發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在引發(fā)針對登革病毒感染的免疫應(yīng)答的組合物，其可用于預(yù)防和/或治療對象中的登革病毒感染，和/或其臨床表現(xiàn)。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2014年12月22日提交的美國臨時申請?zhí)?2/095,331的權(quán)益，該申請以其整體通過引用并入本文。對電子提交的序列表的引用本申請的序列表作為ascii格式的序列表，經(jīng)由efs-web電子提交，其文件名為“23913wopctseq.txt”，創(chuàng)建日期為2015年11月23日，并且大小為17.5kb。efs-web提交的該序列表是說明書的一部分，且以其整體通過引用并入本文。發(fā)明背景黃病毒科包括原型黃熱病毒(yf)、四種血清型的登革病毒(denv-1、denv-2、denv-3和denv-4)、日本腦炎病毒(je)、蜱傳腦炎病毒(tbe)、西尼羅病毒(wn)、圣路易斯腦炎病毒(sle)和約70種其他引起疾病的病毒。黃病毒是含有單一正鏈rna基因組的小的包膜病毒。十種基因產(chǎn)物由單一開放閱讀框編碼且翻譯為以如下順序組織的多蛋白：衣殼(c)，“膜前體”(premembrane，prm，其在病毒粒子從細(xì)胞釋放前才被加工成“膜”(m))，“包膜”(e)，隨后為非結(jié)構(gòu)(ns)蛋白ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5(綜述于chambers,t.j.等人,annualrevmicrobiol(1990)44:649-688;henchal,e.a.和putnak,j.r.,clinmicrobiolrev.(1990)3:376-396)。然后，通過由宿主以及病毒編碼的蛋白酶介導(dǎo)的精確加工事件產(chǎn)生各個黃病毒蛋白。黃病毒的包膜源自宿主細(xì)胞膜且含有病毒編碼的膜錨定的膜(m)和包膜(e)糖蛋白。e糖蛋白是最大的病毒結(jié)構(gòu)蛋白且含有負(fù)責(zé)細(xì)胞表面附著和內(nèi)體-內(nèi)融合(intra-endosomalfusion)活性的功能結(jié)構(gòu)域。其也是宿主免疫系統(tǒng)的主要目標(biāo)，誘導(dǎo)病毒中和抗體的產(chǎn)生，這與保護(hù)性免疫相關(guān)。登革病毒通過伊蚊屬的蚊子：主要是埃及伊蚊(a.aegypti)和白紋伊蚊(a.albopictus)傳播給人。登革病毒的感染導(dǎo)致各種臨床表現(xiàn)，范圍為從不明顯的或輕度的發(fā)熱疾病，經(jīng)典型登革熱(df)，到登革出血熱/登革休克綜合征(dhf/dss)。登革熱特征在于高燒、頭痛、關(guān)節(jié)和肌肉疼痛、皮疹、淋巴結(jié)病和白細(xì)胞減少(gibbons,r.v.和d.w.vaughn,britishmedicaljournal(2002)324:1563-1566)。dhf/dss是更常見于兒童中的更嚴(yán)重的感染形式，標(biāo)志為血管通透性和/或嚴(yán)重出血表現(xiàn)，范圍為從存在瘀點和瘀斑至自發(fā)性嚴(yán)重出血和深度休克。在沒有診斷和及時醫(yī)療干預(yù)的情況下，如果不治療，dhf/dss的突然發(fā)病和快速進(jìn)展可以是致命的。在全球發(fā)病率和死亡率的方面，登革病毒是最顯著的一組的節(jié)肢動物傳播病毒，估計每年發(fā)生一億例登革感染，包括至少3600萬例登革熱和250,000至500,000例dhf/dss(gubler,d.j.,clin.microbiol.rev.(1998)11:480-496;gibbons,同上)。隨著全球人口的增加，人口的城市化(特別是在整個熱帶地區(qū))，和持續(xù)蚊子控制措施的缺乏，登革病的蚊子載體已經(jīng)將它們的分布擴(kuò)散遍及熱帶、亞熱帶和一些溫帶地區(qū)，給超過一半世界人口帶來了登革感染的風(fēng)險。現(xiàn)代飛機旅行和人類遷徙已經(jīng)促進(jìn)了登革血清型的全球分布，使得多種登革血清型現(xiàn)在在許多地區(qū)是地方性流行的。在過去20或更多年，已存在登革流行頻率和dhf/dss發(fā)病率的增加。例如，在東南亞，dhf/dss是兒童中住院和死亡的主要因素(gubler,同上;gibbons和vaughn,同上)。迄今為止，黃病毒疫苗的開發(fā)成敗參半(mixedsuccess)。為了產(chǎn)生保護(hù)免于由黃病毒引起的疾病的候選疫苗，已經(jīng)實施了4種基本方法：活減毒病毒、滅活的完整病毒、重組亞單位蛋白和基于dna的疫苗。用于黃熱病毒的活減毒疫苗已經(jīng)使用了數(shù)十年，并且更近地，用于日本腦炎的活減毒疫苗已在世界多國得到注冊。對于tbe和je病毒，已經(jīng)證明了滅活的完整病毒疫苗的使用，并且?guī)追N注冊產(chǎn)品是可用的。heinz等人flavivirusandflavivirusvaccines.vaccine30:4301-06(2012)。盡管上文著重介紹的yf、je、和tbe疫苗取得了成功，但使用活減毒病毒和滅活的病毒方法來開發(fā)登革病毒的疫苗已經(jīng)遇到了顯著挑戰(zhàn)。存在四種血清型的登革病毒(denv1、denv2、denv3和denv4)且發(fā)現(xiàn)各血清型的毒株傳播遍及整個世界的登革流行地區(qū)。自然感染為感染的血清型賦予持久的免疫力，但對非其他登革血清型則沒有。當(dāng)一種血清型的登革病毒感染繼之以另一種血清型的第二次感染時，在第二次登革感染后最經(jīng)常發(fā)生更嚴(yán)重形式的疾病(dhf/dss)。已經(jīng)假設(shè)dhf和dss與第二次登革感染的更頻繁關(guān)聯(lián)是由于一種病毒類型感染誘導(dǎo)的非中和抗體增強第二種登革病毒類型的感染性(抗體依賴性增強-ade)。迄今為止，臨床測試的大多數(shù)疫苗是活減毒疫苗。非復(fù)制型疫苗候選物的使用也在探索中。例如，ivy等人(美國專利6,432,411)公開了包含den1-480%e(對應(yīng)于denv-2包膜多肽的氨基酸1-395的den1-4的肽區(qū)域)蛋白的四價亞單位疫苗。ivy等人(同上)還報道了包含denv1-480%e和iscomatrix?佐劑的組合物。coller等人(wo2012/154202)公開了包含den1-4的den1-480%e的四價制劑。滅活的病毒也可以用作潛在的疫苗候選物或用作有效疫苗的組分(putnak等人vaccine23:4442–4452(2005),us6190859,us6254873和sterner等人wo2007/002470)。國際專利申請?zhí)杙ct/us14/042625(wo/2014/204892)中公開了包含活減毒登革病毒疫苗和非復(fù)制型登革疫苗的組合物。然而，盡管先前作出努力來開發(fā)登革疫苗，但迄今沒有目前注冊的登革疫苗。因此，仍然需要可以誘導(dǎo)針對登革感染和/或登革相關(guān)疾病的保護(hù)性免疫應(yīng)答的穩(wěn)定、安全且有效的疫苗。發(fā)明概述本發(fā)明涉及登革病毒疫苗組合物，其包含藥學(xué)上有效量的(a)包含至少一種活減毒登革病毒(lav)或至少一種活減毒嵌合黃病毒(lacv)的活減毒登革疫苗，其中l(wèi)av和lacv包含病毒基因組，其含有對應(yīng)于3'非翻譯(utr)區(qū)域的tl-2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的約30個核苷酸的缺失；這降低病毒的復(fù)制能力，和(b)非復(fù)制型登革疫苗。發(fā)現(xiàn)非復(fù)制型登革疫苗與活減毒疫苗在相同的組合物中的存在不顯著影響活病毒活力，從而允許活的和非復(fù)制型疫苗在相同制劑(“共同制劑”)中施用。在一些實施方案中，非復(fù)制型登革疫苗選自重組登革亞單位疫苗、dna疫苗、綴合物疫苗或滅活登革疫苗。在進(jìn)一步實施方案中，非復(fù)制型登革疫苗是重組登革亞單位疫苗或滅活登革疫苗。在本發(fā)明的一些實施方案中，非復(fù)制型登革疫苗是重組登革亞單位疫苗，其包含至少一種登革包膜(e)蛋白或其片段。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，重組登革亞單位疫苗是四價的，且包含截短的登革e蛋白，其各自由登革病毒(“denv”，或者“den”)血清型1(又名denv1)、denv2、denv3和denv4的野生型e的從其n-末端的氨基酸殘基1開始的長度的約80％組成。在本發(fā)明的額外實施方案中，活減毒登革疫苗是四價lav或“l(fā)atv”(即包含來自denv1-4的活減毒登革病毒，或如本文所定義的來自denv1-4的活減毒嵌合黃病毒，或其組合，其中l(wèi)av或lacv中的至少一種是δ30lav或δ30lacv)。在本發(fā)明的額外實施方案中，活減毒登革疫苗是四價的且包含至少一種嵌合黃病毒；其中所述嵌合黃病毒包含病毒基因組，其含有編碼單一登革病毒血清型的prm和e蛋白的核苷酸序列和編碼不同黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列，其中所述嵌合黃病毒被減毒。在本發(fā)明的一些實施方案中，嵌合黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白來自與prm和e蛋白不同的登革血清型。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，活減毒登革疫苗是包含den1δ30病毒、den2/4δ30病毒(den4骨架上的den2δ30lacv)、den3δ30病毒和den4δ30病毒的活減毒四價疫苗。參見圖1。本發(fā)明還涉及包含活減毒登革疫苗、重組登革亞單位疫苗和佐劑的登革病毒疫苗組合物，其中活減毒登革疫苗包含至少一種δ30lav或δ30lacv。在本文所述的一些實施方案中，所述佐劑是鋁鹽佐劑。在替代實施方案中，所述佐劑是基于皂苷的佐劑或toll樣受體激動劑佐劑。本發(fā)明的其他方面包括預(yù)防登革感染或預(yù)防或改善其癥狀的方法，其包括向有此需要的患者施用藥學(xué)有效量的本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物。在本發(fā)明的該方面的額外實施方案中，所述組合物以引發(fā)/加強的方案施用，其中將第一劑量的組合物施用于有此需要的患者，允許過去預(yù)定量的時間，且向患者施用第二劑量的組合物?？梢栽诟鲃┝恐g已經(jīng)過去預(yù)定量的時間之后任選地向患者施用額外劑量。在額外實施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)針對登革感染的免疫應(yīng)答、從而降低登革感染的可能性的方法，其包括以下步驟：(a)混合第一登革疫苗和第二登革疫苗以形成登革病毒疫苗組合物，其中所述第一登革疫苗是包含登革血清型1-4的活減毒病毒(lav)或具有針對登革血清型1-4的免疫原性的活減毒嵌合黃病毒(lacv)或其組合的活減毒四價登革疫苗；其中至少一種lav或lacv是δ30lav或δ30lacv；其中所述第二登革疫苗是重組四價登革亞單位疫苗或滅活的四價登革疫苗；且其中所述重組四價登革亞單位疫苗包含登革血清型1-4的登革包膜(e)蛋白或其片段；(b)在混合之后將步驟(a)的登革病毒疫苗組合物施用于其中待誘導(dǎo)針對登革病的免疫應(yīng)答的患者，從而降低登革感染的可能性。在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，免疫應(yīng)答預(yù)防登革感染或預(yù)防或改善其癥狀。在本發(fā)明的額外實施方案中，在允許過去預(yù)定量的時間之后，向患者施用第二劑量的組合物。組合物的第二劑量的第一登革疫苗和第二登革疫苗可以配制于單一小瓶或兩個分開的小瓶中，且在施用于患者之前混合在一起。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物用于治療或預(yù)防與登革感染相關(guān)的疾病(諸如登革熱、dss或dhf)的用途。如說明書通篇和所附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)的指代，除非上下文另有清楚指出的。除非上下文明確指明所示可能性之一，提及“或”表明任一或兩種可能性。在一些情況下，“和/或”用于突出任一或兩種可能性。如說明書通篇和所附權(quán)利要求中所使用，適用以下定義和縮寫：本文中也稱為“l(fā)av”的術(shù)語“活減毒病毒”意指活減毒登革病毒，其中與野生型登革病毒相比，病毒引起疾病的能力降低。術(shù)語“活減毒嵌合病毒”(或者“活減毒嵌合黃病毒”)或“l(fā)acv”是指活減毒嵌合病毒，其中病毒基因組包含第一黃病毒的骨架(包括c、ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5基因)和第二黃病毒的前膜(prm)和包膜(e)基因，其中第二黃病毒選自denv1、denv2、denv3或denv4。第一黃病毒可以是不同的登革血清型或另一黃病毒，諸如黃熱病毒。術(shù)語“δ30lav”是指活減毒den1、den2、den3或den4病毒，其中l(wèi)av包含病毒基因組，其含有對應(yīng)于從約nt143至約nt172的3'非翻譯(utr)區(qū)域的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的約30個核苷酸(nt)的缺失，這降低病毒的復(fù)制能力(參見wo03/092592)。術(shù)語“δ30lacv”是指來自denv1-4的活減毒嵌合黃病毒(lacv)，其中l(wèi)acv包含病毒基因組，其含有對應(yīng)于從約nt143至約nt172的3'utr區(qū)域的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的約30nt的缺失，這降低病毒的復(fù)制能力(參見wo03/092592)。術(shù)語“δ30/δ31lav”是指活減毒den1、den2、den3或den4病毒，其中病毒基因組包含3'utr的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的約30nt的缺失，并且進(jìn)一步包含3'utr的約31nt的單獨、不連續(xù)的上游缺失，其去除直到且包括tl-3同源結(jié)構(gòu)的序列，使得缺失延伸遠(yuǎn)至登革3'utr的tl-3同源結(jié)構(gòu)的5'邊界。參見whitehead等人,美國專利號8,337,860。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，den3lav包含δ30/δ31突變。術(shù)語“δ30/δ31lacv”是指如上所述的活減毒嵌合den1、den2、den3或den4病毒，其中嵌合病毒的病毒基因組包含3'utr的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失，并且進(jìn)一步包含使tl-3結(jié)構(gòu)缺失的3'utr的單獨、不連續(xù)的上游31nt缺失，如上所述。術(shù)語“l(fā)atv”或“活減毒四價病毒”或“l(fā)atv疫苗”是指包含有效量的den1lav或lacv、den2lav或lacv、den3lav或lacv，和den4lav或lacv的疫苗，其中登革lav或lacv中的至少一種包含3'utr中的tl-2結(jié)構(gòu)的δ30突變，如上文和wo03/092592中所述。在一些優(yōu)選實施方案中，latv包含以下特征：(1)rden1δ30，其為denv1lav，其中denv1病毒基因組包含對應(yīng)于3'utr中的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失；(2)rden2/4δ30，其為在denv4骨架上包含denv2prm和e基因的denv2lacv，其中den4骨架包含對應(yīng)于3'utr中的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30-nt缺失；(3)rden3δ30/δ31，其為denv3lav，其中denv3病毒基因組包含對應(yīng)于3'utr中的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失和對應(yīng)于3'utr的tl-3結(jié)構(gòu)的單獨、不連續(xù)的上游31nt缺失；和(4)rden4δ30，其為denv4lav，其中denv4病毒基因組包含對應(yīng)于3'utr中的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失(參見圖1)。“非復(fù)制型疫苗”是指用于預(yù)防或治療登革病毒感染或其臨床癥狀的登革病毒疫苗，其選自重組亞單位疫苗、滅活疫苗、綴合物疫苗或dna疫苗?！皽缁钜呙纭笔侵赴行Я康臍绲幕驘o活性的完整登革病毒和藥學(xué)上可接受的載體的疫苗，其中所述病毒通過任何方式(包括用化學(xué)品、熱或輻射)滅活。滅活疫苗在滅活之后具有低殘余感染性，例如滅活之后的<5噬斑形成單位(pfu)/ml。在優(yōu)選的實施方案中，在滅活之后存在非常少量的殘余感染性，例如<4pfu/ml、<3pfu/ml、或<2pfu/ml、<1pfu/ml、<0.5pfu/ml、或<0.1pfu/ml。特定疫苗的pfu可以，例如，通過使用噬斑測定、免疫染色測定或本領(lǐng)域中已知用于檢測病毒感染性的其他方法來測定?！熬Y合物疫苗”是指包含共價連接至載體蛋白的登革抗原的疫苗?！癲na疫苗”是包含編碼登革蛋白抗原(包括登革蛋白、登革蛋白片段和登革融合蛋白及其變體)的核苷酸序列的疫苗。dna疫苗包含質(zhì)粒(例如dna或病毒質(zhì)粒)，其含有可操作連接至啟動子的編碼目的抗原的核苷酸序列?！皝唵挝灰呙纭笔侵赴ㄒ环N或多種登革抗原成分(但不是完整登革病毒)，諸如登革免疫原性表位、登革蛋白、登革抗原融合蛋白(包括不同登革血清型抗原的融合體)或登革蛋白片段的疫苗。如本文所使用的亞單位疫苗可以是單價的(包含單一登革抗原)或多價的(包含多于一種抗原組分)。在優(yōu)選的實施方案中，所述亞單位疫苗是四價的。術(shù)語“共同制劑引發(fā)-加強”是指這樣的治療方案，其包括(1)向有此需要的患者施用登革病毒疫苗組合物，其中所述組合物包含(a)至少一種活減毒登革病毒(lav)或活減毒嵌合黃病毒(lacv)，其中l(wèi)av或lacv包含在病毒基因組的3'非翻譯區(qū)域中的δ30突變，且其中l(wèi)acv的病毒基因組包含單一登革病毒血清型的prm和e基因以及不同黃病毒的c和非結(jié)構(gòu)基因，(b)非復(fù)制型登革疫苗，和(c)藥學(xué)上可接受的載體；(2)等待經(jīng)過預(yù)定量的時間；和(3)向患者施用如上所述的第二登革病毒疫苗組合物。在一些實施方案中，非復(fù)制型登革疫苗是亞單位疫苗或滅活疫苗。第二登革病毒疫苗組合物可以與第一登革病毒疫苗組合物相同或不同，只要其包含根據(jù)本發(fā)明的活減毒登革疫苗和非復(fù)制型登革疫苗。本發(fā)明的組合物中使用的登革病毒疫苗可用于在人患者中誘導(dǎo)針對同源登革病毒的病毒中和抗體應(yīng)答。術(shù)語“治療”是指治療性治療和預(yù)防或防止措施?！靶枰敝委煹膫€體或患者包括已經(jīng)具有登革感染的那些，無論是否表現(xiàn)任何臨床癥狀，以及處于登革感染的風(fēng)險中的那些。用本發(fā)明的登革疫苗組合物或共同制劑治療患者包括以下的一種或多種：在患者中誘導(dǎo)/增加針對登革病的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)針對一種或多種登革病毒的病毒中和抗體應(yīng)答，在已經(jīng)被登革感染的患者中預(yù)防、改善、消除或降低登革病的臨床表現(xiàn)的可能性，預(yù)防或降低發(fā)生登革熱、dhf、或dss和/或與登革感染相關(guān)的其他疾病或并發(fā)癥的可能性，降低登革感染和/或與登革相關(guān)的其他疾病或并發(fā)癥的臨床癥狀的嚴(yán)重性或持續(xù)時間，和預(yù)防或降低登革感染的可能性。術(shù)語“藥學(xué)有效量”或“有效量”意指將足夠的疫苗組合物引入患者以產(chǎn)生期望效果，包括，但不限于：在患者中誘導(dǎo)/增加針對登革病的免疫應(yīng)答，在患者中誘導(dǎo)/增加針對登革病的病毒中和抗體應(yīng)答，預(yù)防或降低登革感染的可能性，預(yù)防或降低登革反復(fù)感染的可能性，在已經(jīng)感染登革病的患者中預(yù)防、改善或消除登革感染的臨床表現(xiàn)，預(yù)防登革熱、dhf和/或dss，或降低與登革相關(guān)的疾病的嚴(yán)重性或持續(xù)時間。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到該水平可以變化。術(shù)語“免疫應(yīng)答”是指細(xì)胞介導(dǎo)的(t-細(xì)胞)免疫應(yīng)答和/或抗體(b細(xì)胞)應(yīng)答。術(shù)語“患者”是指待接受本文所述的登革疫苗組合物/共同制劑的能夠被登革病毒(例如den1、den2、den3或den4)感染的哺乳動物，包括具有免疫活性的和免疫低下的個體。在優(yōu)選實施方案中，所述患者是人。如本文所定義，“患者”包括已經(jīng)感染登革病的那些，無論是通過自然感染或接種，或者可能隨后暴露的那些?！癿aa”是指merck鋁佐劑。maa是無定形羥基磷酸鋁硫酸鹽佐劑?！癷scom樣佐劑”是包含免疫刺激復(fù)合物(iscom)(其由皂苷、膽固醇和磷脂構(gòu)成，它們一起形成特征性的籠狀顆粒)的佐劑，其具有促成其功能的獨特球形、籠狀結(jié)構(gòu)(對于綜述，參見barr和mitchell,immunologyandcellbiology74:8-25(1996))。該術(shù)語既包括iscom?佐劑(其用抗原產(chǎn)生并且在iscom?顆粒內(nèi)包含抗原)，還包括iscom?基質(zhì)佐劑(其是在沒有抗原的情況下產(chǎn)生的中空的iscom型佐劑)。在本文提供的組合物和方法的優(yōu)選實施方案中，iscom型佐劑是iscom?基質(zhì)顆粒佐劑，如iscomatrix?，其在沒有抗原的情況下制造(iscom?和iscomatrix?是澳大利亞帕克維爾csllimited的注冊商標(biāo))。名稱“rden1δ30-1545”是指重組登革1病毒，其中病毒基因組包含(1)3'utr的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失和(2)在核苷酸位置1545的取代，其在病毒適應(yīng)于在vero細(xì)胞中生長之后發(fā)生。名稱“rden2/4δ30(me)-1495,7163”是指重組嵌合登革2/4病毒，其中病毒基因組包含：(1)登革4骨架(c、ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5基因)，其包含(i)3'utr的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失和(ii)在核苷酸位置1495和7163的取代，其在病毒適應(yīng)于在vero細(xì)胞中生長之后發(fā)生，和(2)登革2prm和e基因。名稱“rden3δ30/31-7164”是指重組登革3病毒，其中病毒基因組包含：(1)3'utr的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失，(2)δ30突變上游的3'utr中的單獨的31nt缺失，其缺失tl-3結(jié)構(gòu)，和(3)在核苷酸位置7164的取代，其在病毒適應(yīng)于在vero細(xì)胞中生長之后發(fā)生。名稱“rden4δ30-7132,7163,8308”是指重組登革4病毒，其中病毒基因組包含：(1)3'utr的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失和(2)在核苷酸位置7132、7163和8308的取代，其在病毒適應(yīng)于在vero細(xì)胞中生長之后發(fā)生。“v180”是指由來自4種登革病毒血清型(denv1、denv2、denv3和denv4)的每一種的截短的包膜糖蛋白(den-80e)構(gòu)成的四價亞單位疫苗，其中所述e蛋白各自構(gòu)成從野生型e的n-末端的氨基酸殘基1開始的長度的約80％，使得所述e蛋白當(dāng)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)時可分泌至生長培養(yǎng)基中。參見coller等人wo2012/154202。以下縮寫在本文中使用，且具有以下含義：c是登革衣殼基因，den(或denv)是登革病毒，df是登革熱，dhf是登革出血熱，dss是登革休克綜合征，h是小時，gmt是幾何平均滴度，im是肌內(nèi)，imx是iscomatrix?，je是日本腦炎，lav是活減毒病毒，maa是merck鋁佐劑，mapa是merck磷酸鋁佐劑，ns(用于ns1-ns5中)是非結(jié)構(gòu)的，nt是核苷酸，pfu是噬斑形成單位，prm是登革前膜基因，sc是皮下，tbe是蜱傳腦炎，utr是非翻譯區(qū)域，wn(或wnv)是西尼羅病毒，yf(或yfv)是黃熱病毒，且wt是野生型。附圖簡述圖1提供了實施例1-3中使用的δ30latv(δ30四價活減毒登革病毒疫苗)的組成的示意圖。圖2顯示了混合所示佐劑和亞單位登革抗原對上文和實施例1中所述的δ30latv中的登革病毒1型(圖中的“rden1δ30”柱)、登革病毒2型(“rden2/4δ30”柱)、登革病毒3型(“rden3δ30”柱)和登革病毒4型(“rden4δ30”柱)的病毒活力的影響。如實施例2中所述使用vero細(xì)胞上的體外噬斑測定法，測定病毒活力(報告為以pfu/ml計的病毒滴度)。顯示了與在4℃下儲存24小時之后的相同混合物相比，每種樣品的初始時間點(0小時)的值。圖3提供了在第4周(劑量1后4周，參見實施例3)，在恒河猴中誘導(dǎo)的登革血清型中和抗體滴度(licor50gmt)。研究中使用的免疫時間表和制劑顯示于表2中。使用如實施例3中所述的基于licor的微量中和測定法，測定免疫滴度。圖4提供了在第20周(劑量2后4周，參見實施例3)，在其數(shù)據(jù)提供于圖3中的相同恒河猴中誘導(dǎo)的登革血清型中和抗體滴度(licor50gmt)。圖5提供了對于實施例3中描述的所有組的denv1、denv2、denv3和denv4的縱向幾何平均中和滴度。圖6提供了在第4周(劑量1后4周，參見實施例4)，在恒河猴中誘導(dǎo)的登革血清型中和抗體滴度(licor50gmt)。研究中使用的免疫時間表和制劑顯示于表3中。使用如實施例3中所述的基于licor的微量中和測定法，測定免疫滴度。圖7提供了在第28周(劑量2后4周，參見實施例4)，在其數(shù)據(jù)提供于圖6中的相同恒河猴中誘導(dǎo)的登革血清型中和抗體滴度(licor50gmt)。圖8提供了對于實施例4中描述的所有組的denv1、denv2、denv3和denv4的縱向幾何平均中和滴度。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及登革病毒疫苗組合物，其包含藥學(xué)上有效量的(a)包含至少一種活減毒登革病毒(lav)或至少一種活減毒嵌合黃病毒(lacv)的活減毒登革疫苗，其中l(wèi)av和lacv包含病毒基因組，其含有對應(yīng)于3'非翻譯(utr)區(qū)域的tl-2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的約30個核苷酸的缺失，這降低病毒的復(fù)制能力，且其中l(wèi)acv的病毒基因組包含編碼單一登革病毒血清型的prm和e蛋白的核苷酸序列和編碼不同黃病毒的c和非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列；和(b)非復(fù)制型登革疫苗，任選地還包含佐劑。將lav或lacv和第二疫苗配制于相同的小瓶或分開的小瓶中且在施用于對象之前混合在一起。在本發(fā)明的實施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的組合物在引發(fā)-加強治療方案中兩次或更多次施用于患者。包括在一個時間點施用活減毒疫苗、隨后在2周至2年后施用非復(fù)制型登革疫苗的常規(guī)的異源引發(fā)-加強方案是可以使用的一種替代方法，但該方法可引起應(yīng)當(dāng)在系列中首先施用何種疫苗(活減毒疫苗或非復(fù)制型疫苗)的混淆。以適當(dāng)順序施用活減毒疫苗和非復(fù)制型疫苗是重要的，因為反轉(zhuǎn)順序(首先亞單位或滅活疫苗，隨后為活減毒疫苗)可導(dǎo)致劣等免疫應(yīng)答，如果人們變得自然感染，則所述劣等免疫應(yīng)答可增加對其患更嚴(yán)重的登革病的風(fēng)險。因此，將活減毒疫苗和非復(fù)制型疫苗共施用于患者簡化了完整治療方案的施用。據(jù)認(rèn)為，(1)活減毒疫苗和(2)非復(fù)制型疫苗的共同制劑，當(dāng)在引發(fā)-加強方案中施用時，疫苗將引起強烈的免疫應(yīng)答，其在引發(fā)時主要由活疫苗驅(qū)動且在加強時主要由非復(fù)制型疫苗驅(qū)動。在本發(fā)明之前，據(jù)認(rèn)為，亞單位抗原或滅活疫苗和/或佐劑在包含活減毒病毒的登革疫苗組合物中的存在具有滅活活減毒病毒、導(dǎo)致病毒滴度降低的潛力。minke等人(vaccine29(2011)4608-4612和veterinaryimmunol.andimmunopathol.111(2006)47-57)以及guthrie等人(vaccine27(2009)4434-4438)報道了配制于卡波姆佐劑中的表達(dá)衍生自wnv的prm/e基因的修飾的活重組金絲雀痘病毒。然而，該疫苗組合物不含分離的病毒亞單位抗原。已經(jīng)測試了在引發(fā)-加強策略中使用不同的登革病毒疫苗。simmons等人(virology396280-288(2010)；美國專利號8,440,202和美國專利號8,241638)通過用滅活疫苗或基于dna的疫苗的形式的非復(fù)制型疫苗引發(fā)動物、隨后用四價活減毒疫苗加強，在恒河猴中測試登革病的引發(fā)加強方法。kanakatte等人(wo2008127307)也描述了針對登革病的異源引發(fā)加強方案，其使用包含dna表達(dá)系統(tǒng)、腺病毒表達(dá)載體或委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒復(fù)制子系統(tǒng)的引發(fā)免疫原和包含四價活減毒疫苗的加強免疫原的。在該方法中，在施用引發(fā)免疫原的兩周和2個月之間施用加強免疫原。guy等人(wo2008/047023)報道了在患者中誘導(dǎo)針對den1-4的保護(hù)的方法，其包括：施用(a)第一系列的(i)一劑量的第一血清型的疫苗登革病毒和一劑量的第二血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量的第三血清型的疫苗登革病毒和一劑量的第四血清型的疫苗登革病毒的施用，和(b)第二系列的劑量(i)和(ii)的施用，其中劑量(i)和(ii)在分離的解剖部位同時施用，并且其中第二系列在第一系列之后至少30天至至多12個月執(zhí)行。因此，針對登革病的引發(fā)/加強方法的先前報道集中于使用lav作為加強免疫原，且要求在施用引發(fā)組合物和施用lav之間經(jīng)過數(shù)周至數(shù)個月的一段時間。我們在本文中已經(jīng)顯示，令人驚訝地，劑量1后四周用本發(fā)明的組合物(共同制劑)(δ30latv+v180)免疫的恒河猴中測量的幾何平均中和滴度與當(dāng)單獨給予δ30latv疫苗時誘導(dǎo)的那些相當(dāng)(參見實施例3)。這表明δ30latv疫苗與v180亞單位疫苗和alhydrogel?佐劑的共同制劑不負(fù)面影響對第一劑量的活減毒病毒疫苗的響應(yīng)。本文中進(jìn)一步顯示，與單獨的δ30latv疫苗相比，常規(guī)的引發(fā)加強(δ30latv引發(fā)，隨后為v180加強)和共同制劑引發(fā)加強方法(δ30latv+v180共同制劑引發(fā)，隨后為δ30latv+v180共同制劑加強)誘導(dǎo)針對所有四種denv類型的更好的中和滴度。與接受常規(guī)的引發(fā)-加強方案的組中誘導(dǎo)的中和應(yīng)答相比，在加強劑量后四周時的共同制劑組中的中和應(yīng)答是等效的，如果不是更好的話。這表明，δ30latv疫苗與v180亞單位疫苗和alhydrogel?佐劑的共同制劑不負(fù)面影響對所述亞單位加強的應(yīng)答。因此，異源引發(fā)/加強方法的益處可以通過如下實現(xiàn)：(a)將第一登革疫苗組合物施用于有此需要的患者，所述組合物包含：(1)活減毒登革疫苗，其中活減毒登革疫苗包含至少一種包含病毒基因組的lav或lacv，其中所述病毒基因組包含對應(yīng)于3'utr中的tl-2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的約30個核苷酸的缺失，和(2)非復(fù)制型登革疫苗；(b)允許經(jīng)過預(yù)定量的時間；和(3)將第二登革病毒疫苗組合物施用于患者。在本發(fā)明的一些實施方案中，非復(fù)制型疫苗選自亞單位登革疫苗和滅活登革疫苗。在該實施方案中，將本發(fā)明的登革疫苗組合物作為引發(fā)和加強組合物施用于患者。在本發(fā)明的實施方案中，第一登革疫苗組合物和第二登革疫苗組合物是相同的。在替代實施方案中，第一登革疫苗組合物和第二登革疫苗組合物是不同的。因此，本發(fā)明涉及預(yù)防或降低登革感染的可能性，或預(yù)防、治療或改善其臨床表現(xiàn)的方法，所述方法包括：(a)將第一登革病毒疫苗組合物施用于有此需要的患者，(b)在步驟(a)之后等待經(jīng)過預(yù)定量的時間；和(c)向患者施用第二登革病毒疫苗組合物，其中第一和第二登革病毒疫苗組合物包含：(i)包含至少一種活減毒登革病毒(lav)或活減毒嵌合黃病毒(lacv)的活減毒登革疫苗，其中所述lacv包含單一登革病毒血清型的prm和e基因以及不同黃病毒的骨架；且其中所述lav或lacv包含病毒基因組，其含有3'utr中的tl-2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30個核苷酸缺失；和(ii)非復(fù)制型登革疫苗。在上述方法的一些實施方案中，非復(fù)制型疫苗是登革亞單位疫苗或滅活登革疫苗。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，活減毒和非復(fù)制型登革疫苗是四價的(即包含den1、den2、den3和den4組分或誘導(dǎo)針對den1、den2、den3和den4的免疫應(yīng)答)。在共同制劑引發(fā)-加強方法的一些實施方案中，步驟(c)的第二登革病毒疫苗組合物與步驟(a)的第一登革病毒疫苗組合物是相同的。在替代實施方案中，步驟(c)的組合物與步驟(a)的組合物不是相同的。在額外實施方案中，所述方法包括重復(fù)步驟(b)和(c)一次或多次。在一些實施方案中，將步驟(a)和/或步驟(c)的第一疫苗和第二登革疫苗配制于分開的小瓶中且在施用之前混合在一起。認(rèn)為在引發(fā)/加強方案中使用本發(fā)明的組合物將引起強烈的免疫應(yīng)答，其在引發(fā)(第一劑量)時主要由活減毒疫苗驅(qū)動且在加強(第二劑量)時主要由非復(fù)制型疫苗(例如亞單位或滅活疫苗)驅(qū)動。因此，本發(fā)明涉及包含有效量的活減毒登革疫苗和非復(fù)制型登革疫苗以及藥學(xué)上可接受的載體的登革病毒疫苗組合物，其中所述活減毒登革疫苗包含至少一種活減毒登革病毒(lav)或至少一種活減毒嵌合黃病毒(lacv)，其中所述lav或lacv包含病毒基因組，其含有3'utr中的tl-2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30個核苷酸缺失。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物的非復(fù)制型登革疫苗選自重組登革亞單位疫苗或滅活登革疫苗。為了制備本發(fā)明的藥物或無菌登革病毒疫苗組合物，將如本文所述的活減毒登革疫苗和非復(fù)制型登革疫苗與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合?；蛘撸顪p毒登革疫苗和非復(fù)制型登革疫苗在混合前包含藥學(xué)上可接受的載體，且當(dāng)混合疫苗時不需要額外載體。參見，例如，remington'spharmaceuticalsciences和u.s.pharmacopeia:nationalformulary,mackpublishingcompany,easton,pa(1984)。藥學(xué)上可接受的載體包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、等滲和吸收延遲劑等。所述載體可以適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、直腸、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。如本文所使用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指這樣的物質(zhì)，如上所述，其與適合于施用于人的本發(fā)明活性成分(例如完整滅活的病毒、活減毒病毒、活減毒嵌合病毒、病毒蛋白、包含編碼登革抗原蛋白的核苷酸序列的質(zhì)?；虻歉锟乖Y合物)混合。在本發(fā)明的實施方案中，藥學(xué)上可接受的載體不以相同形式存在于自然界中，例如該物質(zhì)是人造的，因為其不存在于自然界中或該物質(zhì)的純度和/或無菌度(sterility)與相應(yīng)的天然物質(zhì)是不相同的。例如，注射用無菌水，其為注射用蒸餾水的無菌、不含細(xì)菌、無溶質(zhì)制劑，不以相同形式存在于自然界中，且被認(rèn)為是藥學(xué)上可接受的載體。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含一種或多種本文公開的活性成分(例如，四價lav)和注射用無菌水。在進(jìn)一步實施方案中，藥學(xué)上可接受的載體可以是水的另一種形式，其適用于藥物或生物制劑，且與自然界中存在的水不相同，其包括純化水、注射用水、無菌純化水和抑菌性注射用水。藥物組合物在制備和儲存條件下通常應(yīng)當(dāng)是無菌和穩(wěn)定的?？梢酝ㄟ^以例如凍干粉末、漿料、水溶液、懸浮液、微乳液、分散體、脂質(zhì)體或適合于疫苗配制和施用的其他有序結(jié)構(gòu)的形式，與可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備治療和診斷劑的制劑(參見，例如，hardman,等人(2001)goodmanandgilman'sthepharmacologicalbasisoftherapeutics,mcgraw-hill,newyork,ny;gennaro(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy,lippincott,williams和wilkins,newyork,ny;avis,等人(編)(1993)pharmaceuticaldosageforms:parenteralmedications,marceldekker,ny;lieberman,等人(編)(1990)pharmaceuticaldosageforms:tablets,marceldekker,ny;lieberman,等人(編)(1990)pharmaceuticaldosageforms:dispersesystems,marceldekker,ny;weiner和kotkoskie(2000)excipienttoxicityandsafety,marceldekker,inc.,newyork,ny)。本發(fā)明的登革病毒疫苗共同制劑可以進(jìn)一步包含額外組分，包括但不限于如下面討論的佐劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、鹽、抗微生物防腐劑、表面活性劑、張力調(diào)節(jié)劑、螯合劑、葡聚糖、葡聚糖硫酸酯、葡聚糖t40、二乙醇胺、胍、氯化鈣、檸檬酸鈉、白蛋白、明膠、聚乙二醇(peg)、脂質(zhì)和肝素。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定期望的登革病毒疫苗組合物或共同制劑中應(yīng)當(dāng)包括哪些額外的賦形劑，這取決于其在制劑中的功能，以及預(yù)計的施用模式，劑量，和其他因素，諸如組合物的預(yù)期的儲存時間和溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到額外的賦形劑的量可以變化，并且可以容易地確定對于施用于人安全且對于期望的功能有效的適當(dāng)量?；顪p毒登革病毒疫苗如上所示，本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物包含活減毒登革疫苗，其包含選自登革病毒1型(den1)、登革病毒2型(den2)、登革病毒3型(den3)和登革病毒4型(den4)的至少一種lav，或lacv，其中l(wèi)av或lacv包含含有3'utr中的tl-2δ30修飾的病毒基因組，且其中l(wèi)av或lacv：誘導(dǎo)針對登革病的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)針對登革病的病毒中和抗體應(yīng)答，保護(hù)免于感染或降低感染的可能性或降低其臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重度或持續(xù)時間。在本發(fā)明的實施方案中，活減毒登革疫苗是單價、二價、三價或四價的，即分別誘導(dǎo)針對den血清型1-4中的一種、兩種、三種或四種或保護(hù)免于den血清型1-4中的一種、兩種、三種或四種的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，活減毒登革疫苗是四價的，即誘導(dǎo)針對den血清型1-4或保護(hù)免于den血清型1-4的免疫應(yīng)答，并且包含den1、den2、den3和den4組分，其中每種組分是lav或lacv。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的latv的每一種lav或lacv組分包含活減毒病毒，其獨立地是減毒嵌合黃病毒或減毒登革病毒，其包含在病毒基因組的3'utr中的tl-2δ30修飾。登革病毒的減毒通過tl-2δ30修飾實現(xiàn)。然而，在疫苗的一種或多種組分中也可以包括額外的減毒突變，包括但不限于：在位置1495、1545、7132、7163、7164和8308的突變。減毒突變可以通過不同的技術(shù)來實現(xiàn)，包括本領(lǐng)域中已知的方法，諸如通過組織培養(yǎng)物上的連續(xù)傳代或通過更多定義的遺傳操作?？捎糜跍p毒登革病毒和嵌合登革病毒的突變是本領(lǐng)域中已知的。參見，例如，wo02/095075、wo2006/44857、美國專利號7,189,403、美國專利號8,337,860、wo2003/103571、wo2000/014245和wo2008/022196。已知的減毒登革毒株也可以用于本文組合物中，諸如wo06/134433、wo2006/134443、wo2007/141259、wo96/40933、wo2000/057907、wo2000/057908、wo2000/057909、wo2000/057910和wo2007/015783中描述的毒株。本發(fā)明的組合物的優(yōu)選實施方案包含四價活減毒登革疫苗(latv)。此四價活減毒疫苗可以包含四種減毒登革病毒(lav)、三種lav和一種減毒嵌合黃病毒毒株(lacv)、兩種登革lav和兩種lacv、一種登革lav和三種lacv，或四種lacv。在優(yōu)選實施方案中，latv包括以下特征：(1)rden1δ30，其為denv1lav，其中denv1病毒基因組包含對應(yīng)于3'utr中的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失；(2)rden2/4δ30，其為在denv4骨架上包含denv2prm和e基因的denv2lacv，其中den4骨架包含對應(yīng)于3'utr中的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30-nt缺失；(3)rden3δ30/δ31，其為denv3lav，其中denv3病毒基因組包含對應(yīng)于3'utr中的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失和對應(yīng)于3'utr的tl-3結(jié)構(gòu)的單獨、不連續(xù)的上游31nt缺失；和(4)rden4δ30，其為denv4lav，其中denv4病毒基因組包含對應(yīng)于3'utr中的tl2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30nt缺失。在本發(fā)明的包含嵌合黃病毒的實施方案中，各嵌合黃病毒包含病毒基因組，其包含編碼單一登革病毒血清型的prm和e蛋白的核苷酸序列和編碼不同黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白(即“骨架”)的核苷酸序列，其中各嵌合黃病毒是減毒的。用于構(gòu)建重組活減毒黃病毒毒株的方法可以包括使用已知減毒毒株作為基礎(chǔ)，其中所述方法包括用來自相關(guān)目的病毒的適當(dāng)基因(prm和e)取代基礎(chǔ)病毒的等同基因。例如，該方法已用于wnv，其中所述嵌合病毒是類型間嵌合的，基于包含wnv的prm和e基因的減毒den-4毒株(bray,m.等人,j.virol.(1996)70:4162-4166;chen,w.,等人,j.virol.(1995)69:5186-5190;bray,m.和lai,c.-j.,proc.natl.acad.sci.usa(1991)88:10342-10346;lai,c.j.等人,clin.diagn.virol.(1998)10:173-179)。另一種方法是使用yf17d減毒黃熱病毒株作為基礎(chǔ)來開發(fā)重組嵌合疫苗，其先前用于je病毒、den病毒和wn病毒?？梢酝ㄟ^將編碼來自任何黃熱病毒株(例如，yfv17d)的prm和e蛋白的基因替換為登革血清型的那些而構(gòu)建包含黃熱病骨架的嵌合黃熱病疫苗。dna克隆之后，轉(zhuǎn)錄rna且轉(zhuǎn)染入vero細(xì)胞，以獲得具有yfv17d復(fù)制機器和相關(guān)登革病毒的外殼(externalcoat)的嵌合病毒。參見guirakhoo等人,journalofvirology,74(12):5477–5485(2000);guy等人,vaccine28:632–649(2010);monatht.p.advvirusres(2003)61:469-509;monath等人proc.natl.acad.sci.usa(2006)103:6694;和wo98/37911。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，活減毒登革疫苗包含(1)至少一種包含單一登革血清型的prm和e蛋白和黃熱病骨架的嵌合黃病毒和(2)至少一種包含病毒基因組的lav或lacv，所述病毒基因組包含3'utr的tl-2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30-核苷酸缺失?？捎糜诒景l(fā)明的組合物中的嵌合活減毒黃病毒也可以包含登革嵌合病毒，其中病毒基因組包含單一登革病毒血清型的prm和e基因和不同的登革病毒血清型的衣殼和非結(jié)構(gòu)基因。在其中嵌合病毒包含來自第二登革血清型的骨架的實施方案中，登革骨架包含對應(yīng)于tl-2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3'utr的約30個核苷酸的缺失，并且可以任選地包含額外的減毒突變。通過將tl-2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的30-核苷酸缺失引入減毒登革骨架或野生型登革病毒骨架，任何減毒登革病毒或野生型登革病毒都可以用作嵌合病毒的骨架?？梢酝ㄟ^連續(xù)傳代、通過引入定義的基因突變或通過使用已知的減毒登革毒株來實現(xiàn)登革病毒骨架的減毒。登革嵌合疫苗描述于，例如，whitehead等人wo03/092592中。在本發(fā)明的一些實施方案中，活減毒疫苗包含嵌合黃病毒，其中衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白來自與prm和e蛋白不同的登革血清型。本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物包含有效量的活減毒病毒疫苗。在本發(fā)明的一些實施方案中，活減毒登革疫苗的效價是10至約1x107噬斑形成單位(pfu)。在替代實施方案中，活減毒登革疫苗的效價是約1x102至約1x106pfu。在其他實施方案中，活減毒登革疫苗的效價是約1x103至約1x105pfu。登革亞單位疫苗在本發(fā)明的一些實施方案中，所述組合物包含重組登革亞單位疫苗，其包含一種或多種登革抗原蛋白。在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，所述重組登革亞單位疫苗包含一種或多種登革蛋白、融合蛋白或其一種或多種片段。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，重組登革亞單位疫苗包含登革包膜或e蛋白、或其片段。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，重組登革亞單位疫苗是四價的，即靶向針對所有四種登革血清型的免疫應(yīng)答。重組登革亞單位疫苗可以包含四種重組登革蛋白或少于四種重組登革蛋白，例如重組den1蛋白、重組den2蛋白和重組den3/4融合蛋白。在一些實施方案中，重組登革亞單位疫苗包含den1-4的登革病毒包膜糖蛋白或其片段(例如den1-80e、den2-80e、den3-80e、den4-80e或den4-80ezip)，其使用重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生和分泌。所述亞單位疫苗可以任選地包含佐劑，如下面更充分描述。在本發(fā)明的該方面的一些實施方案中，所述重組登革亞單位疫苗包含一種或多種純化的登革病毒包膜(“e”)蛋白、藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中所述e蛋白各自構(gòu)成野生型e的從其n-末端的氨基酸殘基1開始的長度的約80%，使得所述e蛋白當(dāng)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)時可被分泌到生長培養(yǎng)基中，且其中所述組合物在人對象中誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述重組登革亞單位疫苗進(jìn)一步包含有效量的佐劑。在本發(fā)明的一些實施方案中，den-4e蛋白是二聚的(“den4-80ezip”)，如描述于us6,749,857和wo2012/154202中。在本發(fā)明的該方面的一些實施方案中，上述組合物中的e蛋白在昆蟲宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生和表達(dá)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，e蛋白在黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)schneider2(s2)宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生和表達(dá)。本發(fā)明的重組登革病毒e蛋白可以借助使用果蠅schneider2(s2)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。該系統(tǒng)已經(jīng)表明產(chǎn)生維持天然樣結(jié)構(gòu)的重組登革包膜蛋白(cuzzubbo等人,clin.diagn.lab.immunol.(2001)8:1150-55;modis等人,proc.natl.acad.sci.(2003)100:6986-91;modis等人,nature(2004)427:313-9;zhang等人,structure(2004)12(9):1607-18)。也已經(jīng)顯示該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)來自其他黃病毒諸如西尼羅病毒、日本腦炎病毒、丙型肝炎病毒和蜱傳腦炎病毒的其他重組包膜蛋白。重組登革包膜蛋白可以在c-末端截短，剩下80%的天然包膜蛋白(“80e”)。因此80e被定義為e蛋白的從其n-末端的氨基酸1開始的約前80%的連續(xù)氨基酸。如上所述，本發(fā)明的該方面的一些實施方案包含截短的80e蛋白，其由野生型e的從其n-末端的氨基酸殘基1開始的長度的約80％組成。本發(fā)明的一些實施方案中使用的e蛋白缺失該蛋白的膜錨定部分(e的羧基末端的約最后10％)。換言之，本發(fā)明的具體實施方案中使用的截短80e蛋白由e的從其n-末端的氨基酸1開始的多達(dá)前90%的連續(xù)氨基酸組成，因此允許其被分泌至細(xì)胞外培養(yǎng)基，以便于回收。截短可以進(jìn)一步缺失連接80e部分與膜錨定部分的e蛋白的“莖”部分；莖部分不含顯著的抗原表位且因此不包括在優(yōu)選的抗原den1-80e、den2-80e、den3-80e、den4-80e或den4-80ezip中?？煽寺『头置诔^90%，但少于100%的e蛋白，即該蛋白可為90%+的長度，羧基端截短的，并且可以包括跨膜結(jié)構(gòu)域的部分，只要截短的e蛋白可分泌?！翱煞置凇币庵改軌虮环置?，且通常從表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，可用于本發(fā)明的組合物和方法中的登革e蛋白可以與本文例舉的80％不同，只要該蛋白是可分泌的。在本發(fā)明的各方面的優(yōu)選實施方案中，dene蛋白為約80％的長度，從包膜蛋白的n-末端氨基酸開始且在第393至第401氨基酸的范圍內(nèi)的氨基酸結(jié)束，例如，為從登革病毒2型的氨基酸1至氨基酸395。在本發(fā)明的各方面的替代實施方案中，登革e蛋白可以是e的其n-末端的氨基酸1開始的連續(xù)氨基酸的約75％、約85％、約90％、約95％、或約98％。在本發(fā)明的各方面的示例性實施方案中，dene蛋白是e蛋白的其n-末端的氨基酸1開始的連續(xù)氨基酸的約80％；諸如如seqidno:1中所述的den1-80e，如seqidno:2中所述的den2-80e，如seqidno:3中所述的den3-80e和如seqidno:4中所述的den4-80e。分泌的e蛋白可以進(jìn)一步含有促進(jìn)二聚化的結(jié)構(gòu)域，諸如在den4-80ezip蛋白中，使得進(jìn)一步增強重組蛋白的免疫原性。示例性den4-80ezip蛋白包含如seqidno:5中所述的氨基酸序列。在本發(fā)明的該方面的一些實施方案中，所述組合物中包括的den1、den2和den380e抗原是單體的，且den480e抗原是二聚的。在本發(fā)明的該方面的替代實施方案中，所述組合物中的den1-80e、den2-80e、den3-80e和den4-80e蛋白是單體的。在此類實施方案中，den4成分存在的量是den1、den2、和den3蛋白的個別量的約1.5至約3倍，優(yōu)選den1、den2、和den3成分(蛋白)的量的約2倍。在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，所述組合物中的den1:den2:den3:den4抗原的比率是約1:1:1:2。在本發(fā)明的包含登革e蛋白的實施方案中，所述組合物中的各e蛋白的量是約0.5μg至約500μg。在替代實施方案中，各e蛋白的量是約0.5μg至約450μg、0.5μg至約400μg、0.5μg至約350μg、0.5μg至約300μg、0.5μg至約250μg、0.5μg至約200μg、0.5μg至約150μg、0.5μg至約100μg、0.5μg至約50μg、5.0μg至約500μg、5.0μg至約450μg、5.0μg至約400μg、5.0μg至約350μg、5.0μg至約300μg、5.0μg至約250μg、5.0μg至約200μg、5.0μg至約150μg、5.0μg至約100μg、5.0μg至約50μg、10μg至約500μg、10μg至約450μg、10μg至約400μg、10μg至約350μg、10μg至約300μg、10μg至約250μg、10μg至約200μg、10μg至約150μg、10μg至約100μg、10μg至約50μg、25μg至約500μg、25μg至約450μg、25μg至約400μg、25μg至約350μg、25μg至約300μg、25μg至約250μg、25μg至約200μg、25μg至約150μg、25μg至約100μg或25μg至約50μg。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述組合物中的各e蛋白的量是約1.0μg至約100μg。在又進(jìn)一步實施方案中，所述組合物中的各e蛋白的量選自約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500μg。滅活登革疫苗作為本發(fā)明的登革疫苗共同制劑中的登革亞單位疫苗的替代方案，也可以使用完整滅活登革疫苗或滅活登革嵌合疫苗。本文共同制劑的滅活登革疫苗包含一種或多種完整滅活的登革病毒和/或一種或多種滅活的登革嵌合病毒。在本發(fā)明的該方面的一些實施方案中，滅活登革疫苗是四價的，且包含完整滅活的den1、den2、den3和den4。在替代實施方案中，所述滅活疫苗包含四種滅活的嵌合登革病毒。在又其他實施方案中，所述滅活疫苗是四價的，并且包含一種或多種完整滅活的登革病毒和一種或多種滅活的登革嵌合病毒，例如滅活的完整den1病毒、滅活的完整den2病毒、滅活的den3嵌合病毒和滅活的den4嵌合病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到，滅活的完整或嵌合的den病毒的任何組合可以用于本發(fā)明的四價組合物和方法中，只要所述疫苗組合物靶向所有四種登革血清型。可用于本發(fā)明的組合物和方法中的滅活的登革疫苗描述于putnak等人vaccine23:4442-4452(2005)、us6190859、us6254873和sterner等人wo2007/002470。或者，可以通過本領(lǐng)域中已知的方法，例如，用化學(xué)品、熱或輻射來滅活登革病毒毒株和嵌合登革毒株/嵌合黃病毒毒株，以用于本發(fā)明的組合物和方法中。佐劑已經(jīng)廣泛地研究了疫苗與可增強針對目的抗原的免疫應(yīng)答的化合物(稱為佐劑)的共同施用。除了增強針對目的抗原得免疫應(yīng)答以外，一些佐劑可以用于降低引發(fā)期望的免疫應(yīng)答所必需的抗原的量，或降低臨床方案中誘導(dǎo)持久的免疫應(yīng)答且提供免于疾病的保護(hù)所需要的注射次數(shù)。為此，本發(fā)明的登革病毒疫苗共同制劑可以采用佐劑。本文描述的共同制劑的佐劑可以是如上所述行使期望功能且不滅活或顯著影響組合物的lav或lacv的滴度的任何佐劑。超過60年前，確定基于鋁的化合物具有佐劑活性(綜述參見lindblad,e.b.immunol.andcellbiol.82:497-505(2004);baylor等人vaccine20:s18-s23(2002))。當(dāng)以適當(dāng)劑量使用時，通常認(rèn)為鋁佐劑是安全的。在全世界內(nèi)，監(jiān)管機構(gòu)已經(jīng)批準(zhǔn)了許多鋁佐劑用于施用于人。因此，基于鋁的化合物諸如氫氧化鋁(al(oh)3)、羥基磷酸鋁(alpo4)、無定形羥基磷酸鋁硫酸鹽(aahs)或所謂的“明礬”(kal(so4)?12h2o)(參見klein等人,analysisofaluminumhydroxyphosphatevaccineadjuvantsbyalmasnmr.,j.pharm.sci.89(3):311-21(2000))，可以與本文提供的組合物組合。在本文提供的本發(fā)明的示例性實施方案中，鋁佐劑是羥基磷酸鋁或aahs，或者稱為“maa”。在替代實施方案中，所述鋁佐劑是磷酸鋁佐劑，本文中稱為“mapa”。在其他實施方案中，所述佐劑是氫氧化鋁。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定鋁佐劑的最佳劑量，所述最佳劑量既安全又有效增加針對靶向的登革病毒的免疫應(yīng)答。對于鋁的安全性概況以及fda批準(zhǔn)的疫苗中包括的鋁的量的討論，參見baylor等人,vaccine20:s18-s23(2002)。通常，鋁佐劑的有效且安全劑量在50μg至1.25mg元素鋁/劑量(100μg/ml至2.5mg/ml濃度)而變化。因此，本發(fā)明的具體實施方案包括包含活減毒登革病毒疫苗和非復(fù)制型疫苗的組合物，如本文中任何實施方案所述，并且進(jìn)一步包含鋁佐劑。在一些實施方案中，所述非復(fù)制型疫苗選自重組登革亞單位疫苗或滅活登革疫苗。在本發(fā)明的實施方案中，所述登革組合物包含含有約50μg至約1.25mg元素鋁/劑量疫苗的佐劑。在其他實施方案中，鋁佐劑/劑量疫苗組合物包含范圍為以下量的元素鋁：約100μg至約1.0mg、約100μg至約900μg、約100μg至約850μg、約100μg至約800μg、約100μg至約700μg、約100μg至約600μg、約100μg至約500μg、約100μg至約400μg、約100μg至約300μg、約100至約250μg、約200μg至約1.25mg、約200μg至約1.0mg、約200μg至約900μg、約200μg至約850μg、約200μg至約800μg、約200μg至約700μg、約200μg至約600μg、約200μg至約500μg、約200μg至約400μg、約200μg至約300μg、約300μg至約1.25mg、約300μg至約1.0mg、約300μg至約900μg、約300μg至約850μg、約300μg至約800μg、約300μg至約700μg、約300μg至約600μg、約300μg至約500μg、約300μg至約400μg、約400μg至約1.25mg、約400μg至約1.0mg、約400μg至約900μg、約400μg至約850μg、約400μg至約800μg、約400μg至約700μg、約400μg至約600μg、約400μg至約500μg、約500μg至約1.25mg、約500μg至約1.0mg、約500μg至約900μg、約500μg至約850μg、約500μg至約800μg、約500μg至約700μg、約500μg至約600μg、約600μg至約1.25mg、約600μg至約1.0mg、約600μg至約900μg、約600μg至約850μg、約600μg至約800μg或約600μg至約700μg?？梢耘c本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物結(jié)合使用的其他佐劑包括包括但不限于含有cpg寡核苷酸，或作用于toll樣受體諸如tlr4和tlr9的其他分子的佐劑(關(guān)于綜述，參見daubenberger,c.a.,curr.opin.mol.ther.9(1):45-52(2007);duthie等人,immunologicalreviews239(1):178-196(2011);hedayat等人,medicinalresearchreviews32(2):294-325(2012))，所述分子包括脂多糖、單磷酰脂質(zhì)a和氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯。可用于本發(fā)明的組合物中的額外佐劑包括免疫刺激性寡核苷酸(imo；參見例如u.s.7,713,535和u.s.7,470,674)；t-輔助表位、脂質(zhì)a及其衍生物或變體、脂質(zhì)體、磷酸鈣、細(xì)胞因子(例如粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)il-2、ifn-α、flt-3l)、cd40、cd28、cd70、il-12、熱休克蛋白(hsp)90、cd134(ox40)、cd137、covaccineht、非離子型嵌段共聚物、不完全弗氏佐劑、趨化因子、霍亂毒素；大腸桿菌不耐熱腸毒素；百日咳毒素；胞壁酰二肽、胞壁酰二肽類似物、mf59，saf、免疫刺激復(fù)合物、生物可降解的微球體、聚磷腈；合成多核苷酸。用于與本文描述的組合物一起使用的額外佐劑是以iscom(“免疫刺激復(fù)合物”，關(guān)于綜述參見barr和mitchell,immunologyandcellbiology74:8-25(1996);以及skene和sutton,methods40:53-59(2006))的特征形式，含有單獨或與膽固醇和磷脂組合的皂苷(例如qs21)的佐劑。此類佐劑在本文中稱為“基于皂苷的佐劑”。在本文提供的組合物和方法的具體實施方案中，突變毒素和/或毒素蛋白與iscom型佐劑或“iscom”組合，所述“iscom”是iscom基質(zhì)顆粒佐劑，諸如在沒有抗原的情況下制造的iscomatrix?(iscom?和iscomatrix?是澳大利亞帕克維爾csllimited的注冊商標(biāo))。使用方法本發(fā)明的實施方案還包括一種或多種本文所述的登革疫苗共同制劑，其(i)用于以下,(ii)用作用于以下的藥物或組合物，或(iii)用于制備用于以下的藥物：(a)治療(例如，人體)；(b)藥物；(c)抑制登革病毒復(fù)制，包括den1、den2、den3和/或den4；(d)誘導(dǎo)針對den1、den2、den3和/或den4中的一種或多種的免疫應(yīng)答或保護(hù)性免疫應(yīng)答；(e)誘導(dǎo)針對一種或多種登革類型的病毒中和抗體應(yīng)答；(f)治療或預(yù)防登革病毒的感染；(g)預(yù)防登革病毒感染的復(fù)發(fā)；(h)降低與登革病毒感染相關(guān)的病理癥狀的進(jìn)展、發(fā)作或嚴(yán)重性和/或降低登革病毒感染的可能性或，(i)治療、預(yù)防或延遲登革相關(guān)疾病的發(fā)作、嚴(yán)重性或進(jìn)展，所述登革相關(guān)疾病包括但不限于：登革熱、登革出血熱、登革休克綜合征。在這些用途中，登革疫苗組合物可以任選地與一種或多種佐劑(例如，本文所述的maa、磷酸鋁、氫氧化鋁諸如alhydrogel?、或其他鋁鹽佐劑、基于皂苷的佐劑諸如iscomatrix?(csl,ltd.)、tlr激動劑、或脂質(zhì)納米顆粒)組合應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供了用于預(yù)防和/或治療性治療登革病毒感染或登革相關(guān)疾病的方法，其包括向需要治療的患者施用一種或多種本發(fā)明的共同制劑?！盎颊摺?或者在本文中稱為“對象”)是指能夠被登革病毒(諸如den1、den2、den3或den4)感染的哺乳動物。在優(yōu)選實施方案中，患者是人?？梢灶A(yù)防性或治療性治療患者。預(yù)防性治療提供了足夠的保護(hù)性免疫，以降低登革感染或其效果(例如，登革熱)的可能性或嚴(yán)重度?？梢赃M(jìn)行治療性治療，以降低登革感染或其臨床效果的嚴(yán)重度或預(yù)防其復(fù)發(fā)。預(yù)防性治療可以使用本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物來進(jìn)行，如本文所述。本發(fā)明的共同制劑可以施用于一般群體或處于增加的登革感染風(fēng)險的那些人，例如住在或?qū)⒙眯兄烈廖脤傥米恿餍械氖澜绲貐^(qū)的那些人。“需要治療”的那些包括已經(jīng)具有登革感染(例如，被den1、den2、den3或den4中的一種或多種感染)的那些，以及傾向于具有任何感染的那些或期望感染可能性降低的任何人。本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)配制且施用于患者。通常的藥物施用的指導(dǎo)提供于例如vaccines編輯plotkin和orenstein,w.b.sanderscompany,1999;remington'spharmaceuticalsciences第20版,編輯gennaro,mackpublishing,2000；和modernpharmaceutics第20版，編輯banker和rhodes,marceldekker,inc.,1990。因此，本發(fā)明提供了用于在患者中誘導(dǎo)針對登革感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，其包括向患者施用免疫有效量的本文所述的任何登革病毒疫苗組合物的步驟。本發(fā)明還提供了用于治療登革感染或用于治療與登革感染相關(guān)的任何病理狀態(tài)的方法，此類治療包括預(yù)防感染，和降低臨床癥狀的嚴(yán)重度，延緩或預(yù)防疾病的進(jìn)展，和/或降低感染或其臨床癥狀的可能性；所述方法包括向患者施用免疫有效量的任何本文所述的疫苗組合物的步驟。本發(fā)明的額外實施方案包括在引發(fā)/加強方案中向患者施用兩種或更多種本發(fā)明的組合物。因此，本發(fā)明涉及預(yù)防或降低有此需要的患者中的登革感染的可能性的方法，其包括以下步驟：(a)向所述患者施用本發(fā)明的第一登革病毒疫苗組合物；(b)步驟(a)之后等待過去預(yù)定量的時間；(c)向所述患者施用本發(fā)明的第二登革病毒疫苗組合物；和(d)任選地重復(fù)步驟(b)和(c)；由此在所述患者中預(yù)防登革感染或降低被登革感染的可能性。在上述方法的實施方案中，本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物呈液體的形式(即活減毒登革疫苗和非復(fù)制型登革疫苗一起配制為相同的小瓶或容器中的液體)。在替代實施方案中，凍干所述登革病毒疫苗組合物(即活減毒登革疫苗和非復(fù)制型登革疫苗一起配制且凍干于相同的小瓶或其他容器中)，且在施用于患者之前用無菌稀釋劑重構(gòu)。在額外實施方案中，活減毒登革疫苗和非復(fù)制型登革疫苗提供于分開的小瓶或容器中，且在施用于患者之前由臨床醫(yī)生混合在一起。在此類實施方案中，活減毒登革疫苗和非復(fù)制型登革疫苗可以(1)兩者均呈液體形式，(2)兩者均凍干，或(3)一種疫苗呈液體形式且一種疫苗被凍干。當(dāng)一種疫苗呈液體形式且一種疫苗被凍干時，所述凍干疫苗可以用液體疫苗重構(gòu)以形成本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物，或者凍干疫苗可以用無菌稀釋劑重構(gòu)且然后與液體疫苗混合以形成本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物。第一劑量的本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物和第二劑量的本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物或其后任何劑量之間的時間量是約2周至約2年。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，在多次施用之間允許經(jīng)過2個月至12個月的時間。在本發(fā)明的該方面的替代實施方案中，疫苗組合物的各劑量的各施用之間的時間量獨立地選自2周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月和24個月。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述第一和第二登革病毒疫苗組合物是相同的。在替代實施方案中，所述第一和第二登革病毒疫苗組合物不是相同的。本發(fā)明的登革病毒疫苗組合物可以通過不同的途徑施用。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物胃腸外施用，即通過皮內(nèi)、皮下或肌內(nèi)注射。皮下和肌內(nèi)施用可以使用，例如，針或噴射注射器來進(jìn)行。本文所述的組合物可以以與劑量制劑相容的方式且以免疫有效的量進(jìn)行施用，以治療和/或降低登革感染的可能性。在本發(fā)明的上下文中，施用于患者的劑量應(yīng)足以隨著時間在患者中實現(xiàn)有利應(yīng)答，諸如登革病毒水平的降低，或降低被登革感染的可能性。待施用的登革病毒疫苗的量可以取決于待治療的對象，包括其年齡、性別、重量和總體健康情況。在這方面，需要施用的疫苗的精確量將取決于從業(yè)者的判斷。在待針對登革感染的治療或預(yù)防中施用的疫苗的有效量的確定中，醫(yī)師可以評估循環(huán)血漿水平、疾病進(jìn)展和抗登革抗體的產(chǎn)生。在任何情況下，本發(fā)明的免疫原性組合物的合適劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地決定。合適的給藥方案優(yōu)選考慮本領(lǐng)域眾所周知的因素進(jìn)行確定，包括患者的年齡、重量、性別和醫(yī)學(xué)狀況；施用途徑；期望的效應(yīng)；和采用的具體組合物。給藥的時機取決于本領(lǐng)域眾所周知的因素且范圍可以為2周至24個月。在最初施用之后，可以施用一個或多個額外劑量，以維持和/或加強抗體滴度。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防登革病毒感染或預(yù)防或改善其癥狀的方法，其包括以下步驟：(a)將活減毒登革疫苗和非復(fù)制型登革疫苗混合以形成登革病毒疫苗組合物，其中所述第一疫苗包含至少一種登革熱lav或lacv，其中所述lav或lacv包含對應(yīng)于3'utr的tl-2莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的約30個核苷酸的缺失；和(b)向登革感染或其癥狀待預(yù)防或改善的患者施用一劑量的步驟(a)的登革病毒疫苗組合物。在該方法中，所述登革病毒疫苗組合物在混合之后其保持穩(wěn)定的時間段內(nèi)(例如24小時內(nèi))施用于患者。在本發(fā)明的該方面的一些實施方案中，所述非復(fù)制型登革疫苗是重組登革亞單位疫苗或滅活登革疫苗。本發(fā)明的該方面的進(jìn)一步實施方案包括(c)在施用所述登革病毒疫苗組合物之后允許過去預(yù)定量的時間，和(d)施用第二劑量的本發(fā)明的組合物。在所述實施方案中，步驟(c)和(d)可以任選地重復(fù)一次或多次。在上述方法中，所述第一登革疫苗是優(yōu)選四價的，且包含den1、den2、den3和den4組分，其中各組分包含活減毒登革病毒或活減毒嵌合黃病毒，如本文所述。在示例性實施方案中，所述活減毒登革疫苗包含四種嵌合黃病毒；其中各嵌合黃病毒包含單一登革病毒血清型的prm和e蛋白和不同的黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中各嵌合黃病毒是減毒的。在某些實施方案中，四種嵌合黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白來自黃熱病毒。在替代實施方案中，四種嵌合黃病毒各自的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白來自與prm和e蛋白不同的登革血清型。在本發(fā)明的該方面的一些實施方案中，所述第二登革疫苗是四價重組登革亞單位疫苗，其包含來自den1、den2、den3和den4的登革e蛋白或其片段。本文描述了可用于本發(fā)明的該方法中的亞單位疫苗。在優(yōu)選實施方案中，所述e蛋白各自構(gòu)成den1、den2、den3和den4的野生型e的從其n-末端的氨基酸殘基1開始的長度的約80％。在上述方法的某些實施方案中，所述活減毒登革疫苗是凍干的，且所述重組亞單位疫苗在混合之前是液體。在一些實施方案中，步驟(a)的混合包括用液體疫苗重構(gòu)凍干疫苗。在替代實施方案中，所述凍干疫苗用無菌稀釋劑重構(gòu)，然后與步驟(a)中的液體疫苗混合。本文提及的所有出版物都通過引用并入，其目的為描述且公開可以與本發(fā)明結(jié)合使用的方法和材料。已經(jīng)參考附圖描述了本發(fā)明的不同實施方案，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于那些精確實施方案，并且在不背離如隨附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍或精神的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在其中實現(xiàn)各種變化和修改。實施例1用于測試活減毒登革病毒在佐劑和/或登革抗原(四價den-80e)存在的情況下的相容性/穩(wěn)定性的制劑的制備。進(jìn)行研究以評估重組δ30活減毒病毒(rden1-4)當(dāng)與四價den-80e(1-4)亞單位疫苗(v180)(單獨或與maa或iscomatrix?(imx)組合)組合共同配制時的相容性/穩(wěn)定性。所有制劑都使用無菌技術(shù)在生物安全柜中制備。用于測試的樣品用期望佐劑、一種或多種登革抗原或佐劑/一種或多種抗原組合配制于dulbecco氏pbs中，且置于用flurotec?(westpharmaceuticalservices,inc.,exton,pa)塞子密封的2ml無菌iso小瓶中。本研究中測試的佐劑/抗原樣品如下：(1)單獨的pbs；(2)四價den-80e(den1-80e+den2-80e+den3-80e+den4-80e)；(3)四價den-80e+maa；(4)四價den-80e+3xmaa和(5)四價den-80e+iscomatrix?佐劑(imx)。如下所述，將佐劑/抗原樣品與活減毒登革病毒以1:1比率現(xiàn)場混合。所述樣品在與δ30活減毒登革病毒(如實施例2中所述)現(xiàn)場混合之前和之后的劑量和濃度顯示于表1中。表1.四價測試樣品的濃度。所有制劑在與lav現(xiàn)場混合之前儲存在2-8℃。實施例2具有δ30登革活減毒病毒的共同制劑在佐劑和/或登革熱抗原(四價den-80e)存在的情況下的相容性/穩(wěn)定性測試將實施例1中制備的抗原/佐劑樣品與δ30活減毒登革病毒現(xiàn)場混合，且如下所述使用vero細(xì)胞上的體外噬斑測定，測試病毒活力。這些研究中使用的活減毒登革病毒是(rden1-rden1δ30-1545；rden2–rden2/4δ30(me)-1495,7163；rden3–rden3δ30/31-7164；和rden4–rden4δ30-7132,7163,8308)。在與δ30lav現(xiàn)場混合之后，登革抗原和佐劑的濃度提供于表1中。用4x105個vero細(xì)胞/孔接種二十四孔板。vero細(xì)胞的傳代水平為p144。為了稀釋病毒樣品用于噬斑測定(t=0小時時間點)，在22℃水浴中解凍每一種的?30lav's(rden1-4)各1ml的等分試樣。在2%培養(yǎng)基199中進(jìn)行病毒的稀釋以產(chǎn)生具有2x105pfu/ml的病毒滴度的稀釋儲液。將來自該稀釋儲液的0.5ml病毒等分至新鮮管中，且與0.5ml實施例1中描述的佐劑/抗原制劑之一混合以得到1:1稀釋。獲得的總體積為1ml，其中0.5ml用于t=0小時噬斑測定，且0.5ml儲存于4℃，用于t=24時間點噬斑測定。使用2%培養(yǎng)基199在96孔板中制備1:1?30lav:佐劑/抗原樣品的進(jìn)一步稀釋液以得到各測試樣品的1:10、1:100、1:1,000、1:10,000、1:100,000和1:1,000,000稀釋。為了進(jìn)行該測定，vero細(xì)胞單層用pbs洗滌，且將75μl各稀釋的樣品(一式兩份)添加至平板的各孔。使病毒接種物散布至孔中的細(xì)胞上，且將平板置于培養(yǎng)箱中。每10-15分鐘搖動平板，持續(xù)1小時，以均勻散布接種物。吸附1小時之后，通過將1ml培養(yǎng)基中的1%甲基纖維素添加至各孔而覆蓋細(xì)胞，且在37℃和5%co2下孵育。孵育6天之后，從每個孔吸出甲基纖維素覆蓋物，并將細(xì)胞單層進(jìn)行使用泛-黃病毒單克隆抗體4g2的免疫染色(henchal等人.denguevirus-specificandflavivirusgroupdeterminantsidentifiedwithmonoclonalantibodiesbyindirectimmunofluorescence.theamericanjournaloftropicalmedicineandhygiene31(4):830–836(1982))。在免疫染色程序后，通過計數(shù)在適當(dāng)病毒稀釋度的噬斑數(shù)目來測定病毒滴度。24小時之后，重復(fù)上述程序以測定儲存之后各樣品的病毒滴度。如上所述制備樣品。結(jié)果表明，測試的佐劑、單獨的亞單位抗原或佐劑/抗原制劑對t=0的δ30lav的病毒滴度都不具有任何影響(參見圖2)。該結(jié)果進(jìn)一步表明，甚至在4℃孵育24小時之后，與單獨的亞單位抗原以及與佐劑在一起的δ30lav是穩(wěn)定的。實施例3在恒河猴(macacamulatta)中評估登革引發(fā)–加強接種策略恒河猴中進(jìn)行的該非glp研究的目標(biāo)是評估共同制劑引發(fā)–加強接種策略且將其與常規(guī)的引發(fā)加強策略進(jìn)行比較。對于該研究，使用不同的方案施用兩種疫苗候選物，四價重組登革亞單位疫苗候選物(v180)和δ30四價登革活減毒疫苗(δ30lav)。四價v180候選物包含來自4種登革病毒血清型(登革病毒(denv)1、denv2、denv3和denv4)的每一種的截短的包膜糖蛋白(den-80e)。δ30四價lav包含登革類型1-4的活減毒登革病毒((rden1-rden1δ30-1545;rden2–rden2/4δ30(me)-1495,7163;rden3–rden3δ30/31-7164;和rden4–rden4δ30-7132,7163,8308)。在本研究中利用任一性別(n=4/組)、稱重超過3kg且通過elisa為黃病毒(denv1、2、3和4，和西尼羅河病毒)抗體陰性的健康成體、印度恒河猴。如表2中所述施用疫苗。對于該研究，第1組在0和16周時皮下(sc)接受δ30lav疫苗。第2組接受常規(guī)的引發(fā)加強，其中在0周時給予δ30lav疫苗，隨后在16周時給予使用alhydrogel?(brenntagbiosector,frederikssund,dk)配制的v180。第3組在0和16周時接受δ30lav疫苗和v180/alhydrogel?的共同制劑(共同制劑引發(fā)加強)。以0.5ml/劑量施用所有疫苗。接種之后，每天觀察動物在接種部位的任何變化或可能指示對疫苗的不良反應(yīng)的活動或攝食習(xí)慣的其他變化。表2.恒河猴免疫原性研究中使用的時間表和制劑。使用基于licor的微量中和測定每4周測定病毒中和活性，直至研究第20周。對于licor測定，將vero細(xì)胞以1.5x104個細(xì)胞/孔接種于平底96孔組織培養(yǎng)板中的100μl10%培養(yǎng)基199中，過夜。在分開的96孔板中，以1:10開始，一式兩份2倍連續(xù)稀釋血清樣品，進(jìn)行8次稀釋。對于沒有達(dá)到終點滴定的樣品，以較高稀釋度開始，重新測試樣品。將血清與等體積的稀釋至50pfu/孔的病毒一起孵育。在2%培養(yǎng)基199中進(jìn)行所有測定稀釋。將混合物在37℃+5%co2孵育1小時。中和之后，將整個混合物添加至鋪板的vero細(xì)胞上，且在37℃+5%co2孵育4天。去除培養(yǎng)基之后，將細(xì)胞用pbs中的3.7％甲醛固定30分鐘。將板用200μl0.1%titonx-100/pbs洗滌2次，每次5分鐘。將板用50μl2.8μg/ml的4g2抗體染色。然后以7.5μg/ml添加生物素化的馬抗小鼠igg，隨后添加irdye?800cw鏈霉抗生物素蛋白(1:1000)和draq5熒光探針(1:10,000)的混合物。將板保持在黑暗中，用于該最后顯色。將抗體和試劑稀釋于補充0.2%tween-20的odyssey封閉緩沖液中。在抗體更換之間，將板用0.1%tween-20/pbs洗滌3次。孵育步驟在室溫進(jìn)行1小時。使用biotek?el406洗板器系統(tǒng)(winooski,vt)將洗滌和分配步驟自動化。將板風(fēng)干且用紅外odyssey?sa成像系統(tǒng)(li-corbiosciences)掃描。將原始數(shù)據(jù)輸入excel處理工作表。取一式兩份孔平均值，且將血清終點中和滴度定義為當(dāng)與各測定板上包括的病毒對照相比時使800nm/700nm熒光積分強度比率減少≥50％的最高血清稀釋度的倒數(shù)。使用prism?(graphpadsoftware,inc.)繪制結(jié)果。以1:10稀釋度開始，設(shè)置所有樣品。如果樣品在該稀釋度不能中和，則分配1:5的滴度。對于第4周(劑量1后4周)的所有組的denv1、denv2、denv3和denv4的幾何平均中和滴度概述于圖3中。在該時間點，在所有免疫的動物(除了第2組中沒有對denv4響應(yīng)的一個動物)中檢測到病毒中和抗體應(yīng)答。來自第4周的關(guān)鍵結(jié)論是：?在劑量1后四周時的共同制劑組(第3組)中測量的中和應(yīng)答，與當(dāng)單獨給予δ30latv疫苗時誘導(dǎo)的中和應(yīng)答(第1和2組)相當(dāng)。這表明δ30latv疫苗與v180亞單位疫苗和alhydrogel?佐劑的共同制劑沒有負(fù)面影響對第一劑量的活減毒病毒疫苗的響應(yīng)。對于第20周(劑量2后4周)的所有組的denv1、denv2、denv3和denv4的幾何平均中和滴度概述于圖4中。在該時間點，在所有免疫的動物中檢測到病毒中和抗體應(yīng)答。來自第20周結(jié)果的關(guān)鍵結(jié)論是：?與δ30latv疫苗(第1組)相比，常規(guī)的引發(fā)加強(第2組)和共同制劑引發(fā)加強方法(第3組)都誘導(dǎo)了對所有四種denv類型的更好的中和滴度。取決于denv類型，滴度范圍為1.7至6.7倍更高。?與接受常規(guī)的引發(fā)-加強方案的組中誘導(dǎo)的中和應(yīng)答相比，在劑量2后四周時的共同制劑組(第3組)中測量的中和應(yīng)答是等效的，如果不是更好的話。這表明，δ30latv疫苗與v180亞單位疫苗和alhydrogel?佐劑的共同制劑沒有負(fù)面影響對亞單位加強的應(yīng)答。所有組的對denv1、denv2、denv3和denv4的縱向幾何平均中和滴度顯示于圖5中?？偠灾?，數(shù)據(jù)表明，共同制劑引發(fā)加強方案引起與常規(guī)的引發(fā)加強方法相當(dāng)?shù)膽?yīng)答且所述應(yīng)答優(yōu)于作為同源疫苗給予的δ30latv。實施例4在恒河猴中評估登革引發(fā)–加強劑量依賴性接種策略恒河猴中進(jìn)行的該非glp研究的目標(biāo)是評估使用亞單位疫苗和登革活減毒疫苗的不同共同制劑劑量的共同制劑引發(fā)–加強接種策略。對于該研究，使用實施例3中描述的兩種疫苗候選物。在本研究中利用任一性別(n=5/組)、稱重超過4kg且通過elisa為黃病毒(denv1、2、3和4，和西尼羅河病毒)抗體陰性的健康成體、印度恒河猴。如表3中所述施用疫苗。對于該研究，第1組在0和24周時皮下(sc)接受δ30lav疫苗(10e5pfu各lav)。第2組在0和24周時接受δ30lav疫苗(10e5pfu各lav)和v180(10、10、10、20μg各80e)/alhydrogel?(brenntagbiosector,frederikssund,dk)的共同制劑(共同制劑引發(fā)加強)。第3組在0和24周時接受δ30lav疫苗(10e5pfu各lav)和v180(3、3、3、6μg各80e)/alhydrogel?的共同制劑(共同制劑引發(fā)加強)。第4組在0和24周時接受δ30lav疫苗(10e3pfu各lav)和v180(10、10、10、20μg各80e)/alhydrogel?的共同制劑(共同制劑引發(fā)加強)。以0.5ml/劑量施用所有疫苗。接種之后，每天觀察動物在接種部位的任何變化或可能指示對疫苗的不良反應(yīng)的活動或攝食習(xí)慣的其他變化。表3.恒河猴免疫原性研究中使用的時間表和制劑。使用如上面實施例3中所述的基于licor的微量中和測定每4周測定病毒中和活性，直至研究第28周。對于第4周(劑量1后4周)的所有組的denv1、denv2、denv3和denv4的幾何平均中和滴度概述于圖6中。在該時間點，在所有免疫的動物(除了沒有對denv1響應(yīng)的第1組中的一個動物和第4組中的一個動物)中檢測到病毒中和抗體應(yīng)答。來自第4周結(jié)果的關(guān)鍵結(jié)論是：?在劑量1后四周時的共同制劑組(第2、3和4組)中測量的中和應(yīng)答，與當(dāng)單獨給予δ30latv疫苗時誘導(dǎo)的中和應(yīng)答(第1組)相當(dāng)。這表明δ30latv疫苗與v180亞單位疫苗和alhydrogel?佐劑的共同制劑沒有負(fù)面影響對第一劑量的活減毒病毒疫苗的響應(yīng)。?接受高劑量(10e5pfu各病毒)的δ30latv(第2組)或低劑量(10e3pfu各病毒)的δ30latv(第4組)的共同制劑組中的中和響應(yīng)是相當(dāng)?shù)?。這表明，與v180亞單位疫苗和alhydrogel?的共同制劑沒有負(fù)面影響較低劑量的δ30latv疫苗。對于第28周(劑量2后4周)的所有組的denv1、denv2、denv3和denv4的幾何平均中和滴度概述于圖7中。在該時間點，在所有免疫的動物中檢測到病毒中和抗體應(yīng)答。來自第28周結(jié)果的關(guān)鍵結(jié)論是：?所有共同制劑組(第2、3和4組)在劑量2后4周時都展示出licor中和滴度的強烈加強，其優(yōu)于僅δ30latv組(第2組)中觀察到的那些。這表明，δ30latv疫苗與v180亞單位疫苗和alhydrogel?佐劑的共同制劑沒有負(fù)面影響對亞單位加強的應(yīng)答。?含有低劑量v180的共同制劑(第3組)以及含有高劑量v180的共同制劑(第2組)都有加強。?含有低劑量(10e3pfu各病毒)的δ30latv的共同制劑(第4組)以及含有高劑量(10e5pfu各病毒)的δ30latv的共同制劑(第2組)都有加強。所有組的對denv1、denv2、denv3和denv4的縱向幾何平均中和滴度顯示于圖8中?？偠灾?，數(shù)據(jù)表明，共同制劑引發(fā)加強方案引起與常規(guī)的引發(fā)加強方法相當(dāng)?shù)膽?yīng)答且所述應(yīng)答優(yōu)于作為同源疫苗給予的δ30latv。序列表<110>mercksharp&dohmecorp.casimiro,danilor.bett,andrewcoller,beth-anngriswolddhanasekaran,govindarajanchintala,rameshv.<120>登革病毒疫苗組合物及其使用方法<130>23913-wo-pct<150>62/095,331<151>2014-12-22<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>395<212>prt<213>登革1<400>1metargcysvalglyileglyserargaspphevalgluglyleuser151015glyalathrtrpvalaspvalvalleugluhisglysercysvalthr202530thrmetalalysasplysprothrleuaspilegluleuleulysthr354045gluvalthrasnproalavalleuarglysleucysileglualalys505560ileserasnthrthrthraspserargcysprothrglnglygluala65707580thrleuvalglugluglnaspalaasnphevalcysargargthrphe859095valaspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglyser100105110leuilethrcysalalysphelyscysvalthrlysleugluglylys115120125ilevalglntyrgluasnleulystyrservalilevalthrvalhis130135140thrglyaspglnhisglnvalglyasngluserthrgluhisglythr145150155160thralathrilethrproglnalaprothrsergluileglnleuthr165170175asptyrglyalaleuthrleuaspcysserproargthrglyleuasp180185190pheasnglumetvalleuleuthrmetlysglulyssertrpleuval195200205hislysglntrppheleuaspleuproleuprotrpthrserglyala210215220serthrserglngluthrtrpasnargglnaspleuleuvalthrphe225230235240lysthralahisalalyslysglngluvalvalvalleuglysergln245250255gluglyalamethisthralaleuthrglyalathrgluileglnthr260265270serglythrthrthrilephealaglyhisleulyscysargleulys275280285metasplysleuthrleulysglymetsertyrvalmetcysthrgly290295300serphelysleuglulysgluvalalagluthrglnhisglythrval305310315320leuvalglnilelystyrgluglythraspalaprocyslysilepro325330335pheserthrglnaspgluargglyvalthrglnasnglyargleuile340345350thralaasnproilevalthrasplysglulysprovalasnileglu355360365alaglupropropheglyglusertyrilevalileglyalaglyglu370375380lysalaleulysleusertrpphelyslysgly385390395<210>2<211>395<212>prt<213>登革2<400>2metargcysileglyileserasnargaspphevalgluglyvalser151015glyglysertrpvalaspilevalleugluhisglysercysvalthr202530thrmetalalysasnlysprothrleuaspphegluleuilelysthr354045glualalysglnproalathrleuarglystyrcysileglualalys505560leuthrasnthrthrthraspserargcysprothrglnglyglupro65707580thrleuasnglugluglnasplysargphevalcyslyshissermet859095valaspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglygly100105110ilevalthrcysalametphethrcyslyslysasnmetgluglylys115120125ilevalglnprogluasnleuglutyrthrvalvalilethrprohis130135140serglyglugluhisalavalglyasnaspthrglylyshisglylys145150155160gluvallysilethrproglnserserilethrglualagluleuthr165170175glytyrglythrvalthrmetglucysserproargthrglyleuasp180185190pheasnglumetvalleuleuglnmetlysasplysalatrpleuval195200205hisargglntrppheleuaspleuproleuprotrpleuproglyala210215220aspthrglnglyserasntrpileglnlysgluthrleuvalthrphe225230235240lysasnprohisalalyslysglnaspvalvalvalleuglysergln245250255gluglyalamethisthralaleuthrglyalathrgluileglnmet260265270serserglyasnleuleuphethrglyhisleulyscysargleuarg275280285metasplysleuglnleulysglymetsertyrsermetcysthrgly290295300lysphelysvalvallysgluilealagluthrglnhisglythrile305310315320valileargvalglntyrgluglyaspglyserprocyslysilepro325330335phegluilemetaspleuglulysarghisvalleuglyargleuile340345350thrvalasnproilevalthrglulysaspserprovalasnileglu355360365alaglupropropheglyaspsertyrileileileglyvalglupro370375380glyglnleulysleuasptrpphelyslysgly385390395<210>3<211>393<212>prt<213>登革3<400>3metargcysvalglyvalglyasnargaspphevalgluglyleuser151015glyalathrtrpvalaspvalvalleugluhisglyglycysvalthr202530thrmetalalysasnlysprothrleuaspilegluleuglnlysthr354045glualathrglnleualathrleuarglysleucysilegluglylys505560ilethrasnilethrthraspserargcysprothrglnglygluala65707580ileleuproglugluglnaspglnasntyrvalcyslyshisthrtyr859095valaspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglyser100105110leuvalthrcysalalyspheglncysleugluserilegluglylys115120125valvalglnhisgluasnleulystyrthrvalileilethrvalhis130135140thrglyaspglnhisglnvalglyasngluthrglnglyvalthrala145150155160gluilethrproglnalaserthrvalglualaileleuproglutyr165170175glythrleuglyleuglucysserproargthrglyleuasppheasn180185190glumetileleuleuthrmetlysasnlysalatrpmetvalhisarg195200205glntrpphepheaspleuproleuprotrpthrserglyalathrthr210215220gluthrprothrtrpasnarglysgluleuleuvalthrphelysasn225230235240alahisalalyslysglngluvalvalvalleuglyserglnglugly245250255alamethisthralaleuthrglyalathrgluileglnasnsergly260265270glythrserilephealaglyhisleulyscysargleulysmetasp275280285lysleugluleulysglymetsertyralametcysleuasnthrphe290295300valleulyslysgluvalsergluthrglnhisglythrileleuile305310315320lysvalglutyrlysglygluaspalaprocyslysilepropheser325330335thrgluaspglyglnglylysalahisasnglyargleuilethrala340345350asnprovalvalthrlyslysglugluprovalasnileglualaglu355360365propropheglygluserasnilevalileglyileglyasplysala370375380leulysileasntrptyrlyslysgly385390<210>4<211>395<212>prt<213>登革4<400>4metargcysvalglyvalglyasnargaspphevalgluglyvalser151015glyglyalatrpvalaspleuvalleugluhisglyglycysvalthr202530thrmetalaglnglylysprothrleuaspphegluleuilelysthr354045thralalysgluvalalaleuleuargthrtyrcysileglualaser505560ileserasnilethrthralathrargcysprothrglnglyglupro65707580tyrleulysglugluglnaspglnglntyrilecysargargaspval859095valaspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglygly100105110valvalthrcysalalysphesercysserglylysilethrglyasn115120125leuvalglnilegluasnleuglutyrthrvalvalvalthrvalhis130135140asnglyaspthrhisalavalglyasnaspthrserasnhisglyval145150155160thralathrilethrproargserproservalgluvallysleupro165170175asptyrglygluleuthrleuaspcysgluproargserglyileasp180185190pheasnglumetileleumetlysmetlyslyslysthrtrpleuval195200205hislysglntrppheleuaspleuproleuprotrpalaalaglyala210215220aspthrsergluvalhistrpasntyrlysgluargmetvalthrphe225230235240lysvalprohisalalysargglnaspvalthrvalleuglysergln245250255gluglyalamethisseralaleuthrglyalathrgluvalaspser260265270glyaspglyasnhismettyralaglyhisleulyscyslysvalarg275280285metglulysleuargilelysglymetsertyrthrmetcyssergly290295300lyspheserileasplysglumetalagluthrglnhisglythrthr305310315320valvallysvallystyrgluglyalaglyalaprocyslysvalpro325330335ilegluileargaspvalasnlysglulysvalvalglyargileile340345350serserthrprophealaglutyrthrasnservalthrasnileglu355360365leuglupropropheglyaspsertyrilevalileglyvalglyasp370375380seralaleuthrleuhistrpphearglysgly385390395<210>5<211>451<212>prt<213>人工序列<220><223>den4-80ezip<400>5metargcysvalglyvalglyasnargaspphevalgluglyvalser151015glyglyalatrpvalaspleuvalleugluhisglyglycysvalthr202530thrmetalaglnglylysprothrleuaspphegluleuilelysthr354045thralalysgluvalalaleuleuargthrtyrcysileglualaser505560ileserasnilethrthralathrargcysprothrglnglyglupro65707580tyrleulysglugluglnaspglnglntyrilecysargargaspval859095valaspargglytrpglyasnglycysglyleupheglylysglygly100105110valvalthrcysalalysphesercysserglylysilethrglyasn115120125leuvalglnilegluasnleuglutyrthrvalvalvalthrvalhis130135140asnglyaspthrhisalavalglyasnaspthrserasnhisglyval145150155160thralathrilethrproargserproservalgluvallysleupro165170175asptyrglygluleuthrleuaspcysgluproargserglyileasp180185190pheasnglumetileleumetlysmetlyslyslysthrtrpleuval195200205hislysglntrppheleuaspleuproleuprotrpalaalaglyala210215220aspthrsergluvalhistrpasntyrlysgluargmetvalthrphe225230235240lysvalprohisalalysargglnaspvalthrvalleuglysergln245250255gluglyalamethisseralaleuthrglyalathrgluvalaspser260265270glyaspglyasnhismettyralaglyhisleulyscyslysvalarg275280285metglulysleuargilelysglymetsertyrthrmetcyssergly290295300lyspheserileasplysglumetalagluthrglnhisglythrthr305310315320valvallysvallystyrgluglyalaglyalaprocyslysvalpro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