本發(fā)明涉及一種特異性抗人pcsk9的抗體及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：高膽固醇血癥，特別是低密度脂蛋白膽固醇的升高，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)血脂異常，尤其是低密度脂蛋白膽固醇（ldl-c）持續(xù)偏高是誘發(fā)和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，與缺血性心腦血管疾病密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅著人類健康。目前臨床上廣泛應(yīng)用的降脂藥物是他汀類藥物（statins）。他汀類藥物主要通過(guò)抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶（hmg-coa）還原酶的活性，抑制細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，致使細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇合成減少，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞表面低密度膽固醇受體的數(shù)量和活性，增加血清中膽固醇的清除數(shù)量，進(jìn)而降低總膽固醇的水平。但是，他汀類藥物會(huì)引起肝臟酶異常，導(dǎo)致橫紋肌溶解，且臨床上存在著部分他汀類藥物不耐受的患者。因此，開(kāi)發(fā)他汀類藥物以外的新型的降脂藥物具有重要的意義。近年來(lái)，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，pcsk9）蛋白逐漸成為了治療高膽固醇血癥的重要靶點(diǎn)。pcsk9是2003年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)基因，它屬于哺乳動(dòng)物前蛋白轉(zhuǎn)化酶（pc）枯草溶菌素蛋白家族。人類pcsk9基因定位于染色體1p32.3，全長(zhǎng)為29kb，由12個(gè)外顯子構(gòu)成，編碼區(qū)約為2kb，編碼包含692個(gè)氨基酸殘基的pcsk9酶原，其結(jié)構(gòu)可分為信號(hào)肽、前結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域四個(gè)部分。pcsk9在肝臟、腎臟、腦組織以及空回腸等多種組織中有表達(dá)。pcsk9的作用靶標(biāo)是低密度脂蛋白受體（lowdensitylipoproteinreceptor，ldlr）。pcsk9合成分泌后與細(xì)胞膜上的ldlr結(jié)合并內(nèi)吞，再進(jìn)入溶酶體ldlr被降解，pcsk9正是通過(guò)在蛋白水平降解肝細(xì)胞表面ldlr，調(diào)節(jié)血漿低密度脂蛋白膽固醇（low-densitylipoproteincholesterol，ldl-c）水平，致使肝臟血脂清除能力下降，從而導(dǎo)致了高膽固醇血癥。研究發(fā)現(xiàn)，pcsk9存在兩種突變，即功能獲得型突變和功能缺失型突變，這兩種突變均與脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)。pcsk9功能獲得型突變，降解ldlr的功能增強(qiáng)，ldlr減少，血液中l(wèi)dl被清除的功能減弱，ldl-c水平升高，導(dǎo)致高膽固醇血癥。pcsk9部分選擇性錯(cuò)義突變屬于此類突變。pcsk9功能缺失型突變可導(dǎo)致肝細(xì)胞ldlr增多、血液中的ldl攝取、降解增加，導(dǎo)致低膽固醇血癥。功能缺失型突變可導(dǎo)致pcsk9蛋白自我裂解和分泌障礙，使得ldl-c降低80％～90％。靶向pcsk9的治療機(jī)理主要是通過(guò)pcsk9抗體與血漿中的pcsk9結(jié)合后阻止pcsk9與ldl受體特異性結(jié)合，進(jìn)而增加了肝細(xì)胞表面ldlr的水平，提升了肝臟血脂清除能力。例如，安進(jìn)公司的repatha和賽諾菲與再生元聯(lián)合研發(fā)的praluent已于2016年上市，并且顯示出良好的治療效果。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然希望能夠開(kāi)發(fā)出全人源的高親和力的靶向pcsk9的抗體。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明一方面提供了一種特異性抗人pcsk9的抗體，所述抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有第一氨基酸序列或與所述第一氨基酸序列有85%以上的序列同源性的序列；其中，所述第一氨基酸序列包含如seqidno.2所示的重鏈可變區(qū)的cdr1序列、如seqidno.3所示的重鏈可變區(qū)的cdr2序列以及如seqidno.4所示的重鏈可變區(qū)的cdr3序列；所述輕鏈可變區(qū)具有第二氨基酸序列或與所述第二氨基酸序列有85%以上的序列同源性的序列；其中，所述第二氨基酸序列包含如seqidno.6所示的輕鏈可變區(qū)的cdr1序列、如seqidno.7所示的輕鏈可變區(qū)的cdr2序列以及如seqidno.8所示的輕鏈可變區(qū)的cdr3序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一氨基酸序列如seqidno.1所示，并且所述第二氨基酸序列的序列如seqidno.5。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)的序列如seqidno.1所示，并且并且所述輕鏈可變區(qū)的序列如seqidno.5所示?？蛇x的，所述重鏈可變區(qū)的序列如seqidno.9所示，并且并且所述輕鏈可變區(qū)的序列如seqidno.10所示；可選的，所述重鏈可變區(qū)的序列如seqidno.11所示序列，并且所述輕鏈可變區(qū)的序列如seqidno.12；可選的，所述重鏈可變區(qū)的序列如seqidno.13所示序列，并且所述輕鏈可變區(qū)的序列如seqidno.14；可選的，所述重鏈可變區(qū)的序列如seqidno.15所示序列，并且所述輕鏈可變區(qū)的序列如seqidno.16。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述特異性抗人pcsk9的抗體為單克隆抗體。本發(fā)明另一方面提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如上述的特異性抗人pcsk9的抗體和藥用載體。本發(fā)明還一方面提供了上述的特異性抗人pcsk9的抗體在制備脂類代謝疾病的藥物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的特異性抗人pcsk9的抗體在制備用于阻斷pcsk9/ldlr相互作用的藥物、降低低密度脂蛋白膽固醇濃度的藥物中的用途。本發(fā)明還一方面提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含如上述的特異性抗人pcsk9的抗體。本發(fā)明還一方面提供了上述的特異性抗人pcsk9的抗體在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測(cè)人pcsk9在樣品中的存在或其水平。關(guān)于本發(fā)明申請(qǐng)文件中術(shù)語(yǔ)的定義：術(shù)語(yǔ)“pcsk9”，也稱前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9），是指人pcsk9抗原，其氨基酸序列包括pcsk9蛋白的全長(zhǎng)（人源np_777596.21，可以從ncbi網(wǎng)站獲取）；還包括其融合短板，例如其與小鼠或人igg的fc蛋白片段（mfc或hfc）進(jìn)行融合的片段。基于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，在pcsk9蛋白的氨基酸序列中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異（包括但不限于置換、缺失和/或添加），而不影響其生物學(xué)功能。關(guān)于人pcsk9抗原多肽序列（野生型）；在本申請(qǐng)文件中，人pcsk9抗原是指ncbi網(wǎng)站所示多肽或其片段，以及相關(guān)多肽，包括但不限于等位基因變體、剪接變體、衍生變體、取代變體、缺失變體和/或插入變體，包括添加n端蛋氨酸、融合多肽等。在某些實(shí)施方案中，人pcsk9抗原多肽包含諸如前導(dǎo)序列殘基、靶向殘基、氨基酸蛋氨酸殘基、賴氨酸殘基、標(biāo)簽殘基和/或融合蛋白殘基。術(shù)語(yǔ)“特異性抗人pcsk9的抗體”是指能以非共價(jià)的、可逆地，并且以特異的方式結(jié)合上述人pcsk9抗原多肽的免疫球蛋白的多肽。示例性的抗體單一包含四聚體，每一個(gè)四聚體由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，每一對(duì)具有通過(guò)二硫鍵連接的一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈。每一個(gè)重鏈或輕鏈都包含其cdr（互補(bǔ)決定區(qū)或者互補(bǔ)決定域）和構(gòu)架區(qū)。每一個(gè)重鏈或輕鏈中都存在三個(gè)cdr（cdr1、cdr2和cdr3，從n端到c端順次編碼），其構(gòu)成了抗體鏈的約15%-20%的可變區(qū)。重鏈和輕鏈的cdr在結(jié)構(gòu)上與靶多肽（pcsk9抗原）的表位互補(bǔ)，因此重鏈和輕鏈的cdr主要負(fù)責(zé)抗體與pcsk9抗原的結(jié)合特異性，剩余的構(gòu)架區(qū)在氨基酸序列方面表現(xiàn)出較少的變化。關(guān)于“序列同源性”的百分比，是通過(guò)確定兩個(gè)序列中存在的相同核酸堿基或氨基酸殘基的數(shù)目來(lái)產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中位置總數(shù)，將結(jié)構(gòu)乘以100從而產(chǎn)生序列的同一性百分比。關(guān)于“脂類代謝疾病”，是指與正常人相比血脂異常，血清中的膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白中的一種或多種升高，和/或血清中的高密度脂蛋白降低。本發(fā)明的發(fā)明人采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選到本發(fā)明的特異性抗人pcsk9的抗體，可以有效阻斷阻斷人pcsk9與ldlr蛋白的結(jié)合，逆轉(zhuǎn)人pcsk9蛋白對(duì)ldl吸收的抑制作用，與現(xiàn)有的抗人pcsk9抗體相比，具有更長(zhǎng)的體內(nèi)藥效作用時(shí)間。附圖說(shuō)明圖1為抗體8f5與人pcsk9抗體的結(jié)合能力檢測(cè)結(jié)果圖；圖2為抗體8f5與猴pcsk9抗體的結(jié)合能力檢測(cè)結(jié)果圖；圖3為抗體8f5與鼠pcsk9抗體的結(jié)合能力檢測(cè)結(jié)果圖；圖4為抗體8f5阻斷人pcsk9與ldlr的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖5為抗體8f5防止hepg2細(xì)胞上ldlr的減量調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖6為抗體8f5與現(xiàn)有技術(shù)原研藥對(duì)體內(nèi)ldl-c濃度的影響的對(duì)比結(jié)果圖。具體實(shí)施方式以下將結(jié)合附圖所示的具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但這些實(shí)施方式并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)這些實(shí)施方式所做出的結(jié)構(gòu)、方法、或功能上的變換均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)?，F(xiàn)在將參考附圖更全面地描述示例實(shí)施方式。然而，示例實(shí)施方式能夠以多種形式實(shí)施，且不應(yīng)被理解為限于在此闡述的實(shí)施方式；相反，提供這些實(shí)施方式使得本發(fā)明將全面和完整，并將示例實(shí)施方式的構(gòu)思全面地傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。下面實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件（例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社）或按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，發(fā)明人采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選到五個(gè)特異性抗人pcsk9的單克隆抗體，具體過(guò)程如下。1）抗人pcsk9單鏈抗體的生物淘選首先使用生物素化的hupcsk9單鏈抗體（np_777569.2）作為全人源抗體庫(kù)的淘選抗原。用封閉緩沖液（pbst/5%脫脂奶粉）室溫預(yù)封閉噬菌體抗體2h，噬菌體的投入量為10^12。然后加入10μg的抗原，室溫孵育1h。孵育后加入50μl的預(yù)封閉的dynabeads?m-280streptavidin磁珠，室溫孵育30min。先用pbst洗去未結(jié)合在磁珠上的噬菌體，再用0.1m的hcl-glycine洗脫結(jié)合在磁珠上的噬菌體，之后用tris-hcl中和洗脫液。取部分洗脫下的噬菌體侵染處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的大腸桿菌tg1，然后制備噬菌體用于下一輪淘選。逐漸增加每一輪的篩選強(qiáng)度，富集度達(dá)到100倍以上時(shí)，終止淘選。2）采用phageelisa篩選抗pcsk9單鏈抗體的陽(yáng)性克隆挑選四輪淘選后的噬菌體侵染的tg1單克隆，接種于96孔板中，培養(yǎng)基為2yt/2%glucose/（100μg/mlampicilline）。37℃/250rpm過(guò)夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后加入m13ko7輔助噬菌體，37℃靜止侵染1h。4000rpm離心15min，使用2yt/（100μg/mlampicilline）/（70μg/mlkanamycin）培養(yǎng)基30℃過(guò)夜培養(yǎng)。離心去噬菌體上清液進(jìn)行elisa鑒定克隆。用0.5μg/ml的pcsk9抗原包被costar-9018酶標(biāo)板，3%bsa4℃封閉過(guò)夜，加入噬菌體上清液4℃孵育2h。洗去未結(jié)合的噬菌體后加入m13bacteriophage抗體(hrp)，4℃孵育1h。洗滌后加入tmb顯色液顯色，用2mhcl終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于45nm讀數(shù)，選擇od450>1.5克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)序列進(jìn)行g(shù)ermline分析和ptms位點(diǎn)分析，排除有潛在開(kāi)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的分子后共得到了如下5個(gè)scfv單鏈抗體?？谷藀csk9單鏈抗體1（也標(biāo)注為抗體8f5）抗體8f5的重鏈可變區(qū)序列如seqidno.1所示，其中重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.2，seqidno.3和seqidno.4?？贵w8f5的輕鏈可變區(qū)序列如seqidno.5所示，其中輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.6，seqidno.7和seqidno.8。抗人pcsk9單鏈抗體2（也標(biāo)注為抗體3d1）抗體3d1的重鏈可變區(qū)序列如seqidno.9所示，其中重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.27，seqidno.28和seqidno.29?？贵w3d1的輕鏈可變區(qū)序列如seqidno.10所示，其中輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.30，seqidno.31和seqidno.32。抗人pcsk9單鏈抗體3（也標(biāo)注為抗體7c4）抗體7c4的重鏈可變區(qū)序列如seqidno.11所示，其中重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.33，seqidno.34和seqidno.35?？贵w7c4的輕鏈可變區(qū)序列如seqidno.12所示，其中輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.36，seqidno.37和seqidno.38?？谷藀csk9單鏈抗體4（也標(biāo)注為抗體5c2）抗體5c2的重鏈可變區(qū)序列如seqidno.13所示，其中重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.39，seqidno.40和seqidno.41。抗體5c2的輕鏈可變區(qū)序列如seqidno.14所示，其中輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.42，seqidno.43和seqidno.44?？谷藀csk9單鏈抗體5（也標(biāo)注為抗體4e9）抗體4e9的重鏈可變區(qū)序列如seqidno.15所示，其中重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.45，seqidno.46和seqidno.47。抗體4e9的輕鏈可變區(qū)序列如seqidno.16所示，其中輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為seqidno.48，seqidno.49和seqidno.50。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了抗人pcsk9抗體的構(gòu)建和表達(dá)過(guò)程，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將上述的篩選出的抗人pcsk9單鏈抗體1-5的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因分別構(gòu)建到含有人輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)（igg1）的載體上，共轉(zhuǎn)染cho-k1細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)一周后高速離心收集上清，上清上樣至proteing親和介質(zhì)預(yù)裝柱，用ph2.7甘氨酸-鹽酸洗脫液洗脫下蛋白后用ph8.5tris-hcl中和。中和后的樣品加入50kda超濾濃縮管換液至pbs。關(guān)于上述抗人pcsk9單鏈抗體1-5的基因序列：上述抗體8f5的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.17所示，上述抗體8f5的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.18所示；上述抗體3d1的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.19所示，上述抗體3d1的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.20所示；上述抗體7c4的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.21所示，上述抗體7c4的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.22所示；上述抗體5c2的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.23所示，上述抗體5c2的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.24所示；上述抗體4e9的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.25所示，上述抗體4e9的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno.26所示。下面以抗體8f5為例，測(cè)定本發(fā)明的抗人pcsk9抗體與pcsk9抗原的親和力。人、猴和鼠pcsk9蛋白的包被濃度依次為0.5μg/ml、0.25μg/ml和0.5μg/ml，100μl每孔，4℃過(guò)夜。用3%bsa室溫封閉2h后加入不同稀釋梯度的抗pcsk9抗體（抗體自30μg/ml開(kāi)始稀釋，3倍梯度稀釋，共9個(gè)梯度），室溫孵育2h。洗去未結(jié)合的抗pcsk9抗體，加入goatanti-humaniggfc(hrp)抗體，室溫孵育1h。洗滌后加入tmb顯色液顯色，用2mhcl終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于45nm讀數(shù)，結(jié)果參見(jiàn)圖1至圖3，從圖中結(jié)果可以看出，抗體8f5與人、猴、鼠pcsk9蛋白的結(jié)合能力良好,并呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。下面以抗體8f5為例，采用elisa實(shí)驗(yàn)測(cè)定本發(fā)明的抗人pcsk9抗體是否能夠阻斷人pcsk9與ldlr的結(jié)合。ldlr蛋白的包被濃度為0.2μg/ml，100μl每孔，4℃過(guò)夜。用3%bsa室溫封閉2h。將不同稀釋梯度的抗pcsk9抗體與0.5μg/ml的pcsk9.biotin室溫孵育0.5h，然后加入到包被ldlr的酶標(biāo)板中，室溫孵育1h。pbst洗滌后加入anti-streptavidin(hrp)抗體，室溫孵育1h。洗滌后加入tmb顯色液顯色，用2mhcl終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于45nm讀數(shù)，結(jié)果參見(jiàn)圖4，從圖4中可以看出，8f5抗體可以有效的阻斷人pcsk9蛋白與ldlr的結(jié)合。下面以抗體8f5為例，測(cè)定本發(fā)明的抗人pcsk9抗體與人pcsk9抗原結(jié)合的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。使用表面等離子共振技術(shù)（spr）測(cè)定抗體8f5對(duì)人pcsk9抗原的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力。將待測(cè)抗體通過(guò)氨基偶聯(lián)法耦合固定于研究級(jí)別的cm5生物傳感器芯片，人pcsk9抗原的濃度以2倍濃度梯度的變化（200nm，100nm，50nm，25nm，12.5nm，6.25nm）流經(jīng)固定相表面，測(cè)定抗體的親和力，結(jié)果如表1所示：表1抗體名稱抗原ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)抗體8f5人pcsk9-his56862.585e-54.546e-9從表1的內(nèi)容可以看出，抗體8f5與人pcsk9蛋白親和力的kd值為4.546e-9，達(dá)到了nmol級(jí)。下面以抗體8f5為例，檢測(cè)抗體8f5對(duì)ldl的攝入的作用。為確定抗體8f5對(duì)肝細(xì)胞上ldlr對(duì)ldl吸收作用的調(diào)節(jié)，將人肝癌細(xì)胞細(xì)胞系hepg2按照1×10^5/孔的密度接種到已加入含有dmem培養(yǎng)基的96板中，37℃5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24小時(shí)。吸出上清，加入含有1%fbs的dmem培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，將10ug/ml人pcsk9蛋白和以濃度范圍從100ug/ml3倍稀釋，共稀釋6個(gè)梯度的8f5抗體加入到培養(yǎng)hepg2細(xì)胞的96孔板中，37℃孵育2小時(shí)。加入100ng熒光標(biāo)記的ldl后，將細(xì)胞37℃孵育4小時(shí)，吸出上清，用pbs清洗2遍后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)96孔板中樣品的熒光強(qiáng)度。如圖5結(jié)果顯示，抗體8f5可以有效的阻止人pcsk9與ldlr的結(jié)合，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)人pcsk9蛋白對(duì)ldl吸收的抑制作用。下面以抗體8f5為例，檢測(cè)抗體8f5對(duì)體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇（ldl-c）濃度的影響。將8只tc>4.8mmol/l,ldl-c>1.5mmol/l的高血脂恒河猴隨機(jī)分為兩組，a組和e組。其中a組注射抗人pcsk9抗體8f5，e組注射原研藥repatha（購(gòu)自安進(jìn)公司）。每?jī)芍芷は伦⑸浣o藥1次，均為4.0mg/kg。在給藥前進(jìn)行兩次采血檢測(cè)tc、ldl-c，用于篩選血脂較為穩(wěn)定和一致的動(dòng)物。于給藥后第1、3、5、7、14、21、28天各空腹采血1次，用于血脂水平檢測(cè)。血脂檢測(cè)項(xiàng)目包括tc、ldl-c、hdl-c、tg。給藥前后各進(jìn)行1次血液生化和血液學(xué)檢測(cè)。具體結(jié)果參見(jiàn)下面表2以及根據(jù)表2繪制的圖6中，day-2表示用藥前2天，即初始狀態(tài)；day1表示用藥后1天，以此類推）。表2從表2和圖6可以看出，a組和e組在給藥后第1天對(duì)ldl-c抑制作用相近，基本在20-27%；第3天時(shí)抑制作用均在40%以上；a組在第3天至14天期間抑制率維持在35-50%之間；整個(gè)數(shù)據(jù)比較均勻穩(wěn)定。e組在第3天至14天期間抑制率很均一，維持在40-50%之間；但僅作用于第14天，14天后即反彈上升；a組則持續(xù)到28天仍然保持~30%。因此，可以看出，本發(fā)明的抗人pcsk9抗體在對(duì)于ldl-c（體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇）濃度的抑制效果方面要明顯優(yōu)于原研藥物repatha。應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施方式中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。上文所列出的一系列的詳細(xì)說(shuō)明僅僅是針對(duì)本發(fā)明的可行性實(shí)施方式的具體說(shuō)明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>上海海玫生物科技有限公司<120>一種特異性抗人pcsk9的抗體及其應(yīng)用<130>2017-zwx-1<160>50<170>patentinversion3.3<210>1<211>121<212>prt<213>人<400>1gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserserthr202530alailehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaargileserproalaasnglyasnthrasntyralaaspserval505560lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargtrpileglyserarggluleutyrilemetasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>2<211>8<212>prt<213>人<400>2glyphethrpheserserthrala15<210>3<211>8<212>prt<213>人<400>3ileserproalaasnglyasnthr15<210>4<211>12<212>prt<213>人<400>4trpileglyserarggluleutyrilemetasptyr1510<210>5<211>107<212>prt<213>人<400>5aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalserthrala202530valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrseralaserpheleutyrserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnalatyrproalaleuhis859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>6<211>11<212>prt<213>人<400>6argalaserglnaspvalserthralavalala1510<210>7<211>7<212>prt<213>人<400>7seralaserpheleutyrser15<210>8<211>9<212>prt<213>人<400>8glnglnalatyrproalaleuhisthr15<210>9<211>121<212>prt<213>人<400>9gluvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglypheleupheserserthr202530alailehistrpvalargglnproproglylysglyleuglutrpval354045alaargileserproalaasnalaglytyrasntyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserthrasnthrleuphe65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargtrpileglyargarggluleutyrilemetaspargtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>10<211>107<212>prt<213>人<400>10aspileglnmetileglnserproserservalseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileserthrala202530valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuleu354045tyrseralaserserleutyrserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnalatyrargalaleuhis859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>11<211>121<212>prt<213>人<400>11glnvalglnleuleugluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserserthr202530alailehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaargileserproalaasnpheleuargasntyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargtrpileglyserarggluleutyrilemetaspleutrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>12<211>107<212>prt<213>人<400>12aspileglnmetthrglnserproserservalseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalserserala202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprogluleuleuile354045tyrseralaserargleugluserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnalatyrthralaleuhis859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>13<211>121<212>prt<213>人<400>13gluvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglypheleupheserserthr202530alailehistrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval354045alaargileserproalaasnileargtrpasntyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargtrpileglyargarggluleutyrilemetaspleutrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>14<211>107<212>prt<213>人<400>14aspileglnleuthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnserileserserala202530leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045tyrseralaserserleugluserglyvalproaspargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglupro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnalatyrproileleuhis859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>15<211>121<212>prt<213>人<400>15glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalasergly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