本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的一種肝素鈉專用酶制劑的篩選工藝。

背景技術(shù)：

肝素鈉是從豬小腸粘膜中提取的一種生化藥品，是手術(shù)中不可替代的、挽救生命的、市場不能斷檔的首選藥物。自二十世紀四十年代用于臨床以來，其應(yīng)用范圍不斷擴大，尤其是二十世紀九十年代以來，該產(chǎn)品臨床主要用于防止血栓形成，治療心血管病、血液病、尿毒癥等。西方國家已開始研究肝素鈉對癌癥的防治作用，其新用途不斷增加。

進入二十世紀七十年代以來，我國肝素鈉生產(chǎn)工藝不斷改進，成為世界肝素鈉產(chǎn)量最大的國家。國際市場的肝素鈉產(chǎn)品有70％以上來自中國。肝素鈉精品生產(chǎn)已由高錳酸鉀氧化法發(fā)展到雙氧水氧化法，結(jié)合醇洗分離法，將大量的雜質(zhì)用乙醇帶走。2008年2月11日，美國因注射肝素鈉出現(xiàn)4例死亡，350多例不良反應(yīng)，成為轟動世界的“肝素鈉事件”。因此美國藥監(jiān)局每年都對肝素鈉的標準提升，明年將肝素鈉分子量的標準提升。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種酶解法分解肝素鈉中的高分量的方法，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種酶解法分解肝素鈉中的高分子量的方法，其特征在于：調(diào)節(jié)胰蛋白酶和胃蛋白酶的用量以及分次時間將肝素鈉中的大分子量肝素鈉分解在發(fā)明的技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征：所述方法包括如下步驟：

一、提取

1、粗品溶解：

開啟水閥，加入飲用水，再將肝素鈉粗品加入到反應(yīng)罐中，邊攪邊加，按原料與飲用水1：(6-7)比例溶解，攪拌5-10小時至全部溶解。

2、酶解：

將上一步溶解液，先用鹽酸溶液調(diào)ph7.0-8.0，升溫至50-55℃之間時加入胃蛋白酶5-12g／億單位，再加入10-20g／億單位胰酶，50-55℃保溫4小時，4小時后，再加胃蛋白酶3-5g／億單位，同時加入5-12g／億單位的胰蛋白酶，50℃繼續(xù)保溫4小時；

3、急升溫：

將上一步酶解液在30～40分鐘內(nèi)升溫至85-90℃，靜止10-30分鐘，開攪拌，通入循環(huán)水降溫，待溫度降至50-55℃時，用2-6mol／l氫氧化鈉溶液調(diào)ph10.0-12.0，靜止分層20-30小時。

4、底部沉淀的雜質(zhì)離心：虹吸上清，用40-100目濾袋過濾，過濾后的溶液分為上清液和下層沉淀，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機離心，離心后留上層離心液；

二、精制

1、第一次沉淀：

待上述上清液和離心液溫度降至20-30℃，加入20-30g／l氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸將濾液調(diào)ph10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時。

2、第一次氧化：棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)ph10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時。

3、第二次沉淀：溶液加入20-30g／l氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸溶液調(diào)將溶液ph6.0-7.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時。

4、第二次氧化：棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)ph10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時。

5、第三次沉淀：溶液加入20-30g／l氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)ph10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時。

6、第三次氧化：棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)ph10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時。

7、第四次沉淀：上一步溶液若有沉淀物析出，則用離心機離心，沒有析出則直接加入20-30g／l氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)ph6.0-7.0，將溶液放冷庫中冷凍至-10℃--5℃，邊攪邊加-10℃--5℃的丙酮，使得丙酮占溶液的質(zhì)量百分含量為40-45％，-5℃-0℃保溫24-30小時，然后將廢丙酮棄去，留底部沉淀物用純化水溶解，溶液再加入20-30g／l氯化鈉，用鹽酸溶液調(diào)將溶液ph6.0-7.0，邊攪邊加乙醇，使乙醇濃度在20℃時為45-50％，沉淀10-12小時。

8、將沉淀物用純化水按2-5l／億單位溶解后，用孔徑0.22-0.3微米濾膜板框機微濾，用乙醇沉淀，使乙醇濃度達75-80％，再加入23-26％的氯化鈉溶液，每1升溶液加6-10ml氯化鈉溶液，靜止沉淀10-12小時。

9、將上層乙醇棄去，加入無水乙醇脫水，邊攪邊加，使乙醇濃度為97-99％，靜止24-30小時，棄去上層乙醇，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通過管道和過濾瓶把剩余乙醇抽干，待干燥。

10、將抽干的產(chǎn)品均勻放置在不銹鋼盤中，放在真空干燥箱中抽真空，用循環(huán)水加溫，溫度35-60℃，烘干70-80小時。

11、包裝：將產(chǎn)品取出，稱重，使每包裝袋5kg，用封口機封口，放在鋁桶中待驗。

在發(fā)明的技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征：

[1)、第四次沉淀后的溶液進行qa取樣化驗，測吸光度：260nm＜0.1；400nm＜0.02。

2)、分子量在15000-19000道爾頓之間，并且8000-16000道爾頓的分子量比例與16000-24000道爾頓之間分子量比例的比值不小于1.0。

3)、肝素鈉精品收率達到90％以上。

4)、xa效價與iia效價比值為0.9-1.1。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步的說明：

實施例

二、提取

1、粗品溶解：

開啟水閥，加入飲用水，再將肝素鈉粗品加入到反應(yīng)罐中，邊攪邊加，按原料與飲用水1：(6-7)比例溶解，攪拌5-10小時至全部溶解。

2、酶解：

將上一步溶解液，先用鹽酸溶液調(diào)ph7.0-8.0，升溫至50-55℃之間時加入胃蛋白酶5-12g／億單位，再加入10-20g／億單位胰酶，50-55℃保溫4小時，4小時后，再加胃蛋白酶3-5g／億單位，同時加入5-12g／億單位的胰蛋白酶，50℃繼續(xù)保溫4小時；

3、急升溫：

將上一步酶解液在30～40分鐘內(nèi)升溫至85-90℃，靜止10-30分鐘，開攪拌，通入循環(huán)水降溫，待溫度降至50-55℃時，用2-6mol／l氫氧化鈉溶液調(diào)ph10.0-12.0，靜止分層20-30小時。

4、底部沉淀的雜質(zhì)離心：虹吸上清，用40-100目濾袋過濾，過濾后的溶液分為上清液和下層沉淀，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機離心，離心后留上層離心液。

二、精制

1、第一次沉淀：

待上述上清液和離心液溫度降至20-30℃，加入20-30g／l氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸將濾液調(diào)ph10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在

20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時。

2、第一次氧化：棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)ph10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時。

3、第二次沉淀：溶液加入20-30g／l氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸溶液調(diào)將溶液ph6.0-7.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀10-12小時。

4、第二次氧化：棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)ph10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時。

5、第三次沉淀：溶液加入20-30g／l氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)ph10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95～97％的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20℃時達到45～50％，沉淀

10-12小時。

6、第三次氧化：棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)ph10.0-12.0，然后加入體積3-5％雙氧水，氧化10-12小時。

7、第四次沉淀：上一步溶液若有沉淀物析出，則用離心機離心，沒有析出則直接加入20-30g／l氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)ph6.0-7.0，將溶液放冷庫中冷凍至-10℃--5℃，邊攪邊加-10℃--5℃的丙酮，使得丙酮占溶液的質(zhì)量百分含量為40-45％，-5℃-0℃保溫24-30小時，然后將廢丙酮棄去，留底部沉淀物用純化水溶解，溶液再加入20-30g／l氯化鈉，用鹽酸溶液調(diào)將溶液ph6.0-7.0，邊攪邊加乙醇，使乙醇濃度在

20℃時為45-50％，沉淀10-12小時。

8、將沉淀物用純化水按2-5l／億單位溶解后，用孔徑0.22-0.3微米濾膜板框機微濾，用乙醇沉淀，使乙醇濃度達75-80％，再加入23-26％的氯化鈉溶液，每1升溶液加6-10ml氯化鈉溶液，靜止沉淀10-12小時。

9、將上層乙醇棄去，加入無水乙醇脫水，邊攪邊加，使乙醇濃度為97-99％，靜止24-30小時，棄去上層乙醇，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通過管道和過濾瓶把剩余乙醇抽干，待干燥.

10、將抽干的產(chǎn)品均勻放置在不銹鋼盤中，放在真空干燥箱中抽真空，用循環(huán)水加

溫，溫度35-60℃，烘干70-80小時。

11、包裝：將產(chǎn)品取出，稱重，使每包裝袋5kg，用封口機封口，放在鋁桶中待驗。

在發(fā)明的技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征：

[1)、第四次沉淀后的溶液進行qa取樣化驗，測吸光度：260nm＜0.1；400nm＜0.02。

2)、分子量在15000-19000道爾頓之間，并且8000-16000道爾頓的分子量比例與16000-24000道爾頓之間分子量比例的比值不小于1.0。

3)、肝素鈉精品收率達到90％以上。

4)、xa效價與iia效價比值為0.9-1.1。