本發(fā)明屬于家畜疾病預(yù)防與控制
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及制備牛支原體的滅活疫苗和一種預(yù)防牛支原體疾病的特異性卵黃抗體的制備方法及在預(yù)防奶牛感染牛支原體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：牛支原體(Mycoplasmabovis)又被稱為牛霉形體，是感染牛的一種重要的致病性支原體。主要引起牛呼吸系統(tǒng)疾病、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎等多種疾病。該病分布廣泛，遍布?xì)W洲、美洲、大洋洲和亞洲等地區(qū)，使全世界養(yǎng)牛業(yè)蒙受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中尤以歐洲最為嚴(yán)重。在美國，牛支原體所造成的損失每年達(dá)1.4億美元，單獨(dú)由牛支原體引起的牛只生長緩慢所致的損失每年就高達(dá)3200萬美元，單個(gè)牛場的牛支原體感染可高達(dá)70%。在歐洲，每年因牛病損失的5.79億歐元中有1/3是由牛支原體引起的。在英國，約有190萬頭?；加信Ｖгw肺炎，死亡可達(dá)15.7萬頭，經(jīng)濟(jì)損失超過5400萬英鎊，在這些呼吸道感染牛中，至少有1/4是由牛支原體引起的。自2008年以來，我國部分地區(qū)新從外地引進(jìn)肉牛暴發(fā)了以壞死性肺炎為主要特征的“傳染性牛支原體肺炎”疫情，發(fā)病率為50%～100%，病死率高達(dá)10%～50%，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了隨巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著牛支原體感染范圍的擴(kuò)大和牛支原體引起疾病的發(fā)展及造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，這引起了人們的廣泛關(guān)注，使如何有效防控牛支原體病逐漸成為養(yǎng)牛業(yè)研究關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，牛支原體對世界的養(yǎng)牛業(yè)危害嚴(yán)重，藥物治療效果不明顯，疫苗研制已成為開發(fā)重點(diǎn)。但是目前國內(nèi)外缺乏安全有效的牛支原體疫苗，造成牛支原體疾病近幾年不斷的傳播和蔓延，加之抗生素的濫用導(dǎo)致很多疾病對抗生素的耐藥性增加，研制一種像益生菌、中草藥一樣的沒有耐藥性的治療及預(yù)防的藥物成了目前科學(xué)家研究的重點(diǎn)。因此，研發(fā)一種高效安全易于服用的抗體疫苗，是本病防治急需解決的問題然而隨著卵黃抗體(IgY)的研究深入，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了利用卵黃抗體可預(yù)防和治療畜禽各種疾病，并取得了良好效果。卵黃抗體是雞被外來抗原刺激后，所產(chǎn)生的特異性抗體聚集在卵黃內(nèi)，通過相應(yīng)技術(shù)對卵黃抗體進(jìn)行提取，制成卵黃抗體制劑。卵黃抗體具有特異性，針對性，無耐藥性，安全，制備簡單，穩(wěn)定性好，耐熱、耐酸，耐堿，抗離子強(qiáng)度，并具有一定抗酶解能力，且無殘留等優(yōu)點(diǎn)，已成為了疫苗研究的熱點(diǎn)。研究表明，IgY能夠抵抗幼齡動(dòng)物腸道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。家禽免疫系統(tǒng)的特性決定小劑量的抗原便可發(fā)揮作用，因此可以用少量抗原在較長時(shí)間獲得大量高滴度特異性抗體。一個(gè)母雞每年大約能產(chǎn)280枚雞蛋，每個(gè)卵黃里面含有100~150mgIgY，因此每只雞每年能夠產(chǎn)生40g特異性卵黃抗體，具有很大的生產(chǎn)潛力。因此，與其他哺乳動(dòng)物制備多克隆抗體相比，特異性IgY制備有著經(jīng)濟(jì)、易操作、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)。卵黃抗體與初乳中母源抗體的作用機(jī)理相似，都是以被動(dòng)免疫的方式使幼畜獲得免疫力，達(dá)到保護(hù)幼畜的目的。因此研制抗牛支原體病的卵黃抗體，用于牛支原體病的防制具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于研制一種特異性卵黃抗體，它能預(yù)防牛支原體對奶牛的感染。該抗體的制備具有成本低，產(chǎn)量高、特異性強(qiáng)、操作簡單、對環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn)，是一種綠色的抗生素替代品。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種預(yù)防牛支原體的特異性卵黃抗體，是將滅活的牛支原體懸液與弗氏佐劑混合制成特異免疫原，用該免疫原免疫健康開產(chǎn)母雞，并收集其產(chǎn)的雞蛋，所述的雞蛋蛋黃中含有預(yù)防奶牛牛支原體病的特異性卵黃抗體，其中所述的牛支原體菌株為NP2。制備預(yù)防奶牛牛支原體病的特異性卵黃抗體的方法，其中制備特異免疫源的方法采用改良的Thiaucourt，s液體培養(yǎng)基，首先復(fù)活牛支原體（NP2）菌株，然后傳代培養(yǎng)3代達(dá)到菌濃度后擴(kuò)大培養(yǎng)，再用0.4%甲醛滅活2~3h，離心制備成抗原懸液，然后與弗氏佐劑混合而成。所述的特異免疫原免疫健康產(chǎn)母雞，分離所產(chǎn)雞蛋的蛋黃，提取IgY，該雞蛋的蛋黃中含有所述的能夠預(yù)防奶牛牛支原體病的特異性卵黃抗體。所述的免疫產(chǎn)蛋母雞的免疫步驟是：在健康開產(chǎn)蛋雞的雙翼、胸腹部和背部皮下及肌肉多位點(diǎn)注射500ul濃度為1mg/ml的用弗氏完全佐劑（FCA）混合的特異性免疫原，在基礎(chǔ)免疫后的15、30、45d后，同樣經(jīng)雞雙翼、胸腹部和背部皮下及肌肉多位點(diǎn)先后注射500ul、750ul、1ml濃度為2.0mg/ml的用弗氏不完全佐劑（FIA）混合的特異性免疫原。一種預(yù)防牛支原體疾病的特異性卵黃抗體，它被全卵黃粉作為抗生素的替代品用于飼料，預(yù)防牛支原體病。本發(fā)明細(xì)節(jié)由下列步驟所示：一、牛支原體抗原的制備1.培養(yǎng)牛支原體，測定菌體濃度牛支原體（NP2）菌株來自寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。菌株復(fù)活以后，按1%的接種量接種于改良的Thiaucourt，s液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃震蕩培養(yǎng)2~3d。傳代培養(yǎng)至少傳3代。期間每隔2~3d采用顏色變化單位法（CCU）測定菌體濃度，要求達(dá)到109ccu/ml以上。2.牛支原體抗原的制備將達(dá)到指定菌濃度的菌液按1%的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)4~5d，然后在菌液中加入終濃度為0.4%的甲醛，置于37℃的培養(yǎng)箱中滅活2~3d。收集滅活后的液體培養(yǎng)物，置于高速冷凍離心機(jī)離心，4℃、10000rpm/min離心30min，收集沉淀，沉淀用適量的PBS（磷酸鹽緩沖液）重懸菌液，重復(fù)上述步驟3次。洗滌完成后用適量的PBS（磷酸鹽緩沖液）懸浮為牛支原體抗原懸液?？乖瓚腋∫哼M(jìn)行無菌檢測，檢測合格后-20℃保存?zhèn)溆谩?.牛支原體滅活疫苗的制備將制備好的牛支原體抗原逐滴加入等體積的弗氏佐劑（弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司），邊加邊振蕩使其充分混勻，完全乳化，制成油包水型油乳疫苗。疫苗抗原的最終濃度：弗氏完全佐劑混合的疫苗為1.0mg/ml，弗氏不完全佐劑混合的疫苗為2.0mg/ml。二、卵黃抗體的制備1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和免疫免疫方式均為產(chǎn)蛋雞雙翼、胸腹部和背部皮下及肌肉多位點(diǎn)注射，共免疫四次?；A(chǔ)免疫一次、加強(qiáng)免疫（二免、三免、四免）三次，間隔時(shí)間均為兩周?；A(chǔ)免疫接種500ul濃度為1.0mg/ml的弗氏完全佐劑（FCA）混合的特異性免疫原，加強(qiáng)免疫（二免、三免、四免）分別接種500ul、750ul、1ml濃度為2.0mg/ml的弗氏不完全佐劑（FIA）混合的特異性免疫原。2.母雞抗體水平的監(jiān)測首次免疫前一周開始每隔7天雞翅下靜脈采血液2ml，分離血清并做好標(biāo)記，然后采用比利時(shí)Bio-XMycoplasambovisElisaKit試劑盒檢測抗體滴度，監(jiān)測母雞抗體水平變化。待母雞體內(nèi)抗體達(dá)到一定較高的穩(wěn)定水平，收集雞蛋，編號標(biāo)記后放入4℃冰箱內(nèi)保存。3.雞蛋內(nèi)抗體水平的評估1）卵黃的采集：卵黃先用酸化水稀釋法進(jìn)行粗提。將卵黃與8倍體積的0.04mol/L檸檬酸緩沖液（PH5.2）稀釋，用磁力攪拌器攪拌均勻，分裝于離心管中4℃靜置過夜。然后以10000r/min低溫超速離心25min，收集上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾即獲得粗提卵黃抗體。2)卵黃抗體的純化：將粗提的卵黃抗體中加入飽和硫酸銨使其終濃度達(dá)到40%，混勻后4℃靜置5~8h，5000r/min離心25min，棄上清取沉淀，加適量滅菌超純水溶解；再加入飽和硫酸銨使其終濃度為60%，混勻后4℃靜置5~8h，同上步離心，用滅菌超純水重懸沉淀至原體積；用截留分子量為100KD的超濾離心管超濾除鹽，然后再用0.22μm濾膜過濾除菌，分別加入青、鏈霉素1000IU/mL和0.01%的硫柳汞，4℃保存。收集的濾液即為提取的卵黃抗體。3）卵黃抗體效價(jià)的檢測：采用Bio-XMycoplasambovisElisaKit試劑盒檢測抗體滴度，倍比梯度稀釋純化的IgY，將酶標(biāo)二抗換為兔抗雞-HRP，稀釋度為1:2000，其余操作按說明書進(jìn)行。以顏色反應(yīng)深于對照組判為陽性，并以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度為抗體效價(jià)。三、卵黃抗體應(yīng)用效果的評價(jià)1.卵黃抗體的制備卵黃抗體的制備與上述步驟二的操作方法相同，測定卵黃抗體的效價(jià)，效價(jià)達(dá)104以上用于下述牛支原體病的預(yù)防。2.預(yù)防犢牛牛支原體試驗(yàn)選擇2月齡、檢測鼻試子、血清無支原體病原的荷斯坦?fàn)倥?5頭，其體重、胎次相對一致，飼養(yǎng)一周適應(yīng)后，隨機(jī)分為3組，分別為試驗(yàn)組、陰性對照組（NC）和陽性對照組（PC），每組5頭犢牛。每天飼喂相同的日糧，自由飲水，空白對照組不作任何處理；試驗(yàn)組分為3組，分別為高劑量組，中等劑量組和低劑量組，高劑量組灌服3個(gè)卵黃量，中等劑量組灌服2個(gè)卵黃量，低劑量組灌服1個(gè)卵黃量，每周灌服1次，連續(xù)灌服3周，第三次人工被動(dòng)免疫2周后進(jìn)行牛支原體毒株感染試驗(yàn)，每頭牛的感染劑量和頻次與PC組相同；陽性對照（PC）組隔離飼養(yǎng)，飼養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)行牛支原體的感染，感染劑量為噴鼻5ml、注射3ml支原體菌液（菌濃度為109ccu/ml以上）/只，每天感染1次，連續(xù)感染3天；陰性對照（NC）組前3周每周注射一次生理鹽水，后期肌肉注射與PC組感染劑量和頻次相同的Thiaucourt’s液體培養(yǎng)基。試驗(yàn)期間每頭犢牛每周采血1次，并測量體溫，直至感染結(jié)束3周后結(jié)束。試驗(yàn)結(jié)束后，每組選取1只犢牛進(jìn)行剖檢，并取組織進(jìn)行病理組織切片的制作。動(dòng)物感染后開始，每周對3組試驗(yàn)牛采集鼻拭子1次，接種于Thiaucourt’s液體、固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)；并將培養(yǎng)物提取DNA且利用16SrRNA引物進(jìn)行支原體鑒定和uvrC引物進(jìn)行牛支原體和無乳支原體鑒定。將感染后剖檢犢牛的關(guān)節(jié)液、胸腔積液、心包液和肺臟組織進(jìn)行牛支原體的鑒定。本發(fā)明所提供的抗牛支原體病的特異性卵黃抗體，制備工藝簡單，成本低、無毒、無害、無殘留、無污染且使用方便，是通過提高奶牛機(jī)體牛支原體的抗體水平來預(yù)防牛支原體病的，抗牛支原體卵黃抗體與現(xiàn)有技術(shù)相比：預(yù)防牛支原體病效果好，方便、靈活，并且省工、力、正對性強(qiáng)，性價(jià)比高，可避免牛發(fā)病后濫用藥而導(dǎo)致藥物在牛體內(nèi)殘留，有助于畜產(chǎn)品質(zhì)量的提高，還可避免牛發(fā)病后大量被動(dòng)用藥而導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性，有利于牛支原體病的防制，實(shí)際使用表明：牛支原體卵黃抗體具有良好的使用效果而無任何毒副作用，將來可制成針劑、粉劑、飼料添加劑等等，擁有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1抗牛支原體卵黃及全卵黃抗體粉圖2犢牛體溫變化圖圖3PC組病理剖檢病變組織：A肺臟組織黏連；B肺臟出血淤血；C肺臟組織發(fā)生實(shí)質(zhì)性肉變及大小不等的灰白色干酪樣或化膿性壞死灶；D肺臟組織內(nèi)部出血并有化膿性和干酪樣壞死灶圖4試驗(yàn)組肺臟、喉頭、氣管的剖檢圖5試驗(yàn)組心臟、肝臟、脾臟、腎臟的剖檢圖6PC組光學(xué)顯微鏡下肺臟和氣管的顯微結(jié)構(gòu)圖7牛支原體的鑒定：A為牛支原體的液體培養(yǎng)；B為牛支原體固體培養(yǎng)物光學(xué)顯微鏡下圖；C為牛支原體的分子生物學(xué)鑒定（其中1是16SrRNA引物擴(kuò)增片段為1500bp，2是uvrC引物擴(kuò)增片段為1600bp）具體實(shí)施方式實(shí)施例1：制備牛支原體抗原一、材料與方法1.1菌株牛支原體（NP1）菌株來自寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室1.2培養(yǎng)基和試劑改良的Thiaucourt，s培養(yǎng)基：PPLO肉湯（21g/L）、滅活馬血清（200mL/L）、25％酵母浸出液（100Ml/L）、10％醋酸鉈（1mL/L）、青霉素（0.1g/L）、葡萄糖（1.0g/L）、丙酮酸鈉（2.0g/L）、0.4％酚紅（4.5mL/L）；0.01MPBS緩沖液（PH7.2）：NaCl8.0g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO4?12H2O3.14g，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L，高壓滅菌，室溫或4℃冰箱保存；弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）均購自Sigma公司。1.3牛支原體菌體濃度的測定菌株復(fù)活以后，按1%的接種量接種于改良的Thiaucourt，s液體培養(yǎng)基，于37℃震蕩培養(yǎng)。期間每隔2~3d采用顏色變化單位法（CCU）測定菌體濃度，要求達(dá)到109ccu/ml以上。傳代培養(yǎng)至少傳3代，每代培養(yǎng)2~3d。最后取2ml進(jìn)行固體培養(yǎng)和PCR鑒定，保證所培養(yǎng)的菌液無任何雜菌污染方可。1.4牛支原體抗原的制備將達(dá)到指定菌濃度的菌液按1%的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)4~5d，然后在菌液中加入終濃度為0.4%的甲醛，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中滅活2~3d，期間每隔幾小時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)基使其充分滅活。收集滅活后的液體培養(yǎng)物，4℃離心（10000rpm）30min，棄去上清，收集沉淀，沉淀用適量的PBS（磷酸鹽緩沖液）重懸菌液，重復(fù)上述步驟，離心、棄上清。洗滌3次后用適量的PBS（磷酸鹽緩沖液）懸浮為牛支原體抗原懸液?？乖瓚腋∫哼M(jìn)行滅活檢驗(yàn)，檢測合格后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.5牛支原體滅活疫苗的制備及檢測將制備好的牛支原體抗原懸液利用核酸蛋白分析儀測定菌體蛋白含量，并稀釋成合適的濃度，然后液逐滴加入等體積的弗氏佐劑（弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司），邊加邊振蕩使其充分混勻，再用超聲波破碎儀使其完全乳化，制成油包水型油乳疫苗。將制備好的疫苗進(jìn)行無菌檢測、穩(wěn)定性試驗(yàn)和安全性試驗(yàn)。二、實(shí)施效果在改良的Thiaucourt，s液體培養(yǎng)基中生長2~3d，培養(yǎng)基顏色略微變?yōu)槌赛S色，澄清透明；在固體培養(yǎng)基中生長3~5d，可形成針尖狀大小且具有明顯中心臍的透明小菌落，顯微鏡下呈油煎蛋狀，菌體姬姆薩染色呈藍(lán)色或藍(lán)紫色。在振蕩培養(yǎng)條件下，牛支原體菌株在接種16~32h進(jìn)入對數(shù)生長期，30h左右達(dá)到生長平臺期，且最大平均生長滴度維持在109ccu/ml數(shù)量級?？乖瓚乙簻缁顧z驗(yàn)：取抗原懸液接種牛支原體固體培養(yǎng)基并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)3~5d，觀察未見牛支原體典型“煎蛋樣”菌落，表明滅活完全。疫苗無菌檢驗(yàn)：將疫苗分別接種普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)3~5d，觀察均無雜菌生長。疫苗穩(wěn)定性試驗(yàn)：取疫苗10ml置于離心管，1000rpm/min離心5min，未見將疫苗析出水相；將疫苗置于4℃，觀察放置后的1d、3d、7d、30d，均未出現(xiàn)分層現(xiàn)象。說明所制備的疫苗穩(wěn)定性好。疫苗安全性試驗(yàn)：小鼠每只腹腔注射0.2mL，觀察其精神狀態(tài)良好、采食正常，注射部位均正常，未見化膿及紅腫現(xiàn)象。證明疫苗安全可靠。疫苗抗原的最終濃度：弗氏完全佐劑混合的疫苗為1.0mg/ml，弗氏不完全佐劑混合的疫苗為2.0mg/ml。實(shí)施例2：制備牛支原體特異性卵黃抗體一、材料與方法1.1試劑與儀器0.04M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（PH5.2）：0.04M檸檬酸C6H8O7?H2O（8.40g/L）7.3ml、0.04M檸檬酸鈉Na3C6H5O7?2H2O（11.76g/L）12.7ml；兔抗雞-HRP購自protein；真空凍干試驗(yàn)機(jī)（JDG-0.2）購自蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和免疫免疫方式均為產(chǎn)蛋雞雙翼、胸腹部和背部皮下及肌肉多位點(diǎn)注射，共免疫四次。基礎(chǔ)免疫一次、加強(qiáng)免疫（二免、三免、四免）三次，間隔時(shí)間均為兩周?；A(chǔ)免疫接種500ul濃度為1.0mg/ml的弗氏完全佐劑（FCA）混合的特異性免疫原，加強(qiáng)免疫（二免、三免、四免）分別接種500ul、750ul、1ml濃度為2.0mg/ml的弗氏不完全佐劑（FIA）混合的特異性免疫原。1.3母雞抗體水平的監(jiān)測首次免疫前一周開始每隔7天雞翅下靜脈采血液2ml，分離血清并做好標(biāo)記，然后用Bio-XMycoplasambovisElisaKit試劑盒檢測抗體滴度，監(jiān)測母雞抗體水平變化。待母雞體內(nèi)抗體達(dá)到一定較高的穩(wěn)定水平，收集雞蛋，編號標(biāo)記后放入4℃冰箱內(nèi)保存1.4雞蛋內(nèi)抗體水平的評估1）卵黃的采集：卵黃用水稀釋法進(jìn)行粗提。先將雞蛋清水洗凈后浸入0.1%的新潔爾滅水溶液中消毒15min后，再75%精酒擦拭外殼，晾干后在無菌條件下打開蛋殼，用卵黃分離器盡量去除蛋白，之后將卵黃于無菌濾紙上滾動(dòng)，吸干殘留蛋清，用注射器針頭刺破卵黃膜，吸取卵黃液10mL與滅菌燒杯中，再加入9倍體積0.04mol/L檸檬酸緩沖液（PH5.2）稀釋，用磁力攪拌器攪拌均勻，分裝于離心管中4℃靜置過夜。然后以10000r/min低溫超速離心25min，收集上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾即獲得粗提卵黃抗體。2)卵黃抗體的純化：將粗提的卵黃抗體中加入飽和硫酸銨使其終濃度達(dá)到40%，混勻后4℃靜置5~8h，5000r/min離心25min，棄上清取沉淀，加適量滅菌超純水溶解；再加入飽和硫酸銨使其終濃度為60%，混勻后4℃靜置5~8h，同上步離心，用滅菌超純水重懸沉淀至原體積；用截留分子量為100KD的超濾離心管超濾除鹽，然后再用0.22μm濾膜過濾除菌，分別加入青、鏈霉素1000IU/mL和0.01%的硫柳汞，4℃保存。收集的濾液即為提取的卵黃抗體。3）卵黃抗體效價(jià)的檢測：采用Bio-XMycoplasambovisElisaKit試劑盒檢測抗體滴度，倍比梯度稀釋純化的IgY，將酶標(biāo)二抗換為兔抗雞-HRP，稀釋度為1:2000，其余操作按說明書進(jìn)行。以顏色反應(yīng)深于對照組判為陽性，并以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度為抗體效價(jià)。1.5全卵黃抗體粉的制備收集抗體滴度檢測達(dá)104以上的雞蛋，分離卵黃，利用冷凍真空干燥機(jī)凍干，制成全卵黃粉。二、實(shí)施結(jié)果一個(gè)卵黃中含抗牛支原體卵黃抗體（IgY）約100~150mg，制成全卵黃抗體粉重量為6.5~7.5g（圖1）。實(shí)施例3：卵黃抗體應(yīng)用效果的評價(jià)一、試驗(yàn)步驟與方法1.卵黃抗體的制備卵黃抗體的制備與上述步驟二的操作方法相同，測定卵黃抗體的效價(jià)，效價(jià)達(dá)104以上方用于下述牛支原體病的預(yù)防。2.犢牛牛支原體病預(yù)防試驗(yàn)2.1試驗(yàn)犢牛的選擇和分組選擇2月齡、且檢測鼻試子、血清無支原體病原的荷斯坦?fàn)倥?5頭，保證其體重、胎次月齡相對一致，飼養(yǎng)一周適應(yīng)后，隨機(jī)分為3組，每組5頭，分欄飼養(yǎng)。2.2飼養(yǎng)管理水槽自由飲水，干粉料，青干草自由采食，日喂3次；及時(shí)清理食槽、水槽中的臟物，保證食入的草料、飲水干凈健康；每日清理一次圈舍內(nèi)的糞便，保證犢牛生活的環(huán)境干凈、舒適。2.3試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì)試驗(yàn)采用單因子設(shè)計(jì)。共分為3組，即分別為試驗(yàn)組、陰性對照組（NC）和陽性對照組（PC）；試驗(yàn)組分為3組，分別為高劑量組，中等劑量組和低劑量組，高劑量組灌服3個(gè)卵黃量，中等劑量組灌服2個(gè)卵黃量，低劑量組灌服1個(gè)卵黃量，每周灌服1次，連續(xù)灌服3周，第三次人工被動(dòng)免疫2周后進(jìn)行牛支原體毒株感染試驗(yàn)，每頭牛的感染劑量和頻次與PC組相同；陽性對照（PC）組隔離飼養(yǎng)，飼養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)行牛支原體的感染，感染劑量為噴鼻5ml、注射3ml支原體菌液（菌濃度為109ccu/ml以上）/只，每天感染1次，連續(xù)感染3天；陰性對照（NC）組前3周每周注射一次生理鹽水，2周后肌肉注射與PC組感染劑量和頻次相同的Thiaucourt’s液體培養(yǎng)基。2.4犢牛體溫變化監(jiān)測在0-15d，每天7:00-8:00測量體溫一次，15d以后每隔一天測一次體溫，直至感染試驗(yàn)結(jié)束，記錄每次所測體溫，并繪制出體溫變化折線圖。2.5犢牛體內(nèi)抗體水平的檢測0d（第一次免疫）前一周采集血清1次，0d后，每周分別對3組試驗(yàn)牛采集血液并分離血清1次，直至感染結(jié)束后3周結(jié)束，將采集的血液分離出血清，并標(biāo)記置于-20℃保存待測。將每組分離出的血清采用比利時(shí)Bio-XMycoplasambovisElisaKit試劑盒進(jìn)行抗體滴度的檢測。2.6犢牛剖檢病理變化感染后28d，將PC、NC和試驗(yàn)組牛只進(jìn)行病理剖檢，并采集牛只肺臟、氣管、喉頭、心臟、腎臟組織固定于10%福爾馬林溶液，固定7d后，石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。2.7感染后犢牛支原體的鑒定動(dòng)物感染后開始，每周對3組試驗(yàn)牛采集鼻拭子1次，并用PBS進(jìn)行稀釋。將鼻拭子接種在Thiaucourt’s液體培養(yǎng)基中和固體培養(yǎng)基CO2培養(yǎng)箱5%CO237℃培養(yǎng)，培養(yǎng)2d后鏡檢固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；，利用0.22μm細(xì)菌過濾器過濾菌液，并接種于液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2d后提取培養(yǎng)物DNA并利用16SrRNA引物進(jìn)行支原體鑒定和uvrC引物進(jìn)行牛支原體和無乳支原體鑒定。動(dòng)物感染試28d后進(jìn)行牛只病理剖檢，采集牛只關(guān)節(jié)液、胸腔積液、心包液和肺臟組織。將采集的肺臟組織表面用火焰滅菌，剪取肺臟深部組織一小塊，然后無菌操作條件下接種于牛支原體Thiaucourt’s液體篩選培養(yǎng)基中和牛支原體Thiaucourt’s固體篩選培養(yǎng)基，每份病料樣品接種3個(gè)液體培養(yǎng)基和3個(gè)固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基置于CO2培養(yǎng)箱5%CO237℃培養(yǎng)2d后，顯微鏡下觀察菌落形態(tài)；液體培養(yǎng)基于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2d后觀察培養(yǎng)基顏色變化情況，將變黃的培養(yǎng)液用0.22um除菌濾膜過濾，重復(fù)培養(yǎng)過濾液后提取DNA進(jìn)行牛支原體分子生物學(xué)鑒定。二、結(jié)果與分析1犢牛體溫變化在試驗(yàn)期間，NC組體溫一直維持39.10℃～39.50℃之間，在牛正常體溫之內(nèi)；PC組從第15d開始高于39.50℃，并呈升高的趨勢，最高體溫40.50℃，與NC組的最大體溫差為1.50℃，差異顯著（P<0.05）；試驗(yàn)組第1次灌服卵黃抗體后，A、B組體溫均略有升高，C組體溫變化不明顯，第2次灌服卵黃抗體后體均A、B、C組體溫均略有升高，A、B組體溫變化明顯，最高體溫均高于正常值，分別升至39.80℃、39.70℃，與NC組差異顯著（P<0.05），C組體溫雖略有升高，但均在體溫正常范圍內(nèi)。感染試驗(yàn)后試驗(yàn)組體溫變化不明顯，A組最高體溫39.6℃，與NC組相比差異不顯著（P>0.05）（圖2）。2犢牛剖檢變化及病理組織學(xué)觀察PC組剖檢發(fā)現(xiàn)：肺臟組織黏連、肺臟出血淤血、肺臟組織發(fā)生實(shí)質(zhì)性肉變及大小不等的灰白色干酪樣或化膿性壞死灶、肺臟組織內(nèi)部出血并有化膿性和干酪樣壞死灶，其他組織均無肉眼可見病理變化（圖3）。試驗(yàn)組剖檢發(fā)現(xiàn)：肺臟、喉頭、氣管、心臟、肝臟、腎臟和關(guān)節(jié)組織均無肉眼可見病變（圖4、圖5）。試驗(yàn)組肺臟和氣管組織無明顯病理組織學(xué)變化；PC組可見細(xì)支氣管縮小，皺襞增多，官腔內(nèi)有少量脫落的上皮細(xì)胞，肺泡塌陷、肺泡隔增厚，組織增生，肺泡腔內(nèi)有少量細(xì)胞脫落（圖6）。注：A：肺泡塌陷、肺泡隔增厚，組織增生；B：肺泡塌陷，肺泡隔增厚，肺泡腔內(nèi)有少量細(xì)胞脫落；C：肺細(xì)支氣管縮小，皺襞增多，官腔內(nèi)有少量脫落的上皮細(xì)胞；D：細(xì)支氣管縮小，皺襞增多。3犢牛抗體水平變化表1犢?？贵w水平變化（周）012345678910A--+++++++++---B--++++++----C---++------NC組-----------PC組--+++++++++++++++++4犢牛支原體鑒定PC組剖檢所取的組織樣經(jīng)37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3d，接種過牛支原體的液體培養(yǎng)基由紅色變?yōu)槌吻逋噶恋某赛S色，培養(yǎng)管底部無沉淀。在固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)肉眼可見的針尖樣大小菌落，40倍光學(xué)顯微鏡下觀察菌落常呈圓形、邊緣整齊、表面光滑、周邊薄中央厚的“油煎蛋狀”。用DNA提取試劑盒對培養(yǎng)的菌株進(jìn)行基因組提取，進(jìn)一步進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果均得到目的基因條帶，所以PC組經(jīng)過牛支原體液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、PCR鑒定，均檢測到牛支原體；而試驗(yàn)組均未檢測到牛支原體（圖7）。綜上所述：牛支原體卵黃抗體在臨床應(yīng)用中與陰性和陽性對照相比，可產(chǎn)生牛支原體抗體，預(yù)防牛支原體病，其中A組產(chǎn)生的抗體可維持在較高水平，且維持時(shí)間最長，說明A、B組劑量合適；C組產(chǎn)生的抗體滴度低、維持時(shí)間短，說明讓機(jī)體產(chǎn)生抗體的劑量不夠。動(dòng)物感染試驗(yàn)后，A、B、C組臨床表現(xiàn)均無明顯變化，均未出現(xiàn)牛支原體病的臨床特征性表現(xiàn)，犢牛剖檢無肉眼可見變化，無病理組織學(xué)變化，而且未檢測到牛支原體病原的存在。說明，本發(fā)明的牛支原體卵黃抗體對于牛支原體病原的預(yù)防具有良好的效果，且該卵黃抗體相比抗生素有著成本低、無毒、無害、無殘留、無污染且使用方便等突出優(yōu)點(diǎn)，也可起到良好的預(yù)防保健作用。若作為飼料添加劑IgY建議劑量為200~450mg。當(dāng)前第1頁1 2 3