾過(guò)，并不斷用甲醇洗至濾液變?yōu)?無(wú)色，空氣中干燥。將粗制的多糖硫酸酯吡啶鹽溶于30%醋酸鈉溶液6.5ml中再加入雙蒸 水7ml，將吡啶鹽置換成鈉鹽。然后將鹽溶液緩慢加入100ml無(wú)水甲醇中，磁力攪拌1小 時(shí)，使產(chǎn)物沉淀。濾過(guò)收集，用乙醇不斷洗滌，空氣中千燥，得產(chǎn)品。所得多糖硫酸酯為全 取代(多糖中的羥基全部被硫酸酯基團(tuán)取代)。 實(shí)施例4 將l,5g卡拉膠(含硫12~13%)溶于含有1%亞砥酸的硝酸溶液中，加熱至40° C,在攪 拌下，滴加20%氯化鋇，恒溫反應(yīng)72小時(shí)。反應(yīng)液降至室溫，滴加硫酸使沉淀完全，抽濾。 用15%醋酸鈉溶液調(diào)pH為7，再用酒精沉淀，抽濾，烘干。產(chǎn)品透析精制。制得含硒18% 的硒化多糖。 實(shí)施例5
在攪拌下，滴加209^氯^鋇，恒溫^應(yīng) 00小時(shí)。反2液降至室溫，滴加硫酸使沉淀完全， 抽濾。用15%醋酸鈉溶液調(diào)pH為7，再用酒精沉淀，抽濾，烘干。產(chǎn)品透析精制。制得含 硒36%的硒化糊精。
實(shí)施例6
將2g全取代的右旋糖酑硫酸酯(含硫24%)溶于含有1%亞硒酸的硝酸溶液中，加熱至 50° C，在攪拌下，滴加205^氯化鋇，恒溫反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)液降至室溫，滴加硫酸使沉淀 完全，抽濾。用15%醋酸鈉溶液調(diào)pH為7，再用酒精沉淀，抽濾，烘干。產(chǎn)品透析精制。 制得含硒45。^的硒化右旋糖酐。
實(shí)施例7
將2g全取代的葡聚糖硫酸酯(含硫24%，分子量為10000)溶于含有1%亞硒酸的硝酸 溶液中，加熱至50° C,在攪拌下，滴加20%氯化鋇，恒溫反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)液降至室溫， 滴加硫酸使沉淀完全，抽濾。用15%醋酸鈉溶液調(diào)pH為7,再用酒精沉淀，抽濾，烘干。 產(chǎn)品透析精制。制得含硒45%的硒化葡聚糖。 實(shí)施例8
將2g全取代的淀粉硫酸酯(含硫24%,分子量為20000)溶于含有1%亞硒酸的硝酸溶 液中，加熱至25° C，在攪拌下，滴加10%氯化鋇15mL,恒溫反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)液降至室溫， 滴加硫酸使沉淀完全，抽濾。用15%醋酸鈉溶液調(diào)pH為7，再用酒精沉淀，抽濾，烘干。 產(chǎn)品透析精制。制得含硒19.2%含硫13.1%的硒化淀粉硫酸酯。
權(quán)利要求
1.一種硒化多糖硫酸酯化合物，其特征在于硒化多糖硫酸酯化合物包含吡喃型糖單元，其結(jié)構(gòu)式為R1～R4、R6至少有一個(gè)為亞硒酸酯基及其鹽，和R1～R4、R6相同或者不同，是羥基、亞硒酸酯基及其鹽、硫酸酯基及其鹽或者糖苷鍵中的一種；或者/和包含呋喃型糖單元，其結(jié)構(gòu)式為R1～R6至少有一個(gè)為亞硒酸酯基及其鹽，和R1～R6相同或者不同，是羥基、亞硒酸酯基及其鹽、硫酸酯基及其鹽或者糖苷鍵中的一種。
2. 硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是本質(zhì)上由多糖硫酸酯和硒化試劑反應(yīng)制備。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是硒化試劑是亞硒酸及其鹽
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是硒化試劑與多糖硫酸 酯中的硫酸酯基團(tuán)的摩爾比是l: 0.1-10。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的硒化多糖硫酸酯化合物的制法，其特征是包括下列歩驟(1) 硒化反應(yīng)將多糖硫酸酯與亞硒酸或其鹽在酸性溶液中經(jīng)鋇離子的催化作用下，并加熱10-10(TC，恒溫反應(yīng)1-100小時(shí)，該反應(yīng)是在糖單元上的取代反應(yīng)，或在3， 6-內(nèi)醚-D—半乳糖單元上的加成反應(yīng)，而生成多糖硫酸酯化合物；反應(yīng)完畢，降溫至室溫；(2) 除去Ba^離子將反應(yīng)液逐歩滴加硫酸溶液，使反應(yīng)液中的Ba^離子成為硫酸鋇 沉淀；(3) 除去未反應(yīng)的亞硒酸根離子濾去沉淀，取濾液，再加入氯化鐵溶液，調(diào)節(jié)pH值 3-12，攪拌，反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)濾沉淀，取濾液；(4) 乙醇沉淀濾液用15X的醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH3 — 9，按反應(yīng)液的1-5倍體積量加入 95%乙醇，過(guò)濾，然后依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇洗滌濾出物，將濾出物干燥；(5) 按需要精制成硒化多糖硫酸酯精品。
6. 硒化多糖硫酸酯化合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
7. 硒化多糖硫酸酯化合物在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
硒化多糖硫酸酯化合物及其制法和應(yīng)用，屬于硒化多糖技術(shù)領(lǐng)域，其特征在于硒化多糖硫酸酯化合物包含吡喃型糖單元或者/和包含呋喃型糖單元，其制備方法采用多糖硫酸酯和硒化試劑反應(yīng)，硒化試劑是亞硒酸及其鹽，硒化試劑與多糖硫酸酯中的硫酸酯基團(tuán)的摩爾比是1∶0.1-10。本發(fā)明化合物在制備抗癌藥物和抗氧化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的亞硒酸與在糖單元硫酸根發(fā)生取代反應(yīng)，而生成本發(fā)明的硒化多糖硫酸酯，因此產(chǎn)品的得率和質(zhì)量均比其它的方法高，本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是硒含量高最高硒含量可達(dá)45％遠(yuǎn)高于目前有文獻(xiàn)報(bào)道的最高為12.5％硒含量。
文檔編號(hào)A61K31/717GK101104643SQ20061004548
公開(kāi)日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2006年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日
發(fā)明者陳藝新 申請(qǐng)人:陳藝新