專利名稱：多糖亞硒酸酯的制法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于硒化多糖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多糖亞硒酸酯的制法及其應用。
背景技術(shù)：
多糖類是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外又一類重要的生物大分子，具有抗感染、免疫促進、 腫瘤防治、病毒性肝炎、類風濕癥、艾滋病等免疫損傷或免疫缺損癥和抗氧化等多方面功能 和生物活性。影響多糖生物學活性的結(jié)構(gòu)因素包括多糖的主鏈性質(zhì)、支鏈性質(zhì)和多糖分子的 高級結(jié)構(gòu)，其中多糖主鏈的糖單元組成、糖苷鍵類型均直接決定多糖的活性，多糖支鏈的類 型、聚合度、支鏈在多糖鏈上的分布及其取代度決定了多糖的活性大小，多糖分子的高級結(jié) 構(gòu)如鏈的柔韌性和空間構(gòu)像與多糖的活性緊密相關(guān)。為提高多糖的生物活性，多糖的分子修 飾和結(jié)構(gòu)改造具有重要意義。近年來，有關(guān)多糖的分子修飾研究已大有進展。利用糖殘基上 的羥基、羧基、氨基等基團運用化學方法進行修飾，有可能提高多糖的活性。修飾的方法很 多，有硫酸化、羧甲基化、硒化、甲基化、氧化、部分水解、磷酸酯化、雙基團衍生化等。
硒元素是生命活動的必需元素，其存在形式有無機硒和有機硒兩種，常見的無機硒有亞 硒酸鈉和硒酸鈉，有機硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能構(gòu)成若干氧化酶的活性中心，可增強 機體的抗氧化能力和對相關(guān)疾病的抵抗能力，這說明了硒與人體健康的直接關(guān)系。多糖具有 多種生理功能，與抗衰老、防治癌癥等密切有關(guān)。無機硒具有蓄積性毒性和致突變作用，使 用時劑量難以控制，而有機硒的毒性低，副作用小，不但能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在 激發(fā)免疫反應上比無機硒顯著，因此，將無機硒與多糖有機結(jié)合使之轉(zhuǎn)化為有機硒化合物硒 多糖，將會使硒和多糖的生理和藥理功能得到優(yōu)化。
隨著生活水平的提高，各個保健食品公司、醫(yī)藥公司開發(fā)的富硒食品、富硒藥品己成為 了熱潮。近年來關(guān)于富硒的產(chǎn)品和專利也出現(xiàn)了許多。如公開號CN1038454A，硒化卡拉膠 的制法。該方法是以硒粉為原料，用硝酸將其溶解制備成濃度為0.5-l.Omg/ml的硒液，在 將其加入到濃度為0.5-5%的卡拉膠中，再加入Kappa-角叉菜膠或Lambda角叉菜膠溶膠溶液， 進行硒化反應，在經(jīng)過乙醇沉析后得到粗品硒化卡拉膠。該方法制備的硒化卡拉膠，硒含量 較低，并且在制備方法上使用硒粉和濃硝酸可以生成如硒化氫等有毒的負產(chǎn)物。專利公開號 CN1069495，專利名稱為硒多糖其制造方法。該方法通過發(fā)酵制備富硒酵母，再經(jīng)過分離提 取，加堿勻漿、中和、濃縮、乙醇沉淀等制成。該方法制備繁瑣，得到的硒含量也很低。而 多糖亞硒酸酯的制備是通過亞硒酸根取代多糖硫酸酯的硫酸酯基團實現(xiàn)(CN1288899A)，導 致多糖亞硒酸酯的硒含量除了受反應條件限制，還受多糖硫酸酯的硫酸酯基團含量控制，導 致這一方法制備多糖亞硒酸酯的硒含量偏低，其最大硒含量為12.5%

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供了一種多糖亞硒酸酯的制法，將硒化試劑與在糖 單元的羥基直接發(fā)生反應，而不用通過取代硫酸酯基團，制備的多糖亞硒酸酯的最高硒含量 可達45%。
本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下
一種多糖亞硒酸酯的制法，其特征是本質(zhì)上由多糖或糖復合物和硒化試劑反應制得。
所述的硒化試劑為鹵氧化硒，化學式為SeOX2， X為氟、氯、溴中的一種；或者硒化 試劑為含有鹵氧硒結(jié)構(gòu)的化合物，化學式為一SeOX， X為氟、氯、溴中的一種；硒化試劑 與多糖中羥基基團的投料摩爾比為l: 0.1-20。
所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是，包括下列步驟
(1) 硒化反應將多糖、硒化試劑加入吡啶中，在—15-11(TC下，反應0.1-100小時，
然后加入水，反應液自然升溫/降溫至室溫；
(2) 沉淀按反應液的1-10倍體積量將沉淀劑加入反應液，攪拌，過濾，然后用沉淀
劑洗滌濾出物，將濾出物干燥；將濾出物溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為7~8，再加入 沉淀劑，過濾，然后用沉淀劑洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥；沉淀劑是乙醇、甲醇、丙酮中的一 種或其中幾種的任意比例混合物；
(3) 按需要精制成多糖亞硒酸酯精品，將(2)中的產(chǎn)物溶解，透析，按需要精制成各種 的多糖亞硒酸酯精品。
反應可以加入催化劑，催化劑是亞硒酸酯，化學式為ROSeOOR2， R， R2為H，或 Crdo烷基；催化劑與多糖中羥基基團的投料重量比為1: 0.0001-10。
所述的多糖亞硒酸酯，其特征是物化性質(zhì)如下
(1) 溶解性能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機溶劑；
(2) 平均含硒量含硒量為0.1-45%;
(3) 光譜①紫外光譜在波長255nm附近處有特征吸收峰；
②紅外光譜在波長900cm"左右有中強度的伸縮振動特征吸收峰。 多糖亞硒酸酯在制備抗癌藥物中的應用。 多糖亞硒酸酯在制備抗氧化藥物中的應用。 本發(fā)明具有的有益效果在于
1)本發(fā)明制備的多糖亞硒酸酯化合物的技術(shù)與其它的方法相比，不再通過亞硒酸根取代 多糖硫酸酯的硫酸酯基團，本發(fā)明的硒化試劑與糖單元的羥基發(fā)生反應，生成多糖亞硒酸酯，
產(chǎn)品得率和質(zhì)量均比其它的方法高。
2) 利用本發(fā)明的多糖亞硒酸酯的制法，制備的多糖亞硒酸酯多糖，其最高硒含量可達 45%。然而目前有文獻報道硒化多糖的最高硒含量為12.5%。
3) 在分子結(jié)構(gòu)中引入亞硒酸根，其中硒是正四價，硒是處于中間價態(tài)，既可以被氧化也 可以被還原，因此本發(fā)明的多糖亞硒酸酯在人體內(nèi)具有廣泛的生理功能。
具體實施例方式
實施例1 MTT法體外檢測多糖亞硒酸酯抗癌藥敏試驗
對數(shù)生長期細胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋為2. 0 X 106個nnL-l， 接種于96孔板中，每孔IOO pL，之后依次加入待測藥物、陰性對照組、陽性對照組，并保 留僅加培養(yǎng)基的空白組。隨后在37°C、 5% C02的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24h，然后每孔加入5 mg mL-l的MTT溶液10 ，連續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清液，每孔加入DMSO 100 ^L，在 570nm波長處用酶標儀測吸收度(A)值。用下面的公式計算細胞增殖抑制率，并利用公式 T/C(%)=100 X A陰性/A樣品做回歸計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)抑制率^A空自一A給藥)/ A空白
各濃度對小鼠腫瘤細胞S180、 H22及人肝癌細胞株HepG2的增殖均有顯著的抑制作用，且呈良好的 量效關(guān)系。
實施例2 抗氧化活性研究
1. 對02*的清除作用
含有多糖亞硒酸酯(lmg iri^)pH8.2的Tris—HCl緩沖液于25°C溫育20分鐘后，加入 0.1mol'I^連苯三酚的10mmol'I^鹽酸溶液，快速搖勻，于25。C測定319nm處的吸收度，持 續(xù)測定Ap。
不加多糖亞硒酸酯，同上操作處理，測定其對比吸光值A(chǔ)s。測試表明吸光度Ap相對比 吸光值A(chǔ)s減少。 ' '
結(jié)果表明多糖亞硒酸酯能有效地清除活性氧。
2. 對羥自由基的清除作用和保護DNA的作用
采用Fenton體系，取0.2mLF eS04-EDTA混合液(10mmo卜L")于試管中，加人0.5m L的 DNA(10mmol'i:1)，然后加多糖亞硒酸酯(0.8mg"mU1)，用磷酸緩沖液(pH 7.4， 0.1 mol'L"使容 至1.8M L，再加人0.2mLH2O2(10mmo卜L"')， 混合后置于37'C恒溫水浴中反應lh，然后加 人2.8%(質(zhì)量百分比)三氯乙酸溶液1.0 ML, 1.0。/。(質(zhì)量百分比)硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0 ML，混勻后置沸水浴反應15min，冷卻后用在波長532 nm處測吸光度Ap。
不加多糖亞硒酸酯，同上操作處理，測定其對比吸光值A(chǔ)s。測試表明吸光度Ap則相對 比吸光值A(chǔ)s減少。
結(jié)果表明多糖亞硒酸酯能有效地清除羥自由基，對DNA鏈具有良好的保護作用。 實施例3 糊精亞硒酸酯
在攪拌下，將lg糊精、0.1gCH30SeOOC2Hs和25g氟氧化硒(SeOF2)加入吡啶中，加 熱到100° C，反應24小時，加入水。反應液降至室溫，按反應液的3倍體積量將乙醇加入 反應液，攪拌；過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將濾出物干燥；將濾出物溶解，用NaOH溶 液調(diào)節(jié)溶液pH為7-8，再加入乙醇，過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥。產(chǎn)品透析 精制。制得含硒45 %的糊精亞硒酸酯。
實施例4 右旋糖酑亞硒酸酯
在-2° C攪拌下，將2g右旋糖酐、和25g氟氧化硒(SeOF2)加入吡啶中，加熱到100° C， 反應90小時，加入水。反應液升至室溫，按反應液的3倍體積量將乙醇加入反應液，攪拌； 過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將濾出物干燥；將濾出物溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH 為7~8，再加入乙醇，過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥。產(chǎn)品透析精制。制得含 硒40%的右旋糖酐亞硒酸酯。
實施例5 阿(拉伯)糖基木聚糖亞硒酸酯
阿(拉伯)糖基木聚糖含有吡喃型和呋喃型兩種糖單元，在攪拌下，將2g阿(拉伯)糖基木 聚糖、0.1gCH3OSeOOC2Hs和50g氯氧化硒(SeOCl2)加入吡啶中，反應30小時，加入水。 反應液升至室溫，按反應液的3倍體積量將乙醇加入反應液，攪拌；過濾，然后用乙醇洗滌 濾出物，將濾出物干燥；將濾出物溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為7~8，再加入乙醇， 過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥。產(chǎn)品透析精制。制得含硒39%的阿(拉伯)糖基 木聚糠亞硒酸酯。 .
權(quán)利要求
1.一種多糖亞硒酸酯的制法，其特征是本質(zhì)上由多糖或糖復合物和硒化試劑反應制得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是硒化試劑為鹵氧化硒，化學式 為SeOX2， X為氟、氯、溴中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是硒化試劑為含有鹵氧硒結(jié)構(gòu)的 化合物，化學式為一SeOX， X為氟、氯、溴中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是硒化試劑與多糖中羥基基團的 投料摩爾比為1: 0.1-20。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是，包括下列步驟(1) 硒化反應將多糖、硒化試劑加入吡啶中，在-i5-iicrc下，反應o.i-ioo小時，然后加入水，反應液自然升溫/降溫至室溫；(2) 沉淀按反應液的1-10倍體積量將沉淀劑加入反應液，攪拌，過濾，然后用沉淀劑洗滌濾出物，將濾出物千燥；將濾出物溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為7~8，再加入沉淀劑，過濾，然后用沉淀劑洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥；沉淀劑是乙醇、甲醇、丙酮中的一 種或其中幾種的任意比例混合物；(3) 按需要精制成多糖亞硒酸酯精品，將(2)中的產(chǎn)物溶解，透析，按需要精制成各種的多糖亞硒酸酯精品。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是反應可以加入催化劑，催化劑 是亞硒酸酯，化學式為F^OSeOOR2， R!， R2為H，或d-do烷基；催化劑與多糖中羥基 基團的投料重量比為h 0.0001-10。
7. 權(quán)利要求1的一種多糖亞硒酸酯，其特征是物化性質(zhì)如下(1) 溶解性能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機溶劑；(2) 平均含硒量含硒量為0.1-45%;(3) 光譜①紫外光譜在波長255nm附近處有特征吸收峰；②紅外光譜在波長900cm—1左右有中強度的伸縮振動特征吸收峰。
8. 多糖亞硒酸酯在制備抗癌藥物中的應用。
9. 多糖亞硒酸酯在制備抗氧化藥物中的應用。
全文摘要
一種多糖亞硒酸酯的制法及其應用，屬于硒化多糖技術(shù)領(lǐng)域，其特征是本質(zhì)上由多糖或糖復合物和硒化試劑反應制得；硒化試劑為鹵氧化硒或者含有鹵氧硒結(jié)構(gòu)的化合物；硒化試劑與多糖中羥基基團的投料摩爾比為1∶0.1-20。本發(fā)明還包括多糖亞硒酸酯在制備抗癌藥物和抗氧化藥物中的應用。本發(fā)明不再通過亞硒酸根取代多糖硫酸酯的硫酸酯基團，而是硒化試劑與糖單元的羥基發(fā)生反應，生成多糖亞硒酸酯，產(chǎn)品得率和質(zhì)量均比其它的方法高，含硒量也遠大于現(xiàn)有技術(shù)。
文檔編號A61P35/00GK101104644SQ20061004548
公開日2008年1月16日 申請日期2006年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日
發(fā)明者陳藝新 申請人:陳藝新