本發(fā)明屬于植物提取多糖的方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種莼菜多糖的提取與分離純化工藝。
背景技術(shù)：
莼菜(Brasenia schreber J.F.Gme1)系原始花被亞綱睡蓮科(Nymphaeaceae)莼屬多年生淡水水生草本植物，又名馬蹄草、湖菜、水葵、露葵，原產(chǎn)于我國東南地區(qū)，生長于池塘、湖泊和沼澤中。莼菜具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，，據(jù)《本草綱目》記載，莼菜具有消渴熱痹、治熱疸、厚腸胃、安下焦、逐水、解百毒等功效。研究表明，莼菜多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、消炎抑菌、改善便秘和增進(jìn)食欲的作用，具有較高的保健價(jià)值。國外莼菜多糖價(jià)格昂貴，國際市場售價(jià)已達(dá)到3000美元/千克。
但目前關(guān)于莼菜多糖提取方面的研究極少，現(xiàn)階段提取方法大致有超聲波、微波和復(fù)合酶預(yù)處理后，再進(jìn)行熱水浸提；常溫NaOH提取后用堿性蛋白酶去除蛋白。但由于莼菜多糖粘度大，難過濾、難濃縮、難純化，故熱水浸提法和NaOH提取法提取率較低，NaOH提取又存在強(qiáng)堿使用的安全性問題。并且這些方法提取產(chǎn)量低，利用率低，極大制約了莼菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
所以研究一種高效的莼菜多糖的提取與分離純化技術(shù)對(duì)于莼菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展是至關(guān)重要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種莼菜多糖的提取與分離純化工藝。其提取率高，效果好，克服了熱水浸提法和NaOH提取法提取率較低，NaOH提取又存在強(qiáng)堿使用的安全性問題。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，具體提供了如下的技術(shù)方案：
一種莼菜多糖的提取與分離純化工藝，包括如下步驟：
(1)莼菜多糖粗品的提?。?/p>
(1.1)將莼菜粉碎至100～200目，將粉碎后的莼菜放至超臨界CO2萃取釜中，封釜，排除空氣，通入攜帶劑進(jìn)行萃取得提取液，萃取溫度為44.0-45.5℃，萃取壓力為20.5-21.5MPa，萃取二氧化碳流量為20-28L/h，攜帶劑為蒸餾水，用量為400-450ml/kg，萃取4-5h；
(1.2)向提取液中加入氯仿與正丁醇的混合液并搖勻，在3000～5000r/min離心5～10min，取上層清液I，所述混合液中氯仿與正丁醇的體積比為4:1，所述提取液與混合液的的體積比為4～5:1；
(1.3)用NaOH調(diào)節(jié)上層清液至pH為7.5-8.5，然后向清液中加入活性炭進(jìn)行脫色并抽濾得濾液；將濾液進(jìn)一步使用蒸餾水透析36-48h得透析液；
(1.4)將透析液3000-5000r/min離心5-10min得上層清液II，將上層清液II在75℃-80℃水浴條件下濃縮至原體積的1/3-1/4，再加入3-4倍體積的95wt％乙醇，攪拌均勻后，3000-5000r/min離心5-10min得沉淀I，將沉淀I分別用無水乙醇和丙酮洗滌，干燥得莼菜多糖粗品；
(2)莼菜多糖粗品的純化
(2.1)以質(zhì)量體積比1％-2％取莼菜多糖粗品及蒸餾水并混合均勻，3000-5000r/min離心5-10min除去不溶物，取上清液用1mol/L NaOH調(diào)pH至8.6-9.2，加入0.1wt％的堿性蛋白酶，46℃-50℃酶解4-5h除蛋白，8000-10000r/min離心8-10min得上層清液III；
(2.2)向上層清液III加十六烷基三甲基溴化銨至沉淀完全，靜置5h，3000-5000r/min離心5-10min的沉淀II，將沉淀II用冰水洗滌三次，向沉淀II加NaCl溶液52-57℃解離3-4h，并在3000-5000r/min離心5-10min得上層清液IV；
(2.3)將上層清液IV通過處理好的312弱酸型陰離子交換樹脂柱吸附，然后將樹脂移入燒杯中，冰水洗至澄清止，再上柱，用0.5mol/L Na2HPO4-0.3mol/L Na2SO4洗脫液洗脫，流速1ml/min，得洗脫液；
(2.4)洗脫液使用蒸餾水透析12h，透析液80℃水浴濃縮，加三倍體積的95％乙醇，攪拌均勻后，3000r/min離心10min，沉淀再分別用無水乙醇和丙酮洗滌，真空干燥得莼菜多糖。
優(yōu)選的，所述步驟(1.1)萃取溫度45.2℃，萃取壓力21.3MPa，攜帶劑為蒸餾水，用量為420.0ml/kg，萃取4.0h。
本發(fā)明的有益效果在于：
1、本發(fā)明利用超臨界CO2萃取技術(shù)，克服了熱水浸提法和NaOH提取法提取率較低的缺點(diǎn)，并且也不存在NaOH提取強(qiáng)堿使用的安全性問題。
2、本發(fā)明對(duì)莼菜多糖粗品純化時(shí)，采用堿性蛋白酶處理除去蛋白質(zhì)；十六烷基三甲基溴化銨能與莼菜多糖形成季胺鹽絡(luò)合物，這些絡(luò)合物在低離子強(qiáng)度的水溶液中不溶，在離子強(qiáng)度大時(shí)，絡(luò)合物可以解離、溶解，分離純化效果更好。
3、使用312弱酸型陰離子交換樹脂層析，可以去除一些帶正電的雜質(zhì)，分離純化效果更佳。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
以下實(shí)施例所用試劑及器材：透析袋(Sigma)、312弱酸型陰離子交換樹脂(羅門哈斯)，堿性蛋白酶(碧云天)、常規(guī)化學(xué)試劑均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。
實(shí)施例1
(1)莼菜多糖粗品的提取：
(1.1)將莼菜粉碎至100～200目，將粉碎后的莼菜放至超臨界CO2萃取釜中，封釜，排除空氣，通入攜帶劑進(jìn)行萃取得提取液，萃取溫度為45.2℃，萃取壓力為21.3MPa，萃取二氧化碳流量為25L/h，攜帶劑為蒸餾水，用量為420ml/kg，萃取4h；
(1.2)向提取液中加入氯仿與正丁醇的混合液并搖勻，在3000r/min離心10min，取上層清液I，所述混合液中氯仿與正丁醇的體積比為4:1，所述提取液與混合液的的體積比為4:1；
(1.3)用NaOH調(diào)節(jié)上層清液至pH為8.0，然后向清液中加入活性炭進(jìn)行脫色并抽濾得濾液；將濾液進(jìn)一步使用蒸餾水透析48h得透析液；
(1.4)將透析液3000r/min離心10min得上層清液II，將上層清液II在80℃水浴條件下濃縮至原體積的1/3，再加入3倍體積的95wt％乙醇，攪拌均勻后，3000r/min離心10min得沉淀I，將沉淀I分別用無水乙醇和丙酮洗滌，干燥得莼菜多糖粗品；
(2)莼菜多糖粗品的純化
(2.1)以質(zhì)量體積比1％取莼菜多糖粗品及蒸餾水并混合均勻，3000r/min離心10min除去不溶物，取上清液用1mol/L NaOH調(diào)pH至9.0，加入0.1wt％的堿性蛋白酶，50℃酶解5h除蛋白，8000r/min離心10min得上層清液III；
(2.2)向上層清液III加十六烷基三甲基溴化銨至沉淀完全，靜置5h，3000r/min離心10min的沉淀II，將沉淀II用冰水洗滌三次，向沉淀II加100ml 2mol/L NaCl溶液55℃解離4h，3000r/min離心10min得上層清液IV；
(2.3)將上層清液IV通過處理好的312弱酸型陰離子交換樹脂柱吸附，然后將樹脂移入燒杯中，冰水洗至澄清止，再上柱，用0.5mol/L Na2HPO4-0.3mol/L Na2SO4洗脫液洗脫，流速1ml/min，得洗脫液；
(2.4)洗脫液使用蒸餾水透析12h，透析液80℃水浴濃縮，加三倍體積的95％乙醇，攪拌均勻后，3000r/min離心10min，沉淀再分別用無水乙醇和丙酮洗滌，真空干燥得莼菜多糖。
多糖含量的測(cè)定
多糖含量采用硫酸-苯酚法進(jìn)行檢測(cè)。多糖在濃硫酸的作用下，脫水生成糖醛及其衍生物，與苯酚結(jié)合后產(chǎn)生黃色物質(zhì)，該物質(zhì)在490nm有最大吸光值，吸光值的大小與多糖含量呈正比。
(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：
稱取一定量的葡萄糖于105℃烘干至恒重后，準(zhǔn)確稱取0.100g，純水定容至100mL，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL儲(chǔ)備液，分別置于100mL容量瓶以純水定容，配制成0，20，40，60，80，100μg/mL待測(cè)液。準(zhǔn)確吸取1.0mL待測(cè)液于試管中，依次加入1mL 6％苯酚，5mL濃硫酸，混勻，室溫靜置30min。另取一只試管，準(zhǔn)確吸取1.0mL純水，依次加入1mL6％苯酚，5mL濃硫酸，混勻，室溫靜置30min，作為空白對(duì)照。490nm處測(cè)吸光值，以吸光度對(duì)葡萄糖濃度進(jìn)行回歸，得到回歸方程y＝0.0101x-0.0191，R2＝0.9841。式中：y為在波長490nm處的吸光值，x為葡萄糖的濃度.(μg/mL)。
以總糖浸出率來評(píng)價(jià)多糖得率，總糖含量按以下公式計(jì)算：
總糖含量％＝(m’×V×N)/(Vs×m×106)×100％，式中：
m’：標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的葡萄糖含量，μg；
V：樣液體積，mL；
N：稀釋倍數(shù)；
Vs：測(cè)定時(shí)吸取樣液的體積，mL；
m：樣品的質(zhì)量，g。
將莼菜多糖提取液定容至250mL容量瓶，準(zhǔn)確吸取1.0mL于10mL容量瓶中，以純水定容。混勻后準(zhǔn)確吸取1.0mL待測(cè)液于試管中，依次加入1mL新鮮配制的6％苯酚，5mL濃硫酸混勻，室溫靜置30min。另取一只試管，準(zhǔn)確吸取1.0mL純水，依次加入1mL6％苯酚，5ml濃硫酸，混勻，室溫靜置30min，作為空白對(duì)照，于490nm處測(cè)定吸光值。
經(jīng)含量測(cè)定，莼菜中的莼菜多糖提取率達(dá)到85.2％，純度達(dá)到80.5％。
本發(fā)明利用超臨界CO2萃取技術(shù)，克服了熱水浸提法和NaOH提取法提取率較低的缺點(diǎn)，并且也不存在NaOH提取強(qiáng)堿使用的安全性問題。本發(fā)明對(duì)莼菜多糖粗品純化時(shí)，采用堿性蛋白酶處理除去蛋白質(zhì)；十六烷基三甲基溴化銨能與莼菜多糖形成季胺鹽絡(luò)合物，這些絡(luò)合物在低離子強(qiáng)度的水溶液中不溶，在離子強(qiáng)度大時(shí)，絡(luò)合物可以解離、溶解，分離純化效果更好。使用312弱酸型陰離子交換樹脂層析，可以去除一些帶正電的雜質(zhì)，分離純化效果更佳。并且使用本發(fā)明所述方法提取出來的莼菜多糖其提取效率高，純度好。
最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。