本發(fā)明涉及新的抗tmem-180抗體、含有抗tmem-180抗體的抗癌劑、對試樣中的tmem-180進行測定的癌癥檢查方法等。

背景技術(shù)：

近年來，作為抗癌劑，特異性地作用于特定分子的多種分子靶向藥物正在被開發(fā)。特別地，以在某種癌細胞中特異性表達的分子、在癌細胞中表達水平亢進的分子作為抗原的各種抗體醫(yī)藥的開發(fā)正在持續(xù)進行。在對這類抗體醫(yī)藥的開發(fā)中，首先將手術(shù)時采集的癌組織中的mrna表達與從其附近采集的正常組織中的mrna的表達進行比較，確定出僅在癌組織中特異性表達的分子、在癌癥組織中表達水平亢進的分子，將其作為抗原來制備抗體。

大腸癌是從大腸粘膜的細胞發(fā)生的癌癥。迄今為止，開發(fā)了作為以上皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor；egfr)為靶標(biāo)的抗體的西妥昔單抗(cetuximab)，并將其應(yīng)用于大腸癌(非專利文獻1-3)。但是，由于egfr在正常組織中也會表達，因此存在西妥昔單抗也在正常組織中也發(fā)揮作用的可能性，人們期望開發(fā)出以更加特異性地在大腸癌中表達的分子作為靶標(biāo)的分子靶向藥物。但就此點而言，由于發(fā)生大腸癌的粘膜組織僅為少量，因此，存在難以通過對癌化的粘膜細胞和正常的粘膜細胞加以比較來確定靶分子的問題。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

非專利文獻

非專利文獻1：cunninghamd.等,thenewenglandjournalofmedicine.,vol.351,no.4,2004,p.p.337-345.

非專利文獻2：goldsteinni.等,clincancerres.vol.1,1311-1318,1995.

非專利文獻3：karapetiscs.等,thenewengljmed.vol.359,1757-1765.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明的課題在于發(fā)現(xiàn)癌特異性表達的靶分子、提供能夠通過特異性地作用于該靶分子而治療癌癥的抗癌劑，以及，提供包括對試樣中的靶分子進行測定的工序的癌癥檢查方法。

解決課題的手段

本申請的發(fā)明人為解決上述課題，利用dna微陣列分析，對各種大腸癌細胞株和大腸內(nèi)窺鏡檢查時的清洗液中含有的正常粘膜細胞中的mrna的表達進行了比較，以探究僅在大腸癌細胞株中表達的分子。結(jié)果，作為在所有大腸癌細胞株中均表達、但在健康者的細胞中未發(fā)現(xiàn)表達的蛋白質(zhì)，鑒定出了跨膜蛋白(transmembraneprotein)180(tmem-180)。進而，通過定量pcr和原位雜交法，確認了tmem-180在正常大腸組織中不表達，同時確認了tmem-180在主要的正常組織中也不表達，由此，確認tmem-180是作為抗癌劑的靶標(biāo)、以及作為癌癥的檢查中的指標(biāo)而言理想的分子。

進而，針對tmem-180制備了抗體，確認到該抗體對于大腸癌細胞呈現(xiàn)細胞殺傷效果，以及較之以往的大腸癌標(biāo)志物而言能夠靈敏度更好地對尤其是復(fù)發(fā)進行檢測，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明涉及以下的項：

〔1〕一種抗癌劑，其含有抗跨膜蛋白180(tmem-180)抗體或其抗原結(jié)合片段作為有效成分；

〔2〕一種抗癌劑，其含有結(jié)合有具有抗癌活性的物質(zhì)的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段作為有效成分；

〔3〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：gfsltrynvh(序列號1)；

重鏈cdr2：viwtggstd(序列號2)；

重鏈cdr3：dlgy(序列號3)；

輕鏈cdr1：kssqslkyrdgktyln(序列號4)；

輕鏈cdr2：qvsklds(序列號5)；及

輕鏈cdr3：cqgsyspht(序列號6)；

〔4〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：gfsltsyymq(序列號7)；

重鏈cdr2：firsggste(序列號8)；

重鏈cdr3：afyggyyfdy(序列號9)；

輕鏈cdr1：kasqnvgsnvd(序列號10)；

輕鏈cdr2：kasnryt(序列號11)；及

輕鏈cdr3：mqsntkyt(序列號12)；

〔5〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：gftfsdyama(序列號40)；

重鏈cdr2：tiiydgsst(序列號41)；

重鏈cdr3：hwywyfdf(序列號42)；

輕鏈cdr1：lasegisndla(序列號43)；

輕鏈cdr2：aasrlqd(序列號44)；及

輕鏈cdr3：qqsykyplt(序列號45)；

〔6〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：dcaln(序列號48)；

重鏈cdr2：wintqtgkptyaddf(序列號49)；

重鏈cdr3：edygyfdy(序列號50)；

輕鏈cdr1：qasqninkfia(序列號51)；

輕鏈cdr2：ytstlvs(序列號52)；及

輕鏈cdr3：lqydnlr(序列號53)；

〔7〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：nygmh(序列號56)；

重鏈cdr2：sispsggstyyrdsv(序列號57)；

重鏈cdr3：sasitayyyvmda(序列號58)；

輕鏈cdr1：kasqnvgsnvd(序列號59)；

輕鏈cdr2：kasnryt(序列號60)；及

輕鏈cdr3：mqsnsyppt(序列號61)；

〔8〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：nywmt(序列號64)；

重鏈cdr2：sitntggstyypdsv(序列號65)；

重鏈cdr3：agyssypdyfdy(序列號66)；

輕鏈cdr1：kagqniynyla(序列號67)；

輕鏈cdr2：nanslqt(序列號68)；及

輕鏈cdr3：qqyssgw(序列號69)；

〔9〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：dywvs(序列號72)；

重鏈cdr2：eiypnsgatnfnenfk(序列號73)；

重鏈cdr3：dgtmgiayyfdy(序列號74)；

輕鏈cdr1：kasqninryln(序列號75)；

輕鏈cdr2：nanslqt(序列號76)；及

輕鏈cdr3：lqhnswpyt(序列號77)；

〔10〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：sydis(序列號80)；

重鏈cdr2：ainpgsggtgynekfkgk(序列號81)；

重鏈cdr3：ihggyrywfay(序列號82)；

輕鏈cdr1：rasssvsymh(序列號83)；

輕鏈cdr2：dtsklas(序列號84)；及

輕鏈cdr3：lqrssyppt(序列號85)；

〔11〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：sngvg(序列號88)；

重鏈cdr2：tiwtgggtnynsgvqs(序列號89)；

重鏈cdr3：eymgfdy(序列號90)；

輕鏈cdr1：kasqnvginvg(序列號91)；

輕鏈cdr2：wasnrdt(序列號92)；及

輕鏈cdr3：lqhnsyprt(序列號93)；

〔12〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體具有以下6個cdr中的至少1個：

重鏈cdr1：sngvg(序列號96)；

重鏈cdr2：tiwsgggtnynsavqs(序列號97)；

重鏈cdr3：eekgfay(序列號98)；

輕鏈cdr1：kasqnvginvg(序列號99)；

輕鏈cdr2：wasnrdt(序列號100)；及

輕鏈cdr3：lqhnsypra(序列號101)；

〔13〕如〔3〕至〔12〕中任一項所述的抗癌劑，其中，對于所述抗tmem-180抗體而言，

在所述重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3中的至少1個中含有1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失；或

所述重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3中的至少1個具有與所述重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列；

〔14〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號13表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號13表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號13表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號14表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號14表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號14表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔15〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號15表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號15表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號15表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號16表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號16表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號16表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔16〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號46表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號46表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號46表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號47表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號47表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號47表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔17〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號54表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號54表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號54表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號55表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號55表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號55表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔18〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號62表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號62表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號62表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號63表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號63表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號63表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔19〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號70表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號70表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號70表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號71表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號71表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號71表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔20〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號78表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號78表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號78表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號79表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號79表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號79表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔21〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號86表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號86表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號86表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號87表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號87表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號87表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔22〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號94表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號94表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號94表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號95表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號95表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號95表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔23〕如上述〔1〕或〔2〕所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體包含：

含有序列號102表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號102表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號102表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；

及/或，

含有序列號103表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號103表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號103表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈；

〔24〕如上述〔1〕至〔23〕中任一項所述的抗癌劑，其中，所述抗tmem-180抗體中，

在fc區(qū)結(jié)合1個以上的n-結(jié)合型糖鏈，所述n-結(jié)合型糖鏈的還原末端的n-乙酰葡糖胺上不結(jié)合巖藻糖；

〔25〕如上述〔1〕至〔24〕中任一項所述的抗癌劑，所述抗癌劑以表達tmem-180的癌癥為對象；

〔26〕如上述〔1〕至〔24〕中任一項所述的抗癌劑，所述抗癌劑以大腸癌為對象；

〔27〕如上述〔1〕至〔24〕中任一項所述的抗癌劑，所述抗癌劑與使用了下述組合物的癌癥疫苗療法聯(lián)合施予，所述組合物含有至少1種包含序列號104～170表示的氨基酸序列的肽；

〔28〕抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段，其是上述〔3〕至〔24〕中任一項中記載的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段；

〔29〕一種核酸，所述核酸編碼上述〔3〕至〔13〕中任一項中記載的重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3中的任一者；

〔30〕一種核酸，所述核酸編碼上述〔14〕至〔23〕中任一項如所述的重鏈及輕鏈中的任一者；

〔31〕一種表達載體，所述表達載體含有上述〔29〕或〔30〕所述的核酸；

〔32〕一種轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體含有上述〔31〕所述的表達載體；

〔33〕抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的制造方法，所述方法包括：

通過上述〔32〕所述的轉(zhuǎn)化體使抗體表達的工序、和

回收所述抗體的工序；

〔34〕癌癥檢查方法，所述方法包括對從受檢者采集的試樣中的tmem-180量進行測定的工序；

〔35〕如上述〔34〕所述的癌癥檢查方法，其中，通過使用了抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的免疫分析進行對所述tmem-180量的測定；

〔36〕如上述〔35〕所述的癌癥檢查方法，其中，所述抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段是上述〔28〕所述的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段；

〔37〕如上述〔34〕至〔36〕中任一項所述的癌癥檢查方法，以大腸癌為對象；

〔38〕如上述〔34〕至〔37〕所述的癌癥檢查方法，所述方法用于對治療后的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的檢查；

〔39〕癌癥檢查用試劑盒，所述試劑盒包含抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段；

〔40〕如上述〔39〕所述的癌癥檢查用試劑盒，其中，所述抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段是上述〔28〕所述的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段；及

〔41〕如上述〔39〕或〔40〕所述的癌癥檢查用試劑盒，以大腸癌為對象。

本發(fā)明的含有抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的抗癌劑以在特定癌癥中特異性表達、且在正常組織中不表達的tmem-180為靶標(biāo)，因此，能夠得到癌細胞特異性的強大效果，而且，從另一方面來說，其副作用也少。

tmem-180在特定癌癥中特異性表達、且在正常組織中不表達，因此，通過本發(fā)明的使用抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的癌癥檢查方法及檢查用試劑盒，可簡便地實施癌癥檢查。與以往的大腸癌標(biāo)志物相比，本發(fā)明的癌癥檢查方法及檢查用試劑盒可以以更好的靈敏度檢測尤其是癌癥的復(fù)發(fā)。

另外，通過使用本發(fā)明的含有結(jié)合有具有抗癌活性的物質(zhì)的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的抗癌劑，可將該抗癌劑特異性地遞送至表達tmem-180的癌細胞，因此，作為具有抗癌活性的物質(zhì)而言毒性強的物質(zhì)也可被容易地利用。

附圖說明

圖1a示出了利用dna微陣列對人大腸癌細胞株、來自于健康者的大腸粘膜細胞進行綜合性表達分析的結(jié)果中的tmem-180表達量。圖1b示出了利用定量pcr對大腸癌細胞和相鄰的正常大腸組織中的tmem-180的表達進行分析的結(jié)果。圖1c及d示出了利用原位雜交對癌變部位及正常部位中的tmem-180的表達進行調(diào)查的結(jié)果。

圖2a示出了使用數(shù)據(jù)庫對各種正常組織中的tmem-180的表達進行調(diào)查的結(jié)果。圖2b示出了通過與圖2a同樣的方法、針對tmem-180和作為以往的抗癌劑靶標(biāo)的分子進一步調(diào)查微量表達而得到的結(jié)果。

圖3示出了針對大腸癌、腦腫瘤、血液癌的各種細胞株，使用克隆98、克隆101、及克隆212抗tmem-180抗體進行流式細胞術(shù)(flowcytometry)分析而得到的結(jié)果。

圖4示出了使用克隆98、克隆101、及克隆212抗tmem-180抗體對大腸癌細胞進行熒光免疫染色的結(jié)果。需要說明的是，各克隆的抗體濃度未被統(tǒng)一一致。

圖5示出了針對克隆98大鼠igm抗體和克隆98大鼠-人嵌合抗體，利用流式細胞術(shù)對針對dld-1大腸癌株和其tmem-180基因敲除(knockout)株的反應(yīng)性進行調(diào)查的結(jié)果。

圖6示出了使用克隆98大鼠igm抗體對人大腸癌和附近正常部位進行染色的結(jié)果。

圖7示出了使用產(chǎn)生克隆98大鼠igm抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清液進行的細胞毒性試驗的結(jié)果。雜交瘤培養(yǎng)上清液中的抗體濃度通過igm特異性抗體elisa測定。

圖8示出了使用產(chǎn)生克隆101大鼠igm抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清液進行的細胞毒性試驗的結(jié)果。雜交瘤培養(yǎng)上清液中的抗體濃度通過igm特異性抗體elisa測定。

圖9示出了對癌細胞培養(yǎng)上清液中的tmem-180蛋白質(zhì)濃度進行測定的結(jié)果。

圖10示出了針對4名大腸癌iv期患者、對血漿中的tmem-180蛋白質(zhì)濃度進行測定的結(jié)果。另外，圖中右側(cè)的表示出來自相同患者的測試樣品中的cea值的測定結(jié)果。

圖11示出了針對3名大腸癌iii期患者、對術(shù)前和術(shù)后血漿中的tmem-180蛋白質(zhì)濃度進行測定的結(jié)果。

圖12示出了針對大腸癌各期的患者對術(shù)前、術(shù)后、及復(fù)發(fā)時血漿中的tmem-180蛋白質(zhì)濃度及cea濃度進行測定的結(jié)果。

具體實施方式

(抗tmem-180抗體及抗癌劑)

本發(fā)明涉及的抗癌劑的一種實施方式含有抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段作為有效成分。

本說明書中，所謂抗tmem-180抗體，是指能與跨膜蛋白-180(tmem-180)特異性結(jié)合的抗體。本說明書中，提及tmem-180時，來自于任意動物的tmem-180均可，另外，還可以是其突變體，只要能夠作為抗癌劑的靶標(biāo)、以及作為癌癥檢查方法的指標(biāo)即可。作為tmem-180的一個例子，將人tmem-180的氨基酸序列作為序列號17示出。

本說明書中，“抗體”是指具有通過一對二硫鍵而穩(wěn)定化的2條重鏈(h鏈)與2條輕鏈(l鏈)締合而成的結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。重鏈包含重鏈可變區(qū)vh、重鏈恒定區(qū)ch1、ch2、ch3、及位于ch1與ch2之間的鉸鏈區(qū)，輕鏈包含輕鏈可變區(qū)vl和輕鏈恒定區(qū)cl。其中，包含vh和vl的可變區(qū)片段(fv)與抗原結(jié)合直接相關(guān)，是賦予抗體多樣性的區(qū)域。另外，包含vl、cl、vh、ch1的抗原結(jié)合區(qū)域被稱為fab區(qū)，包含鉸鏈區(qū)、ch2、ch3的區(qū)域被稱為fc區(qū)。

可變區(qū)中，直接與抗原接觸的區(qū)域的變化特別大，其被稱為互補性決定區(qū)(complementarity-determiningregion：cdr)。cdr以外的突變較少的部分被稱為框架區(qū)(frameworkregion：fr)。輕鏈和重鏈的可變區(qū)中，分別存在3個cdr，從n末端側(cè)起依次被稱為重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。另外，本發(fā)明的抗tmem-180抗體可以是igg、igm、iga、igd、ige中的任一亞型(isotype)。可以是對小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、雞等非人動物進行免疫而制備出的抗體，也可以是重組抗體，還可以是嵌合抗體、人源化抗體、完全人源化抗體等。所謂嵌合型抗體，是指將來自于不同種的抗體的片段連接起來得到的抗體。

所謂“人源化抗體”，是指用非人源抗體的特征氨基酸序列在人抗體的對應(yīng)位置進行替換而得到的抗體，例如，可舉出下述抗體，其具有通過對小鼠或大鼠進行免疫制備出的抗體的重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3，但包括重鏈及輕鏈各自的4個框架區(qū)(fr)在內(nèi)的其他全部區(qū)域來自于人抗體。該抗體有時也被稱為cdr移植抗體。術(shù)語“人源化抗體”也包含人嵌合抗體的情況。

本說明書中，所謂抗tmem-180抗體的“抗原結(jié)合片段”，是指抗tmem-180抗體的與tmem-180結(jié)合的片段。具體而言，可舉出：fab，其包含vl、vh、cl及ch1區(qū)域；f(ab’)2，其是2個fab在鉸鏈區(qū)介由二硫鍵連結(jié)而成的；fv，其包含vl及vh；scfv，其是將vl及vh用人工的多肽連接體連接而成的單鏈抗體；除此以外，還可舉出diabody型、scdb型、tandemscfv型、亮氨酸拉鏈型等雙特異性抗體等，但不限于這些。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆98抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：gfsltrynvh(序列號1)

重鏈cdr2：viwtggstd(序列號2)

重鏈cdr3：dlgy(序列號3)

輕鏈cdr1：kssqslkyrdgktyln(序列號4)

輕鏈cdr2：qvsklds(序列號5)

輕鏈cdr3：cqgsyspht(序列號6)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆101抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：gfsltsyymq(序列號7)

重鏈cdr2：firsggste(序列號8)

重鏈cdr3：afyggyyfdy(序列號9)

輕鏈cdr1：kasqnvgsnvd(序列號10)

輕鏈cdr2：kasnryt(序列號11)

輕鏈cdr3：mqsntkyt(序列號12)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆212抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：gftfsdyama(序列號40)

重鏈cdr2：tiiydgsst(序列號41)

重鏈cdr3：hwywyfdf(序列號42)

輕鏈cdr1：lasegisndla(序列號43)

輕鏈cdr2：aasrlqd(序列號44)

輕鏈cdr3：qqsykyplt(序列號45)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆129抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：dcaln(序列號48)

重鏈cdr2：wintqtgkptyaddf(序列號49)

重鏈cdr3：edygyfdy(序列號50)

輕鏈cdr1：qasqninkfia(序列號51)

輕鏈cdr2：ytstlvs(序列號52)

輕鏈cdr3：lqydnlr(序列號53)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆382抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：nygmh(序列號56)

重鏈cdr2：sispsggstyyrdsv(序列號57)

重鏈cdr3：sasitayyyvmda(序列號58)

輕鏈cdr1：kasqnvgsnvd(序列號59)

輕鏈cdr2：kasnryt(序列號60)

輕鏈cdr3：mqsnsyppt(序列號61)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆1361抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：nywmt(序列號64)

重鏈cdr2：sitntggstyypdsv(序列號65)

重鏈cdr3：agyssypdyfdy(序列號66)

輕鏈cdr1：kagqniynyla(序列號67)

輕鏈cdr2：nanslqt(序列號68)

輕鏈cdr3：qqyssgw(序列號69)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆669抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：dywvs(序列號72)

重鏈cdr2：eiypnsgatnfnenfk(序列號73)

重鏈cdr3：dgtmgiayyfdy(序列號74)

輕鏈cdr1：kasqninryln(序列號75)

輕鏈cdr2：nanslqt(序列號76)

輕鏈cdr3：lqhnswpyt(序列號77)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆699抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：sydis(序列號80)

重鏈cdr2：ainpgsggtgynekfkgk(序列號81)

重鏈cdr3：ihggyrywfay(序列號82)

輕鏈cdr1：rasssvsymh(序列號83)

輕鏈cdr2：dtsklas(序列號84)

輕鏈cdr3：lqrssyppt(序列號85)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆1052抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：sngvg(序列號88)

重鏈cdr2：tiwtgggtnynsgvqs(序列號89)

重鏈cdr3：eymgfdy(序列號90)

輕鏈cdr1：kasqnvginvg(序列號91)

輕鏈cdr2：wasnrdt(序列號92)

輕鏈cdr3：lqhnsyprt(序列號93)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的一種實施方式具有以下6個cdr中的至少1個。這些cdr為后述的實施例中所示的克隆1105抗tmem-180抗體的cdr序列。

重鏈cdr1：sngvg(序列號96)

重鏈cdr2：tiwsgggtnynsavqs(序列號97)

重鏈cdr3：eekgfay(序列號98)

輕鏈cdr1：kasqnvginvg(序列號99)

輕鏈cdr2：wasnrdt(序列號100)

輕鏈cdr3：lqhnsypra(序列號101)

上述各方式中，對于抗tmem-180抗體而言，只要能發(fā)揮本發(fā)明的效果，其也可以包含6個cdr中的數(shù)個，例如，可包含2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、或6個。

上述各方式中，重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3中的至少1個可含有1個至多個的氨基酸的添加、取代、或缺失。

本說明書中，“氨基酸”使用其最為廣泛的含義，除了天然氨基酸以外，也包含人工的氨基酸突變體、衍生物。氨基酸有時以慣用的單字母記載或三字母記載表示。本說明書中，作為氨基酸或其衍生物，可舉出天然蛋白質(zhì)性l-氨基酸；非天然氨基酸；具有本領(lǐng)域中已知為氨基酸特征的特性的以化學(xué)方式合成的化合物等。作為非天然氨基酸的例子，可舉出主鏈結(jié)構(gòu)與天然型不同的α,α-二取代氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、n-烷基-α-氨基酸、d-氨基酸、β-氨基酸、α-羥酸、側(cè)鏈結(jié)構(gòu)與天然型不同的氨基酸(正亮氨酸、高組氨酸等)、在側(cè)鏈具有多余的亞甲基的氨基酸(“高(homo)”氨基酸、高苯丙氨酸、高組氨酸等)、及側(cè)鏈中的羧酸官能團被磺酸基取代的氨基酸(半胱氨酸等)，但不限于此。

本說明書中，關(guān)于“具有1個至多個氨基酸的添加、取代或缺失”的情況，對于缺失、取代等的氨基酸的個數(shù)而言，只要作為結(jié)果而得到的多肽保持作為cdr的功能則沒有特別限定，例如，可為1個、2個、3個或4個。對于經(jīng)取代或添加的氨基酸而言，除了天然的蛋白質(zhì)性氨基酸以外，也可以是非天然的氨基酸或氨基酸類似物。對于氨基酸的缺失、取代或添加的位置而言，只要能夠保持作為cdr的功能，則可以是cdr序列中的任何位置。

上述的抗tmem-180抗體的各實施方式中，重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3中的至少1個可以具有與原本的重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。

本說明書中，所謂“具有80％以上的同一性”，是指以具有原本的序列的多肽的氨基酸序列和具有突變的序列的多肽的氨基酸序列的一致率為最大的方式進行對齊(alignment)時，共通的氨基酸殘基的數(shù)量為原本的序列的氨基酸數(shù)量的80％以上。

同一性只要為80％以上、且保持作為cdr的功能，則可以是任意的％，可以為例如85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上。

包含在重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3的氨基酸序列中添加、取代、或缺失氨基酸而得到的氨基酸序列的cdr、與重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的cdr可使用位點特異性突變導(dǎo)入法、隨機突變導(dǎo)入法、鏈替換法、cdr步移(walking)法等已知的方法制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，根據(jù)這些方法，利用噬菌體展示法將在cdr中具有各種突變的抗體或抗體片段呈遞至噬菌體表面，并使用抗原進行篩選，由此可得到親和性更為成熟的cdr(例如，wuetal.,pnas,95:6037-6042(1998)；schier,r.etal.,j.mol.bio.263:551-567(1996)；schier,r.etal.,j.mol.biol.255:28-43(1996)；yang,w.p.etal.,j.mol.biol.,254:392-403(1995))。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號13表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號13表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號13表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈。

序列號13表示的氨基酸序列是克隆98抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本說明書中，在重鏈或輕鏈的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失這樣的情況下，添加、取代、或缺失的氨基酸的數(shù)量可為例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個。其他的術(shù)語如上文所述。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號14表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號14表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號14表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號14表示的氨基酸序列是克隆98抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體也可以包含：含有序列號13表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號13表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、或含有與序列號13表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號14表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號14表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、或含有與序列號14表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號15表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號15表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號15表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈。

序列號15表示的氨基酸序列是克隆101抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號16表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號16表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號16表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號16表示的氨基酸序列是克隆101抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式也可以包含：含有序列號15表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號15表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、或含有與序列號15表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號16表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號16表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、含有與序列號16表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號46表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號46表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號46表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈。

序列號46表示的氨基酸序列是克隆212抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號47表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號47表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號47表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號47表示的氨基酸序列是克隆212抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式也可以包含：含有序列號46表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號46表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、含有與序列號46表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號47表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號47表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、或含有與序列號47表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號54表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號54表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有在序列號54表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈。

序列號54表示的氨基酸序列是克隆129抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號55表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號55表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號55表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號55表示的氨基酸序列是克隆129抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式也可以包含：含有序列號54表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號54表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、或含有與序列號54表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號55表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號55表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、或含有與序列號55表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號62表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號62表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號62表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈。

序列號62表示的氨基酸序列是克隆382抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號63表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號63表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號63表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號63表示的氨基酸序列是克隆382抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式也可以包含：含有序列號62表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號62表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、或含有與序列號62表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號63表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號63表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、或含有與序列號63表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號70表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號70表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號70表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈。

序列號70表示的氨基酸序列是克隆1361抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號71表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號71表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號71表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號71表示的氨基酸序列是克隆1361抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式也可以包含：含有序列號70表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號70表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、或含有與序列號70表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號71表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號71表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、或含有與序列號71表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號78表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號78表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號78表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈。

序列號78表示的氨基酸序列是克隆669抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號79表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號79表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號79表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號79表示的氨基酸序列是克隆669抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式也可以包含：含有序列號78表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號78表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、或含有與序列號78表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號79表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號79表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、或含有與序列號79表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號86表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號86表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號86表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈。

序列號86表示的氨基酸序列是克隆699抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號87表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號87表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號87表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號87表示的氨基酸序列是克隆699抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式也可以包含：含有序列號86表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號86表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、或含有與序列號86表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號87表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號87表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、或含有與序列號87表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號94表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號94表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號94表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈。

序列號94表示的氨基酸序列是克隆1052抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號95表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號95表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號95表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號95表示的氨基酸序列是克隆1052抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式也可以包含：含有序列號94表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號94表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、或含有與序列號94表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號95表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號95表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、或含有與序列號95表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號102表示的氨基酸序列的重鏈；

含有在序列號102表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈；或

含有與序列號102表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈。

序列號102表示的氨基酸序列是克隆1105抗tmem-180抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式包含：

含有序列號103表示的氨基酸序列的輕鏈；

含有在序列號103表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈；或

含有與序列號103表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

序列號103表示的氨基酸序列是克隆1105抗tmem-180抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的另一種實施方式也可以包含：含有序列號102表示的氨基酸序列的重鏈、含有在序列號102表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的重鏈、含有與序列號102表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的重鏈；和

含有序列號103表示的氨基酸序列的輕鏈、含有在序列號103表示的氨基酸序列中含1個至多個氨基酸的添加、取代、或缺失的氨基酸序列的輕鏈、或含有與序列號103表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的輕鏈。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體可以是在fc區(qū)結(jié)合1個以上的n-結(jié)合型糖鏈、該n-結(jié)合型糖鏈的還原末端的n-乙酰葡糖胺上不結(jié)合巖藻糖的抗體。

例如，在igg抗體的fc區(qū)中，n-結(jié)合型糖鏈的結(jié)合位點存在有2處，復(fù)合型糖鏈在該位點結(jié)合。所謂n-結(jié)合型糖鏈，是指與asn-x-ser/thr序列中的asn結(jié)合的糖鏈，具有共通的man3glcnac2-asn結(jié)構(gòu)。根據(jù)與非還原末端的2個甘露糖(man)結(jié)合的糖鏈的種類，分類為高甘露糖型、雜合型、及復(fù)合型等。

盡管在n-結(jié)合型糖鏈的還原末端n-乙酰葡糖胺(glcnac)上能夠結(jié)合巖藻糖，但已知在不結(jié)合該巖藻糖的情況下adcc活性比結(jié)合巖藻糖的情況顯著上升。這記載于例如國際公開第2002/031140號小冊子中，其公開的全部內(nèi)容通過參考并入本說明書中。

通過顯著提高adcc活性，在將抗體用作為醫(yī)藥時能夠減少施予量，因此，能夠減輕副作用，并可以降低治療費用。

本發(fā)明涉及的抗癌劑的一種實施方式含有結(jié)合有具有抗癌活性的物質(zhì)的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段作為有效成分。該實施方式中，抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段可以自身具有抗癌活性，也可以僅具有與tmem-180結(jié)合的能力而不具有抗癌活性。

本說明書中，所謂“具有抗癌活性的物質(zhì)”，是指導(dǎo)致以下情況中的至少一種的物質(zhì)：腫瘤大小的縮小(延遲或終止)、對腫瘤轉(zhuǎn)移的阻礙、對腫瘤增殖的阻礙(延遲或終止)、及與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀的緩解。具體而言，可舉出毒素、抗癌劑、放射性同位素，但不限于這些。

作為具有抗癌活性的毒素，例如，可舉出綠膿桿菌外毒素(pe)或其細胞毒性片段(例如pe38)、白喉毒素、蓖麻毒素a等。具有抗癌活性的毒素僅針對tmem-180抗體識別的細胞、即表達tmem-180的癌細胞發(fā)揮毒性，因此，具有不對周圍的細胞造成不良影響、能夠得到特異性效果的優(yōu)點。

作為抗癌劑，例如，可舉出阿霉素、道諾霉素、絲裂霉素、順鉑、長春新堿、表阿霉素、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、阿克拉霉素、氮芥、環(huán)磷酰胺、博來霉素、柔紅霉素、多柔比星、長春新堿、長春堿、長春地辛、他莫昔芬、地塞米松等低分子化合物、激活免疫活性細胞的細胞因子(例如，人白細胞介素2、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、人巨噬細胞集落刺激因子、人白細胞介素12)等蛋白質(zhì)。

作為具有抗癌活性的放射性同位素，可舉出³²p、¹⁴c、¹²⁵i、³h、¹³¹i、²¹¹at、⁹⁰y等。

可利用已知方法或基于已知方法的方法，使具有抗癌活性的物質(zhì)直接或介由接頭(linker)與抗tmem-180抗體結(jié)合。也可將具有抗癌活性的物質(zhì)封入膠束、脂質(zhì)體等載體，使該脂質(zhì)體與抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合。

上述具有抗癌活性的物質(zhì)為蛋白質(zhì)、多肽的情況下，可將編碼本發(fā)明的抗tmem-180抗體的核酸(后述)與編碼具有抗癌活性的物質(zhì)的dna連結(jié)，并插入合適的表達載體，由此作為具有抗癌活性的物質(zhì)與抗tmem-180抗體的融合蛋白質(zhì)而表達。

本說明書中，“抗癌劑”是指導(dǎo)致以下情況中的至少一種的物質(zhì)：腫瘤大小的縮小(延遲或終止)、對腫瘤轉(zhuǎn)移的阻礙、對腫瘤增殖的阻礙(延遲或終止)、及與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀的緩解。

本發(fā)明涉及的抗癌劑除了含有有效成分以外，還可含有藥學(xué)上允許的載體、添加物。

作為載體及添加物的例子，可舉出水、鹽水、磷酸緩沖液、葡萄糖、甘油、乙醇等藥學(xué)上允許的有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原酸膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、表面活性劑等，但不限于這些。

本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可制成各種形態(tài)，例如，液劑(例如注射劑)、分散劑、懸浮劑、片劑、丸劑、粉末劑、栓劑等。優(yōu)選形態(tài)為注射劑，并優(yōu)選以非口服的形式(例如，靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi))施予。

本發(fā)明的醫(yī)藥組合物對于表達tmem-180的癌癥的治療是有效的。表達tmem-180的癌癥包括大腸癌和腦腫瘤，但不限于此。

本發(fā)明還包含包括施予本發(fā)明涉及的抗癌劑的癌癥治療方法。

對于本發(fā)明的抗癌劑的施予量而言，例如，抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的施予量可以為0.025～50mg/kg，優(yōu)選為0.1～0mg/kg，更優(yōu)選為0.1～25mg/kg，進一步優(yōu)選為0.1～10mg/kg或0.1～3mg/kg的量，但不限于此。

本發(fā)明涉及的抗癌劑還可與其他的癌癥治療法組合。作為其他的癌癥治療法，可舉出前文記載的抗癌劑以外的抗癌劑的施予、放射線療法、外科手術(shù)、癌癥疫苗療法等。

本說明書中，所謂“癌癥疫苗療法”，是指通過向患者施予癌抗原、或?qū)碜杂诨颊叩拿庖呒毎隗w外用癌抗原刺激后輸回患者來提高患者自身對癌細胞的免疫力的癌癥治療方法或預(yù)防方法。作為可用于癌癥疫苗療法的癌抗原的一例，可使用來自于癌細胞特異性表達的蛋白質(zhì)的肽(癌抗原源肽)。

癌抗原源肽與樹突細胞等抗原呈遞細胞表面的人白細胞抗原(hla)分子結(jié)合，被呈遞至細胞毒性t細胞(ctl)，從而將ctl激活。被激活的ctl攻擊并排斥表達與該肽相同的抗原的癌細胞。hla分子的遺傳多樣性高，基因型因人而異。來自于特定的癌抗原蛋白質(zhì)、且具有與特定基因型的hla分子結(jié)合的可能性的肽的序列可利用已知的軟件等確定。

例如，來自于tmem-180蛋白質(zhì)、且具有與日本人中常見的hlaa2型或hlaa24型結(jié)合的可能性的肽如下(其是使用美國國立衛(wèi)生研究所bioinformaticsandmolecularanalysissection公開的hla肽結(jié)合預(yù)測(hlapeptidebindingpredictions)(http://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)來預(yù)測的)。表中“startpositions”是在序列號17所示的氨基酸序列中的位置。

通過使用了上述肽的癌癥疫苗療法，可以激活ctl對表達tmem-180蛋白質(zhì)的癌細胞的攻擊，因此，通過與以tmem-180作為靶標(biāo)的本發(fā)明涉及的抗癌劑聯(lián)合使用，能夠效率良好地攻擊癌細胞，實現(xiàn)對癌癥的預(yù)防或治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照已知的方法制備含有肽的癌癥疫苗組合物。

[表1-1]

[表1-2]

[表2]

(核酸)

本發(fā)明還包含編碼本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸。核酸可以是天然的核酸，也可以是人工的核酸，例如，可舉出dna、rna、dna與rna的雜合體，但不限于此。本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照已知方法或基于已知方法的方法來確定編碼抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸的堿基序列，并利用已知方法或基于已知方法的方法進行制備。

作為編碼本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸，例如，可舉出含有編碼抗tmem-180抗體克隆98的重鏈或輕鏈的dna的核酸、含有編碼抗tmem-180抗體克隆98的重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3中的任一者的dna的核酸、含有編碼抗tmem-180抗體克隆101的重鏈或輕鏈的dna的核酸、含有編碼抗tmem-180抗體克隆101的重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3中的任一者的dna的核酸、含有編碼抗tmem-180抗體克隆212的重鏈或輕鏈的dna的核酸、及含有編碼抗tmem-180抗體克隆212的重鏈cdr1～3及輕鏈cdr1～3中的任一者的dna的核酸，但不限于此。

(表達載體)

本發(fā)明涉及的表達載體含有編碼本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸。表達載體可根據(jù)使用的宿主細胞而適當(dāng)選擇，例如，可舉出質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(aav)載體、花椰菜花葉病毒載體、煙草花葉病毒載體等植物病毒載體、粘粒、yac、ebv來源的附加體等?？捎靡阎姆椒?利用限制性內(nèi)切酶的方法等)將編碼本發(fā)明的抗tmem-180抗體的核酸插入這些表達載體。

對于本發(fā)明涉及的表達載體而言，可以還含有調(diào)節(jié)抗體基因表達的啟動子、復(fù)制起點、選擇標(biāo)記基因等。啟動子及復(fù)制起點可根據(jù)宿主細胞和載體的種類適當(dāng)選擇。

(轉(zhuǎn)化體)

本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)化體含有本發(fā)明涉及的載體。轉(zhuǎn)化體可通過將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染至合適的宿主細胞而得到。作為宿主細胞，例如，可使用哺乳類細胞(cho細胞、cos細胞、骨髓瘤細胞、hela細胞、vero細胞等)、昆蟲細胞、植物細胞、真菌細胞(酵母屬、曲霉屬等)等真核細胞、大腸菌(e.coli)、枯草桿菌等原核細胞。

(抗體的制造方法)

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的制造方法不受限制，例如，對于抗tmem-180單克隆抗體而言，可通過以下方法獲得：從用tmem-180或其片段免疫的非人哺乳動物分離產(chǎn)生抗體的細胞，將其與骨髓瘤細胞等融合從而制備雜交瘤，并對該雜交瘤產(chǎn)生的抗體進行純化。另外，抗tmem-180多克隆抗體可從用tmem-180或其片段免疫的動物的血清中獲得。

用基因重組法制備本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體時，例如，可使用含有本發(fā)明涉及的核酸的表達載體來轉(zhuǎn)化合適的宿主，在合適的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體以使得抗體表達，并按照已知的方法對其進行分離純化。

作為分離純化方法，例如，可舉出使用了蛋白a等的親和柱、其他色譜柱、過濾器、超濾、鹽析、透析，可將這些方法適當(dāng)組合。

人嵌合抗體及人cdr移植抗體可通過以下方法制備：利用人以外的動物的產(chǎn)生抗體的雜交瘤的mrna將抗體基因克隆化，通過基因重組技術(shù)將其與人抗體基因的一部分連結(jié)。

例如，人型嵌合抗體的情況下，利用逆轉(zhuǎn)錄酶從產(chǎn)生小鼠抗體的雜交瘤的mrna合成cdna，通過pcr克隆重鏈可變區(qū)(vh)及輕鏈可變區(qū)(lh)，對序列進行分析。接著，從一致率高的抗體堿基序列來制備含有前導(dǎo)序列的5’引物，通過5’引物和可變部3’引物，利用pcr從上述cdna克隆從信號序列到可變區(qū)3’末端為止的序列。另一方面，克隆人igg1的重鏈及輕鏈的恒定區(qū)，針對重鏈和輕鏈分別將來自于小鼠抗體的可變區(qū)與來自于人抗體的恒定區(qū)通過利用了pcr的重疊懸掛(overlappinghanging)法連結(jié)，并進行擴增。將得到的dna插入合適的載體，對其進行轉(zhuǎn)化，從而得到人型嵌合抗體。

cdr移植抗體的情況下，選擇并克隆與使用的小鼠抗體可變部同源性最高的人抗體可變部，利用使用了megaprimer法的部位選擇性突變導(dǎo)入，來改變cdr的堿基序列。構(gòu)成框架區(qū)的氨基酸序列在人源化后無法實現(xiàn)與抗原的特異性結(jié)合的情況下，可將框架區(qū)的部分氨基酸從人型變換為大鼠型。

包含在原本的序列中具有1或2個氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列的cdr、包含與原本的序列具有x％以上的同一性的氨基酸序列的cdr可使用部位特異性突變導(dǎo)入法、隨機突變導(dǎo)入法、鏈替換法、cdr步移法等已知的方法制備。

本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，根據(jù)這些方法，利用噬菌體展示法將在cdr中具有各種突變的抗體或抗體片段呈遞至噬菌體表面，并使用抗原進行篩選，由此可得到親和性更為成熟的cdr(例如，wuetal.,pnas,95:6037-6042(1998)；schier,r.etal.,j.mol.bio.263:551-567(1996)；schier,r.etal.,j.mol.biol.255:28-43(1996)；yang,w.p.etal.,j.mol.biol.,254:392-403(1995))。本發(fā)明也包含含有利用這樣的方法成熟的cdr的抗體。

作為其他的抗體的制造方法，有利用來自于經(jīng)過曲古柳菌素a處理的雞b細胞的dt40細胞株得到產(chǎn)生抗體的細胞株的adlib法(seo,h.etal.,nat.biotechnol.,6:731-736,2002)、通過免疫破壞小鼠抗體基因且導(dǎo)入了人抗體基因的km小鼠來制備人抗體的方法(itoh,k.etal.,jpn.j.cancerres.,92:1313-1321,2001；koide,a.etal.,j.mol.biol.,284:1141-1151,1998)等，這些方法也可應(yīng)用于生產(chǎn)本發(fā)明涉及的抗體。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的抗原結(jié)合片段可用編碼該片段的dna通過上述方法實現(xiàn)表達，另外，也可在得到全長抗體后用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶處理，進行片段化。

對于本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體而言，氨基酸序列、分子量、等電點、糖鏈的有無、形態(tài)可能根據(jù)制備方法、純化方法的不同而不同。但是，只要得到的抗體具有與本發(fā)明的抗體同等的功能，則也包含在本發(fā)明中。例如，使本發(fā)明的抗體在大腸菌等原核細胞中表達的情況下，在原本的抗體的氨基酸序列n末端附加有甲硫氨酸殘基。這樣的抗體也包括在本發(fā)明中。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體為具有還原末端n-乙酰葡糖胺未結(jié)合巖藻糖的n-結(jié)合型糖鏈的抗體的情況下，該抗體可按照已知的方法或基于已知方法的方法來制造。該抗體的制造方法記載于例如國際公開第2002/031140號小冊子、日本特開2009-225781號公報中，其公開的全部內(nèi)容通過參考并入本說明書。

具體而言，可通過以下方法得到：例如，使用含有編碼本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的dna的載體，將與gdp-巖藻糖的合成相關(guān)的酶的活性、或α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性降低或欠缺的細胞轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體，然后純化作為目標(biāo)的抗tmem-180抗體。

作為與gdp-巖藻糖的合成相關(guān)的酶，例如，可舉出gdp-甘露糖4,6-脫水酶(gmp)、gdp-酮-6-脫氧甘露糖3,5-表異構(gòu)酶4-還原酶(fx)、gdp-β-l-巖藻糖焦磷酸化酶(gfpp)。

此處，細胞沒有特別限定，優(yōu)選哺乳動物細胞，可使用例如上述使酶活性降低或缺失的cho細胞。

盡管利用上述方法而得到的抗體組合物也可能含有在還原末端的n-乙酰葡糖胺上結(jié)合巖藻糖的抗體，但結(jié)合巖藻糖的抗體的比例為抗體總量的20重量％以下，優(yōu)選為10重量％以下，進一步優(yōu)選為5重量％以下，最優(yōu)選為3重量％以下。

另外，具有在還原末端的n-乙酰葡糖胺上不結(jié)合巖藻糖的n-結(jié)合型糖鏈的抗體可通過以下方法獲得：將含有編碼本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的dna的載體導(dǎo)入昆蟲卵，孵化并使昆蟲成長，根據(jù)需要進行交配來制備轉(zhuǎn)基因昆蟲，從該轉(zhuǎn)基因昆蟲或其分泌物中提取抗tmem-180抗體。作為昆蟲可使用蠶，該情況下，可從繭中提取抗體。

盡管利用該方法而得到的抗體組合物也可能含有在還原末端的n-乙酰葡糖胺上結(jié)合巖藻糖的抗體，但結(jié)合巖藻糖的抗體的比例為抗體總量的20重量％以下，優(yōu)選為10重量％以下，進一步優(yōu)選為5重量％以下，最優(yōu)選為3重量％以下。

(本發(fā)明的抗體的活性)

抗體醫(yī)藥的藥效機制基于抗體所具有的2種生物活性。一種為靶抗原特異性結(jié)合活性，即通過結(jié)合而中和靶抗原分子的功能的活性。靶抗原分子的功能的中和介由fab區(qū)發(fā)揮。

另一種為被稱為效應(yīng)器(effector)活性的抗體生物活性。效應(yīng)器活性介由抗體的fc區(qū)以抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity；adcc)、補體依賴性細胞毒性(complement-dependentcytotoxicity；cdc)、直接誘導(dǎo)凋亡等形式發(fā)揮。

本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體的活性可通過以下的方法來測定。

(1)結(jié)合活性

抗體的結(jié)合活性可通過已知的方法，例如，elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定)、eia(酶免疫測定法)、ria(放射免疫測定法)、熒光抗體法、facs法等進行測定。

(2)adcc活性

所謂adcc活性，是指本發(fā)明的抗體結(jié)合至靶細胞的細胞表面抗原時，其fc部分與具有fcγ受體的細胞(效應(yīng)器細胞)介由fcγ受體而結(jié)合，從而對靶細胞賦予不良影響的活性。

adcc活性可通過將表達tmem-180的靶細胞、效應(yīng)器細胞和本發(fā)明的抗體混合、并測定adcc的水平而得知。作為效應(yīng)器細胞，例如，可利用小鼠脾細胞、從人末梢血、骨髓中分離的單核細胞。作為靶細胞，可使用例如tmem-180陽性大腸癌粘膜細胞。將靶細胞預(yù)先用⁵¹cr等標(biāo)記，向其添加本發(fā)明的抗體并進行孵育，然后添加相對于靶細胞而言為合適的比例的效應(yīng)細胞并進行孵育。孵育后，采集上清液，可通過對上清液中的上述標(biāo)記進行計數(shù)，來測定adcc活性。

(3)cdc活性

所謂cdc活性，是指由補體系統(tǒng)導(dǎo)致的細胞毒活性。

cdc活性可通過在adcc活性的試驗中使用補體代替效應(yīng)器細胞來測定。

(4)腫瘤增殖抑制活性

腫瘤增殖抑制活性可利用腫瘤模型動物進行測定。例如，將腫瘤移植至小鼠的皮下，并施予本發(fā)明的抗體?？赏ㄟ^對非施予組和施予組中的腫瘤組織的體積進行比較，來測定腫瘤增殖抑制效果。

需要說明的是，本發(fā)明的腫瘤增殖抑制活性可以是導(dǎo)致抑制細胞個體的增殖的活性，也可以是導(dǎo)致誘導(dǎo)細胞死亡的活性。

(檢查方法及檢查用試劑盒)

如上所述，tmem-180僅在特定的癌細胞中表達。因此，本發(fā)明涉及的癌癥檢查方法包括對從受檢者采集的試樣中的tmem-180量進行測定的工序。

本說明書中，從受檢者采集的試樣可以是適合癌癥檢查的任選的試樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)癌癥種類適當(dāng)決定及采集?？膳e出例如血清、血漿、全血、尿、糞便、體腔液、組織，但不限于此。大腸癌檢查的情況下，可將經(jīng)由大腸內(nèi)窺鏡等從受檢者采集的組織、大腸內(nèi)窺鏡檢查后的清洗液中含有的粘膜細胞作為試樣。

一直以來，作為大腸癌標(biāo)志物，廣泛使用癌胚抗原(carcinoembryonicantigen；cea)。血漿cea值在經(jīng)過利用手術(shù)的癌切除等治療后降低，但伴隨復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而再度上升，因此，對cea值的測定被用于治療后的持續(xù)觀察。發(fā)現(xiàn)cea值的再度上升時，需要利用腹部超聲檢查、腹部ct進行精密檢查。但是，大腸癌患者中，cea值上升的情況僅有45％，對于cea值不上升的類型的癌癥患者而言，為了持續(xù)觀察必須每次接受精密檢查。

與此相對，如后述的實施例所示，在cea值未上升的患者中也發(fā)現(xiàn)了血漿tmem-180值上升，并且術(shù)后較之術(shù)前而言降低。進而，還發(fā)現(xiàn)血漿tmem-180值在術(shù)后暫時降低，在復(fù)發(fā)時顯著上升。尤其是在復(fù)發(fā)時cea值未上升的患者中也確認到上升。因此，可認為其是能夠在癌癥患者中廣泛使用、且有用性極高的標(biāo)志物。

本發(fā)明涉及的癌癥檢查方法可用于癌癥的診斷，另外，也可在術(shù)后等治療后的持續(xù)觀察中用于對復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的確認。

本說明書中，對于“對試樣中的tmem-180量進行測定的工序”而言，不僅包括對tmem-180的量進行測定的工序，也包括檢測tmem-180量的有無的工序、確定tmem-180量的增減的工序、與其他的試樣中的tmem-180量進行比較的工序。

試樣中的tmem-180量的測定可使用用于測定試樣中的特定的蛋白質(zhì)含量的任意的方法進行，例如，可舉出免疫分析(包括凝集法、比濁法)、western印跡法、表面等離子共振(spr)法等，但不限于此。其中，使用抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段的免疫分析是簡便且有用的。

由于tmem-180為膜蛋白質(zhì)，因此，也可用市售的細胞溶解緩沖液、非離子性表面活性劑、膜蛋白質(zhì)可溶化試劑等進行處理，將膜蛋白質(zhì)可溶化后測定其量。

免疫分析使用以能夠檢測的方式標(biāo)記的抗tmem-180抗體、及/或以能夠檢測的方式標(biāo)記的、針對抗tmem-180抗體的抗體(二抗體)。根據(jù)抗體的標(biāo)記法，分類為酶免疫分析(eia或elisa)、放射免疫分析(ria)、熒光免疫分析(fia)、熒光偏振免疫分析(fpia)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(clia)、熒光酶免疫分析(fleia)、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(cleia)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析(eclia)等，上述中的任一種均可用于本發(fā)明的方法中。

elisa法中，使用以過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體，ria法中，使用以¹²⁵i、¹³¹i、³⁵s、³h等放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗體，fpia法中，使用以熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、丹磺酰氯、藻紅蛋白、四甲基羅丹明異硫氰酸酯、近紅外熒光材料等熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗體，clia法中，使用以熒光素酶、熒光素、水母發(fā)光蛋白(aequorin)等發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的抗體。此外，也可對用膠體金、量子點等納米粒子標(biāo)記的抗體進行檢測。

另外，免疫分析中，還可用生物素標(biāo)記抗tmem-180抗體，并使其與經(jīng)酶等標(biāo)記的親和素或鏈親和素結(jié)合來檢測。

免疫分析中，使用酶標(biāo)記的elisa法可以簡便迅速地測定抗原。

elisa法包括競爭法和夾心法。競爭法中，在微孔板等固相載體上固定抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段，添加試樣和經(jīng)酶標(biāo)記的tmem-180，引發(fā)抗原抗體反應(yīng)。洗滌后，與酶底物反應(yīng)，使其顯色，測定吸光度。試樣中的tmem-180越多則顯色越弱，試樣中的tmem-180越少則顯色越強，因此，可使用校正曲線求出tmem-180量。

夾心法中，在固相載體上固定抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段，添加試樣，使其反應(yīng)后，進一步添加用酶標(biāo)記的識別其他的表位的抗tmem-180抗體并進行反應(yīng)。洗滌后，使其與酶底物反應(yīng)并顯色，測定吸光度，由此可求出tmem-180量。夾心法中，也可在使固定在固相載體上的抗體與試樣中的tmem-180反應(yīng)后添加非標(biāo)記抗體(一抗)，再添加經(jīng)酶標(biāo)記的針對該未標(biāo)記抗體的抗體(二抗)。

對于酶底物而言，酶為過氧化物酶的情況下，可使用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(dab)、3,3’5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)、鄰苯二胺(opd)等，為堿性磷酸酶的情況下，可使用對硝基苯磷酸鹽(p-nitrophenyphosphate,npp)等。

或者，也可以將試樣中的tmem-180抗原直接固定在微量滴定板等固相載體上，實施必需的封閉后，添加非標(biāo)記抗體(一抗)，再添加經(jīng)酶標(biāo)記的針對該非標(biāo)記抗體的抗體(二抗)。

本說明書中，“固相載體”只要是能夠固定抗體的載體則沒有特別限定，可舉出玻璃制、金屬性、樹脂制等的微量滴定板、基板、珠、硝化纖維膜、尼龍膜、pvdf膜等，靶物質(zhì)可按照已知的方法固定在這些固相載體上。

另外，免疫分析中，作為可以簡便地檢測微量蛋白質(zhì)的方法，凝集法是優(yōu)選的。作為凝集法，例如，可舉出使抗體與乳膠粒子結(jié)合的乳膠凝集法。

使乳膠粒子與抗tmem-180抗體結(jié)合、并與經(jīng)過適當(dāng)處理的試樣混合，若存在tmem-180，則抗體結(jié)合乳膠粒子會凝集。因此，可通過使用近紅外光照射試樣、通過基于吸光度的測定(比濁法)或基于散射光的測定(散射比濁法)對凝集塊加以定量，來求出抗原的濃度。

作為抗tmem-180抗體或其抗體結(jié)合片段，也可使用具有上述的cdr序列的本發(fā)明涉及的抗tmem-180抗體或其抗體結(jié)合片段。

本發(fā)明涉及的癌癥的檢查用試劑盒是用于使用上述的檢查方法來進行癌癥檢查的試劑盒，其包含抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明涉及的癌癥檢查用試劑盒中，除了包含抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段以外，還可包含利用免疫分析對試樣中的tmem-180量進行測定所必需的試劑、裝置。

檢查用試劑盒的一種實施方式包含：用于利用夾心法測定tmem-180的微量滴定板；捕捉用的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段；經(jīng)堿性磷酸酶或過氧化物酶標(biāo)記的抗tmem-180抗體或其抗原結(jié)合片段；及，堿性磷酸酶底物(npp等)或過氧化物酶的底物(dab、tmb、opd等)。

捕捉用抗體和標(biāo)記抗體識別不同的表位。

這樣的試劑盒中，首先，將捕捉用抗體固定在微量滴定板上，將試樣適當(dāng)稀釋并添加至滴定板中后進行孵育，然后除去試樣進行洗滌。接著，添加經(jīng)標(biāo)記的抗體并進行孵育，添加底物并使其顯色?？赏ㄟ^使用微量滴定板檢測儀等對顯色進行測定，來求出tmem-180量。

檢查用試劑盒的另一種實施方式是用于使用二抗、利用夾心法測定tmem-180的試劑盒，其包含：微量滴定板；捕捉用的抗tmem-180抗體；作為一抗的抗tmem-180抗體；作為二抗的、用堿性磷酸酶或過氧化物酶標(biāo)記的抗tmem-180抗體；及，堿性磷酸酶(npp等)或過氧化物酶的底物(dab、tmb、opd等)。

捕捉用抗體和一抗識別不同的表位。

這樣的試劑盒中，首先，將捕捉用抗體固定在微量滴定板上，將試樣適當(dāng)稀釋并添加至滴定板中后孵育，然后除去試樣進行洗滌。接下來，添加一抗進行孵育及洗滌，進而添加經(jīng)過酶標(biāo)記的二抗進行孵育，然后添加底物使其顯色。通過使用微量滴定板檢測儀等測定顯色，可求出tmem-180量。通過使用二抗，反應(yīng)被放大，從而能夠提高檢測靈敏度。

檢查用試劑盒還可進一步包含必需的緩沖液、酶反應(yīng)終止液、微孔板檢測儀等。

標(biāo)記抗體不限于酶標(biāo)記的抗體，也可以是用放射性物質(zhì)(²⁵i、¹³¹i、³⁵s、³h等)、熒光物質(zhì)(熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、丹磺酰氯、藻紅蛋白、四甲基羅丹明異硫氰酸酯、近紅外熒光材料等)、發(fā)光物質(zhì)(熒光素酶、熒光素、水母發(fā)光蛋白等)、納米粒子(膠體金、量子點)等標(biāo)記的抗體。另外，也可將生物素化抗體用作標(biāo)記抗體，并向試劑盒中添加經(jīng)標(biāo)記的親和素或鏈親和素。

作為檢查用試劑盒的另一種實施方式，可舉出利用乳膠凝集法測定tmem-180量的試劑盒。該試劑盒含有抗tmem-180抗體增敏乳膠(sensitizationlatex)，將試樣和抗tmem-180抗體混合，利用光學(xué)方法對凝集塊進行定量。試劑盒優(yōu)選包含將凝集反應(yīng)可視化的凝集反應(yīng)板。

本說明書中引用的所有專利文獻及非專利文獻的全部內(nèi)容通過并入本說明書。

實施例

以下，基于實施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不被這些實施例以任何方式限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在不脫離本發(fā)明宗旨的情況下將本發(fā)明變更為各種方式，這些變更也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

1.tmem-180分子的鑒定

1)dna微陣列分析

使用來自于5種人大腸癌細胞株(ht29、sw480、lovo、hct116、dld-1)和2種健康人源游離大腸細胞的mrna各10μg。按照制造商(affymetrix)的說明，利用rna經(jīng)由雙鏈cdna合成被生物素標(biāo)記的crna。在片段化后，與genechiphumangenomeu133plus2.0array(affymetrix)進行雜交。使用genechipscanner30007g(affymetrix)掃描，在取得cel數(shù)據(jù)后進行統(tǒng)計處理，算出各試樣的信號值。選出在5種人大腸癌細胞株確認到表達、并且在2種健康人大腸細胞中確認不到表達的tmem-180作為大腸癌細胞特異性表面標(biāo)志物(圖1a)。

2)定量pcr法

針對5名大腸癌患者的手術(shù)標(biāo)本，以相鄰的正常大腸組織作為陰性對照，用abi7500fast(appliedbiosystems)對大腸癌細胞組織試樣cdna(clontech)進行分析。20μl反應(yīng)液中，使用10μl的2xtaqmanfastuniversalpcrmastermix(appliedbiosystems)、1μl的20xtaqmangeneexpressionassay(appliedbiosystems)。另外，在快速運行(fastrun)模式下以amplitaqgoldenzyme啟動溫度(activation)95℃、20秒、40個循環(huán)；變性溫度95℃、3秒；退火/延伸溫度(anneal/extend)62℃、30秒來進行。用7500fastsystemsds軟件ver.1.3進行分析。對于各病例，計算大腸癌組織中的rna量相對于正常組織中的rna量之比，結(jié)果示于圖1b。在任一例病例中均確認到tmem-180在大腸癌組織中的表達比正常大腸組織更強。

3)原位雜交法

將大腸癌組織石蠟切片(genostaffco.ltd.)用二甲苯脫蠟處理后，用乙醇、pbs進行水合處理。將切片在4％多聚甲醛·pbs中固定15分鐘。用含有7μg/ml蛋白酶k(roche)的pbs處理后，在4％多聚甲醛·pbs中再次固定。用0.25％乙酸酐0.1mtrishclph8.0進行乙酰化。用pbs洗滌后，在乙醇中脫水。于60℃與300ng/ml用地高辛(digoxigenin)標(biāo)記的tmem-180的rna探針(475bp,genebank登記號碼nm_024789的基因序列第1314～1789位，genostqaffco.ltd.)進行16小時的雜交反應(yīng)。在洗滌后用50μg/ml的rnasea·10mmtrishclph8.0·0.1mnacl·1mmedta處理。再次洗滌后，使用0.5％封閉反應(yīng)液(roche)進行反應(yīng)，之后添加20％熱處理羊血清(sigma)，在封閉反應(yīng)液中反應(yīng)1小時。添加ap標(biāo)記抗dig抗體(roche)，于室溫進行2小時的反應(yīng)。洗滌后，在nbt/bcip液(roche)中顯色。包埋后用顯微鏡進行觀察的結(jié)果示于圖1c及d。確認到tmem-180在5種大腸癌組織中全部為陽性，在正常大腸粘膜中為陰性。

2.tmem-180在正常組織中的表達分析

利用公共數(shù)據(jù)庫paxdb(蛋白質(zhì)豐度綜合數(shù)據(jù)庫，http://pax-db.org/#！home，通過利用lc/ms/ms分析各蛋白質(zhì)的特異性肽測定其表達水平)，以tmem-180進行檢索，調(diào)查了在各正常組織中的測定值。除了tmem-180以外，作為對照也調(diào)查了以下的分子的表達。

β肌動蛋白(βact)(持家分子)

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)(持家分子)

上皮生長因子受體(egfr)(抗體藥物的靶分子)

her2(抗體藥物的靶分子)

癌胚抗原(cea)(代表性的腫瘤分子標(biāo)志物)

將數(shù)據(jù)輸入excel(2010，microsoft)文檔制作圖表，結(jié)果示于圖2。tmem-180在正常情況下幾乎不表達(圖2a)，提高靈敏度后發(fā)現(xiàn)在血小板中有微量的表達，但遠遠低于作為現(xiàn)有抗體藥物靶分子的egfr、her2(圖2b)，由此確認了tmem-180在癌組織中的特異性表達。

3.抗體制備及針對各種癌細胞的facs

1)抗原制備

[pcr反應(yīng)]

對于并入pet21b中的tag序列，使用以下的引物實施pcr擴增。

使用的pcr酶：primestarhsdna聚合酶(takarar010a)

免疫抗原1制備用引物序列

(i)

cagacctgcacctgaacgtggttgagagctgaggaattgacggtcactgagggactgtaatgctgcacttcgc(序列號18)

(ii)

caaccacgttcaggtgcaggtctgtcttcacgtgctgttgtactggctcgtgttcaagagttcaaactggaggacctg(序列號19)

(iii)gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc(序列號20)

(iv)tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg(序列號21)

免疫抗原2制備用引物序列

(i)

gcgaagtgcagcattacagtccgatcatctgagtctgctgtgcctcttcattgc(序列號22)

(ii)

caggtcctccagtttgaactcagaagctgcttgcttacgatgattcagcaccaggtcctcgtctac(序列號23)

(iii)gagatatacatatgtcggaggtgactcgtagtc(序列號24)

(iv)tggtgctcgagaataggctgaacatcaaatg(序列號25)

[限制性內(nèi)切酶處理]

對于表達用載體pet21b及pcr產(chǎn)物，按照制造商的方案使ndei(takara)、xhoi(takara)反應(yīng)2小時，實施1％瓊脂糖凝膠電泳后，使用promegawizardsvgelandpcrclean-upsystem試劑盒純化。

[連接反應(yīng)]

使用ligationhigh(toyobo)，使載體與插入片段反應(yīng)30分鐘。

[轉(zhuǎn)化]

使用competenthighdh5α(toyobo)進行轉(zhuǎn)化，在lb培養(yǎng)基(50μg/ml)平板中培養(yǎng)。

[基因確認]

從轉(zhuǎn)化的大腸菌中提取質(zhì)粒，進行序列分析，確認目的序列。

[轉(zhuǎn)化(大腸菌)]

用插入了目的序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化bl21(de3)。

[培養(yǎng)]

接種至10ml的lb培養(yǎng)基，將于37℃培養(yǎng)16小時后的培養(yǎng)基移至1l的lb培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)。在od600nm的值達到0.6時，將iptg以最終濃度成為1mm的方式添加，再培養(yǎng)4小時。

[純化]

將經(jīng)菌體破碎的大腸菌的沉淀懸浮于50mmtris-hcl,500mmnacl,6mgdnhcl中，回收振蕩16小時后的試樣的上清液，用鎳柱純化。

[重折疊(refolding)]

目的抗原由于溶解在6mgdnhcl中而變性，因此，通過透析法進行了重折疊(蛋白質(zhì)的重新折疊)。

關(guān)于重折疊的條件，按照以下步驟進行。

(1)50mmtris-hclph8.5,500mmnacl,1mmedta,1mmdtt,3mgdnhcl；6小時

(2)50mmtris-hclph8.5,500mmnacl,1mmedta,1mmdtt,2mgdnhcl；6小時

(3)50mmtris-hclph8.5,500mmnacl,1mmedta,1mmdtt,1mgdnhcl；12小時

(4)50mmtris-hclph8.5,500mmnacl,1mmedta,1mmdtt,0.5mgdnhcl；12小時

(5)50mmtris-hclph8.5,150mmnacl,50mml-arg；6小時

(6)50mmtris-hclph8.5,150mmnacl,50mml-arg；6小時

對上述的試樣使用超濾膜(amicon-ultra10k)，置換為50mm磷酸緩沖液ph8.0,500mmnacl。

[cd測定]

為了確認重折疊后的免疫抗原是否保持了立體結(jié)構(gòu)，使用圓二色性分散儀(日本分光j-725)，確認了螺旋含量接近理論值。

2)抗體制備

將用pbs稀釋為100μg/ml的免疫抗原1或免疫抗原2與弗氏完全佐劑(freundcompleteadjuvant)以1：1混合，向大鼠(日本slc，wister，雌性，6～8周齡)尾根部兩腋處分別施予100μl制備的乳劑。使用在免疫12天～13天后從大鼠尾靜脈采血制備的抗血清，通過將免疫抗原固相化的elisa或利用dld-1細胞及k562細胞的流式細胞術(shù)來評價血清抗體效價，選擇用于細胞融合的個體。從在免疫14天后選擇的個體中摘出骼淋巴結(jié)、鼠蹊淋巴結(jié)、腋下淋巴結(jié)及膝下淋巴結(jié)，用peg法將淋巴結(jié)細胞與小鼠骨髓瘤細胞p3x63融合。在融合10天～14天后回收培養(yǎng)上清液，用流式細胞術(shù)選擇在dld-1細胞中呈現(xiàn)陽性、且在k562細胞中呈現(xiàn)陰性的產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞。選擇的產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞通過有限稀釋法單克隆化，建立細胞株。通過亞型特異性elisa(bethyl)判定抗體的亞型。

單克隆化后的克隆株為克隆98、克隆101、克隆212(以上為igm抗體)、克隆129、克隆382、克隆1361(以上為igg抗體)、克隆669、克隆699、克隆1052、克隆1105(以上為igm抗體)。

3)流式細胞術(shù)

將作為測定對象的癌細胞懸浮于培養(yǎng)基中，以成為1×10⁵個/孔的方式添加至v底96孔板(corning)。將板于440×g、4℃離心3分鐘后，除去上清液，向細胞沉淀以50μl/孔添加產(chǎn)生抗體的雜交瘤的培養(yǎng)上清液或抗體溶液，進行懸浮。在冰上反應(yīng)45分鐘后，用200μl/孔的0.1％bsa/2mmedta/pbs洗滌3次。除去上清液，向細胞沉淀添加50μl/孔的二抗，進行懸浮。作為二抗，使用了將alexafluor647山羊抗大鼠igg(h-l)(lifetechnologies)用0.1％bsa/2mmedta/pbs稀釋為400倍的抗體。在冰上反應(yīng)45分鐘后，用200μl/孔的0.1％bsa/2mmedta/pbs洗滌3次。除去上清液，向細胞沉淀添加250μl/孔的50ng/ml碘化丙啶/0.1％bsa/2mmedta/pbs，進行懸浮。使用guavaeasycyte8ht(merckmillipore)等流式細胞儀測定這樣染色的細胞，用flowjo(tomydigitalbiologyco.,ltd.)分析得到的數(shù)據(jù)。在facs中，使用大腸癌、腦腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤進行了分析。

利用獲得的抗tmem-180igm抗體進行facs分析的結(jié)果示于圖3?？寺?8在全部6種大腸癌細胞及全部4種腦腫瘤細胞中為陽性，克隆101在4種大腸癌細胞中為陽性、在腦腫瘤細胞中全部為陰性?？寺?12在全部6種大腸癌細胞中為陽性，僅在1種腦腫瘤細胞中為陽性。對于血液系統(tǒng)腫瘤，所有克隆均為陰性。

4.dld-1大腸癌細胞的熒光免疫染色

將dld-1細胞以成為5×10³個/孔的方式添加至96孔板(corning，cellbind)，培養(yǎng)2天后，供于細胞染色。細胞的固定/透過處理通過以下方式進行。用200μl/孔的pbs洗滌細胞培養(yǎng)板2次后，除去洗滌液，在冰冷下添加100μl/孔的4％多聚甲醛·磷酸緩沖液(wako)(添加有0.1％量的tritonx-100(wako))，固定10分鐘。除去固定液，用200μl/孔的pbs洗滌一次，用200μl/孔的1％fbs/pbs洗滌一次，制成細胞固定板。細胞染色通過以下方式實施。從未固定的細胞培養(yǎng)板除去培養(yǎng)基，從細胞固定板除去洗滌液，以50μl/孔添加產(chǎn)生抗體的雜交瘤的培養(yǎng)上清液或抗體稀釋液。在冰上反應(yīng)1小時后，用200μl/孔的pbs洗滌1次，用200μl/孔的1％fbs/pbs洗滌2次。除去洗滌液，以50μl/孔添加5μg/ml的alexafluor647山羊抗大鼠igg(h-l)/2μg/mlhoechst33342/1％fbs/pbs。在冰上反應(yīng)1小時后，用200μl/孔的pbs洗滌2次。添加50μl/孔的pbs，通過arrayscan(thermoscientific)進行測定。

基于抗tmem-180igm抗體的克隆98、101及212的熒光免疫染色結(jié)果示于圖4?？寺?8主要為膜被染色。克隆101、212與克隆98相比熒光強度較弱，細胞質(zhì)也被染色。

5.利用抗tmem-180抗體對dld-1母株和tmem-180基因敲除株進行的facs

1)基因敲除細胞的制備

[轉(zhuǎn)染]

以0.5ml的opti-mem(invitrogen)稀釋2.5ug的sigmacrispr/cas9system(hs0000468201)質(zhì)粒，添加11ul的lipofectionamineltx。于室溫靜置30分鐘后，向dld1細胞(6.25x10⁵個細胞/孔6孔板(corning))添加制備的dna-lipofection溶液。

[gfp表達細胞的選擇]

對于在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2天而得到的細胞，使用facsaria細胞分選儀(bd)，僅獲取gfp表達細胞。

[克隆]

培養(yǎng)gfp表達細胞，確認gfp不再表達后，在96孔板中無限稀釋。針對細胞的克隆為單一的孔，用purelinkgenomicdnaminikit(invitrogen)對基因組進行純化，確認目的序列，判定基因敲除細胞。

2)流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)的步驟基于前文所述的3.。對于作為一抗的大鼠igm抗體克隆98而言，將產(chǎn)生抗體的雜交瘤的培養(yǎng)上清液稀釋為1μg/ml使用。作為陰性對照，將產(chǎn)生克隆356大鼠igm抗體的雜交瘤的培養(yǎng)上清液稀釋為1μg/ml使用克隆98。針對大鼠-人嵌合抗體，將恒定表達嵌合抗體的細胞的培養(yǎng)上清液稀釋2倍使用。作為陽性對照，分別使用了稀釋為1μg/ml的大鼠抗人組織因子(tissuefactor)抗體克隆htf1849、大鼠抗人epcam抗體克隆b8-4、小鼠抗人cd44v6抗體克隆2f10(mbl)、小鼠-人嵌合抗egfr抗體(商品名為erbitux)。各抗體的稀釋使用rpmi/fbs10％來進行。需要說明的是，雜交瘤培養(yǎng)上清液中的抗體濃度通過大鼠igm特異性elisa(bethyl)測定。另外，根據(jù)一抗的來源，作為二抗，將alexafluor647山羊抗大鼠igg(h-l)、alexafluor647山羊抗人igg(h+l)或alexafluor647山羊抗小鼠igg(h+l)(lifetechnologies)中的任一種用0.1％bsa/2mmedta/pbs稀釋400倍而使用。

3)人嵌合抗體的制備

從雜交瘤細胞株提取總rna，使用smarterracecdna擴增試劑盒(takara)，用5’末端race(cdna末端快速擴增)法合成抗體h鏈的可變區(qū)和l鏈的可變區(qū)的cdna。

針對合成的cdna，通過pcr進行擴增，克隆進puc19(invitrogen)。h鏈的可變區(qū)及l(fā)鏈的可變區(qū)示于后文揭載的表3～22。

通過pcr擴增h鏈及l(fā)鏈的可變區(qū)后，將h鏈的可變區(qū)插入已組入恒定區(qū)的pqcxip(clontech)，將l鏈的可變區(qū)插入已組入恒定區(qū)的pqcxih(clontech)，完成表達載體。使用lipofectamine2000(invitrogen)將表達載體轉(zhuǎn)染至293t細胞。用10μg/ml嘌呤霉素(sigma)和1mg/ml潮霉素b(invitrogen)進行藥物篩選，獲得雙重耐藥性株，從而構(gòu)建人型抗tmem-180抗體恒定表達細胞株。構(gòu)建的細胞株用dmem(sigma)10％fbs、1％青霉素·鏈霉素(invitrogen)、10μg/ml嘌呤霉素、1mg/ml潮霉素b進行維持培養(yǎng)。

使用克隆98大鼠igm抗體和人嵌合igg抗體，對大腸癌dld-1的母株和tmem-180基因敲除株進行facs。結(jié)果示于圖5?？寺?8大鼠igm抗體及人嵌合igg抗體均在基因敲除細胞中呈現(xiàn)了顯著的左方位移。作為對照而使用了抗組織因子抗體、抗epcam抗體、抗cd44v6抗體、抗egfr抗體的facs中，母株和基因敲除株沒有差異。這表明，克隆98大鼠igm抗體和人嵌合igg抗體均特異性地識別tmem-180。

6.人大腸癌手術(shù)標(biāo)本福爾馬林固定切片的利用抗tmem-180抗體的免疫染色

對于大腸癌福爾馬林固定石蠟切片，使1μg/ml的抗tmem-180igm大鼠抗體(克隆98)與之反應(yīng)。二抗使用hrp標(biāo)記的抗大鼠抗體，用dab顯色，用蘇木精實施后染色。結(jié)果示于圖6。大腸癌細胞被特異性染色。大腸癌細胞除了膜以外，細胞質(zhì)也被染色。

7.抗tmem-180igm抗體的細胞殺傷效果

向96孔板添加1×10³個/100μl/孔的dld-1細胞以及k562細胞，培養(yǎng)24小時。從96孔板的各孔移除50μl培養(yǎng)基。以50μl/孔添加抗體濃度配制成80μg/ml、20μg/ml、5μg/ml的產(chǎn)生大鼠igm抗體克隆98的雜交瘤的培養(yǎng)上清液或產(chǎn)生1大鼠igm抗體克隆10的雜交瘤的培養(yǎng)上清液。需要說明的是，各培養(yǎng)條件的n數(shù)量為3，作為對照，準(zhǔn)備了僅添加了培養(yǎng)基的孔。培養(yǎng)96小時后，添加10μl/孔的wst-8(同仁化學(xué)，cellcountingkit-8)，在培養(yǎng)3小時后用微孔板檢測儀測定450nm的吸光度。以抗體濃度作為橫軸，以僅添加了培養(yǎng)基的孔的吸光度為1，基于各抗體濃度的吸光度的相對值繪圖。結(jié)果示于圖7及圖8。克隆98和克隆101均僅對于大腸癌dld-1細胞呈現(xiàn)了細胞殺傷效果，對于血液腫瘤k562未呈現(xiàn)細胞殺傷效果。對于其他的大腸癌細胞difi、car1、sw480、colo201也確認到細胞殺傷效果。另外，對于腦腫瘤細胞ln229及乳腺癌細胞mcf7也確認到同樣的效果。由此預(yù)見到，對于除了血液腫瘤以外的極廣范圍的癌癥具有效果。

8.各克隆的可變部基因序列和cdr的確定

1)總rna的提取

使用rneasyminikit(qiagen)從各產(chǎn)生抗體的雜交瘤提取總rna。

2)cdna的制備

使用上述中得到的總rna，使用smarterracecdna擴增試劑盒(takara)用5’末端race(cdna末端快速擴增)法合成cdna。

3)抗tmem-180抗體基因的克隆

對于上述的cdna，使用primestarhsdna聚合酶(takara)擴增目的基因。使用了降落(touchdown)pcr法，擴增條件為：變性98℃、10秒；退火/延伸72℃、90秒、5循環(huán)；變性98℃、10秒；退火67℃、5秒；延伸2℃、90秒、5循環(huán)；變性98℃、10秒；退火62℃、5秒；延伸72℃、90秒、25循環(huán)。

pcr裝置：takarapcrthermalcyclerdicegradient

使用的引物序列

h鏈用

正向引物：

ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt(序列號26)

正向引物：ctaatacgactcactatagggc(序列號27)

反向引物：cccatggccaccarattctyatcagacag(序列號28)

l鏈用

正向引物：

ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt(序列號29)

正向引物：ctaatacgactcactatagggc(序列號30)

反向引物：gttgttcawgargcacacgactgaggca(序列號31)

使用t4多聚核苷酸激酶(t4polynucleotidekinase)(takara)將擴增的h鏈及l(fā)鏈的pcr產(chǎn)物磷酸化。使用ligationhigh(toyobo)試劑將經(jīng)過磷酸化的pcr產(chǎn)物插入在smai位點切割后的puc19(invitrogen)。插入后，轉(zhuǎn)化至dh5α(toyobo)，使用plasmidminikit(qiagen)從單克隆提取質(zhì)粒。

4)基因的分析

使用abiprism3100geneticanalyzer分析克隆的h鏈、l鏈各基因的基因堿基序列。各克隆的h鏈可變區(qū)及l(fā)鏈可變區(qū)的序列示于表3～22。

克隆98h鏈(序列號13)

[表3]

克隆98l鏈(序列號14)

[表4]

克隆101h鏈(序列號15)

[表5]

克隆101l鏈(序列號16)

[表6]

克隆212h鏈(序列號46)

[表7]

克隆212l鏈(序列號47)

[表8]

克隆129h鏈(序列號54)

[表9]

克隆129l鏈(序列號55)

[表10]

克隆382h鏈(序列號62)

[表11]

克隆382l鏈(序列號63)

[表12]

克隆1361h鏈(序列號70)

[表13]

克隆1361l鏈(序列號71)

[表14]

克隆669h鏈(序列號78)

[表15]

克隆669l鏈(序列號79)

[表16]

克隆699h鏈(序列號86)

[表17]

克隆699l鏈(序列號87)

[表18]

克隆1052h鏈(序列號94)

[表19]

克隆1052l鏈(序列號95)

[表20]

克隆1105h鏈(序列號102)

[表21]

克隆1105l鏈(序列號103)

[表22]

9.測定tmem-180量的癌癥檢查方法

1)elisa方案

首先，用于以下實施例的elisa法的方案如下所示。

(試劑)

使用了以下的試劑。

(步驟)

按照以下的步驟進行。

(i)抗原固相化

向96孔板添加50μl/孔的細胞培養(yǎng)液上清液或人血漿(稀釋為1/10和1/50)，于4℃孵育過夜。

(ii)封閉

利用200μl/孔的板洗滌液，將完成固相化的板反復(fù)洗滌5次。用200μl/孔的封閉液封閉，于室溫孵育1小時。

(iii)一抗反應(yīng)

利用200μl/孔的板洗滌液，將完成固相化的板反復(fù)洗滌5次。添加100μl/孔、10μg/ml的igm98抗體溶液，于室溫孵育1小時。

(iv)二抗反應(yīng)

利用200μl/孔的板洗滌液，將完成固相化的板反復(fù)洗滌5次。添加100μl/孔、稀釋4000倍的二抗溶液，于室溫孵育1小時。

(v)顯色·終止

利用200μl/孔的板洗滌液，將完成固相化的板反復(fù)洗滌5次。添加100μl/孔的顯色液，于室溫孵育15分鐘。添加100μl/孔的終止液。

(vi)測定

反應(yīng)終止后，測定450nm的吸光度。

2)癌細胞培養(yǎng)上清液中的tmem-180蛋白質(zhì)含量的測定

培養(yǎng)大腸癌細胞dld-1株的tmem-180強制表達株、母株、及tmem-18基因敲除株，在成為大致匯合的狀態(tài)時，用pbs洗滌。置換為無血清dmem培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，在次日回收培養(yǎng)上清液。將該上清液作為試樣抗原在96孔板上固相化，按照1)的方法實施elisa。另外，使用腦腫瘤株ln229進行了同樣的實驗。

結(jié)果示于圖9。與正常(僅含有培養(yǎng)基)對照相比，tmem-180在全部試樣中均呈現(xiàn)了高值。在大腸癌dld-1中，按照強制表達株、母株、基因敲除株的順序依次呈現(xiàn)了高值。在腦腫瘤細胞中也呈現(xiàn)了高值。

3)大腸癌iv期患者血漿中的tmem-180蛋白質(zhì)含量的測定

將edta采血的人血漿(4例iv期和正常)稀釋為1/10和1/50后，將其作為試樣抗原在96孔板上固相化，按照1)的方法實施elisa。

結(jié)果示于圖10。與正常血漿相比，在全部患者試樣中均呈現(xiàn)了高值。另外，在為cea陰性的#2患者和#4患者中，血漿tmem-180呈現(xiàn)陽性(高于正常試樣的值)。

4)大腸癌iii期患者的術(shù)前·術(shù)后的血漿中tmem-180蛋白質(zhì)含量的測定

通過與3)同樣的方法，針對大腸癌iii期患者的術(shù)前術(shù)后的血漿，測定了tmem-180蛋白質(zhì)含量。

結(jié)果示于圖11。全部患者中，與術(shù)前相比，tmem-180值在術(shù)后降低。

5)測定iii期、ii期、iv期、及iiia期的大腸癌患者的手術(shù)前后、及復(fù)發(fā)時的血漿中tmem-180蛋白質(zhì)含量和大腸癌腫瘤標(biāo)志物cea。tmem-180的測定通過使用克隆669和克隆1361的夾心elisa法進行。tmem-180的臨界值(cutoff)采用通過與患者試樣同樣的elisa法測得的8人份的正常血漿中值的平均值。cea的臨界值采用國立研究開發(fā)法人國立癌癥研究中心采用的正常值。

結(jié)果示于圖12。ii期的患者中，術(shù)前cea值為陰性，與此相對，tmem-180呈現(xiàn)陽性。另外，iiia期的患者中，在通過ct確認到復(fù)發(fā)的時間點，cea值依然為陰性，但tmem-180再次上升。

需要說明的是，用于5)的實施例的夾心elisa法的方案如下所示。

(試劑)

使用了以下的試劑。

(步驟)

按照以下的步驟進行。

(i)固相化

將固相化抗體克隆669用0.1m磷酸緩沖液稀釋，向96孔板添加50μl/孔的稀釋溶液，于4℃孵育過夜。

(ii)封閉

利用200μl/孔的板洗滌液，將完成固相化的板反復(fù)洗滌3次。用200μl/孔封閉液封閉，于室溫孵育30分鐘以上。

(iii)添加抗原

利用200μl/孔的板洗滌液，將完成固相化的板反復(fù)洗滌3次。向固相化完成的板添加50μl/孔的測定試樣，于室溫孵育1小時。

(iv)標(biāo)記抗體反應(yīng)

利用200μl/孔的板洗滌液，將完成固相化的板反復(fù)洗滌3次。將使用規(guī)定的方法制備的生物素標(biāo)記的克隆1361用稀釋液稀釋，向96孔板添加50μl/孔的稀釋溶液，于室溫孵育1小時。

(v)鏈親和素hrp反應(yīng)

利用200μl/孔的板洗滌液，將完成固相化的板反復(fù)洗滌3次。添加50μl/孔的鏈親和素hrp稀釋溶液，于室溫孵育1小時。

(vi)顯色·終止

利用200μl/孔的板洗滌液，將完成固相化的板反復(fù)洗滌3次。添加100μl/孔的顯色液，于室溫孵育20分鐘。添加50μl/孔的終止液。

(vii)測定

反應(yīng)終止后，測定450nm的吸光度。

序列表自由文本

序列號1～3分別表示克隆98的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號4～6分別表示克隆98的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號7～9分別表示克隆101的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號10～12分別表示克隆101的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號13及14分別表示克隆98的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號15及16分別表示克隆101的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號17表示人tmem-180蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

序列號18～21分別表示免疫抗原1制備用引物(i)～(iv)。

序列號22～25分別表示免疫抗原2制備用引物(i)～(iv)。

序列號26～31表示在抗tmem-180抗體基因的克隆中使用的引物。

序列號40～42分別表示克隆212的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號43～45分別表示克隆212的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號46及47分別表示克隆212的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號48～50分別表示克隆129的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號51～53分別表示克隆129的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號54及55分別表示克隆129的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號56～58分別表示克隆382的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號59～61分別表示克隆382的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號62及63分別表示克隆382的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號64～66分別表示克隆1361的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號67～69分別表示克隆1361的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號70及71分別表示克隆1361的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號72～74分別表示克隆669的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號75～77分別表示克隆669的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號78及79分別表示克隆669的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號80～82分別表示克隆699的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號83～85分別表示克隆699的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號86及87分別表示克隆699的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號88～90分別表示克隆1052的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號91～93分別表示克隆1052的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號94及95分別表示克隆1052的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號96～98分別表示克隆1105的重鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號99～101分別表示克隆1105的輕鏈cdr1～3的氨基酸序列。

序列號102及103分別表示克隆1105的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

序列號104～150表示通過hla肽結(jié)合預(yù)測(hlapeptidebindingpreditions)而預(yù)測的與hlaa2型結(jié)合的源于tmem-180肽的氨基酸序列。

序列號151～170表示通過hla肽結(jié)合預(yù)測而預(yù)測的與hlaa24型結(jié)合的源于tmem-180肽的氨基酸序列。