通過引用并入優(yōu)先權(quán)申請

本申請要求于2014年12月19日提交的美國臨時申請第62/094802號的權(quán)益，將其通過引用整體并入本文。依據(jù)37cfr1.57，在此將在與本申請一起提交的申請數(shù)據(jù)單中確定的國外優(yōu)先權(quán)聲明或國內(nèi)優(yōu)先權(quán)聲明的任何和所有申請通過引用并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于評價血栓性微血管病，特別是移植相關(guān)血栓性微血管病的風(fēng)險的系統(tǒng)和方法。一些實施方案包括在被鑒定為具有升高風(fēng)險的對象中選擇和給予移植相關(guān)血栓性微血管病的治療。

發(fā)明背景

移植相關(guān)血栓性微血管病(tma)為與造血干細(xì)胞移植(hsct)相關(guān)的并發(fā)癥。參見jodele,s.,等人，(2014)blood124(4):645-653；ricklin,d.,等人，(2013)blood122(12):1997-1999；meri,s.(2013)eur.j.intern.med.24(6):496-502；chima,r.s.等人，(2013)pediatr.clin.northam.60(3):689-707；abboud,i.等人，(2012)semin.hematol.49(1):73-82，將其全部通過引用整體并入本文。tma的范圍可以從輕度、自限形式至導(dǎo)致死亡的不受控制的暴發(fā)性疾病。疾病嚴(yán)重程度異質(zhì)性背后的原因目前是未知的。

tma發(fā)生于當(dāng)在hsct情況下的內(nèi)皮損傷引起微血管病性溶血性貧血和血小板耗損，導(dǎo)致微循環(huán)中的血栓形成和纖維蛋白沉積，影響多個器官時。使用嚴(yán)格的前瞻性監(jiān)測，可以在30-35％的hsct接受者中鑒定出tma并且在約一半的那些病例中進展至威脅生命的疾病。在沒有嚴(yán)格監(jiān)測的情況下，嚴(yán)重的tma病例可能無法正確地診斷，并且tma相關(guān)的死亡常常被記錄為不明病因的多系統(tǒng)器官衰竭。參見meri,s.(2013)eur.j.intern.med.24(6):496-502；laskin,b.l.,等人，(2011)blood118(6):1452-1462和cho,b.s.,等人，(2010)transplantation90(8):918-926，將其通過引用整體并入本文。

目前，可以使用公開的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷tma，包括例如cho,b.s.等人，(2010)transplantation90(8):918-926提出的那些診斷標(biāo)準(zhǔn)，其包括(1)乳酸脫氫酶(ldh)升高到對象年齡的正常上限以上；(2)血小板計數(shù)<50×10⁹/l或血小板計數(shù)降低≥50％的新生血小板減少癥；(3)血紅蛋白低于正常下限的新生貧血或需要輸血支持的貧血；(4)被定義為外周血中存在裂細(xì)胞或組織樣本上存在微血管病的組織學(xué)證據(jù)的微血管病變；和(5)不存在凝血病和陰性的coombs試驗，特別是在患有tma的對象中測量adamts13活性水平以排除血栓性血小板減少性紫癜的診斷的情況下。另外的診斷標(biāo)準(zhǔn)的實例可以包括蛋白尿、高血壓和末端補體激活。

目前使用實驗室指標(biāo)和試驗(包括蛋白尿>30mg/dl和升高的sc5b-9(補體系統(tǒng)的可溶性膜攻擊復(fù)合物))評估tma診斷結(jié)果差的風(fēng)險因素；參見jodele等人，(2014)blood124(4):645-53。然而，目前沒有直接的方法來解決移植相關(guān)的tma的個體易感性，也沒有可用的移植前篩選工具可用于鑒定處于嚴(yán)重tma風(fēng)險的對象。

發(fā)明概述

本文公開了對象中移植相關(guān)血栓性微血管病預(yù)后的方法。在一些實施方案中，所述方法包括以下步驟：(1)從對象獲得含有遺傳物質(zhì)的生物樣品；(2)確定所述生物樣品中補體相關(guān)基因中的遺傳變體；和(3)基于所述生物樣品中確定的所述遺傳變體，指定所述對象發(fā)展血栓性微血管病的風(fēng)險水平和所述血栓性微血管病的嚴(yán)重程度，其中當(dāng)未鑒定出遺傳變體時，所述風(fēng)險水平對應(yīng)于低風(fēng)險；當(dāng)鑒定出一種遺傳變體時，所述風(fēng)險水平對應(yīng)于升高的風(fēng)險；以及當(dāng)鑒定出兩種或更多種遺傳變體時，所述風(fēng)險水平對應(yīng)于高風(fēng)險。在一些實施方案中，生物樣品為血液、唾液、皮膚或者其它組織或流體。

本文還公開了治療移植相關(guān)血栓性微血管病的方法，其包括進行上述預(yù)后方法，并進一步指導(dǎo)在鑒定出一種或多種遺傳標(biāo)志物的對象中觀察對象血栓性微血管病癥狀的出現(xiàn)，以及指導(dǎo)這些對象撤銷補體激活療法。在一些其它實施方案中，所述方法指導(dǎo)向發(fā)現(xiàn)具有多種遺傳變體的對象給予有效量的預(yù)防性治療或補體修飾療法。在一些其它實施方案中，所述補體修飾療法選自依庫珠單抗、利妥昔單抗、純化的人c1酯酶抑制劑或血漿置換術(shù)。

本文還公開了用于預(yù)測對象中血栓性微血管病的預(yù)后或發(fā)生風(fēng)險的試劑盒，其包括被配置成擴增來自所述對象的補體介導(dǎo)的基因或?qū)ζ溥M行測序的一組核酸引物。在一些實施方案中，所述試劑盒包括一組核酸引物，用于cd46、thbd、cfh、cfi、cfb、c3、c5、cfd、cfhr1、cfhr3、cfhr4、cfhr5、cfp、c4bpa、cd59、cd55和adamts13基因或其任何子集的擴增或測序。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括探針，其被配置成與來自cd46、thbd、cfh、cfi、cfb、c3、c5、cfd、cfhr1、cfhr3、cfhr4、cfhr5、cfp、c4bpa、cd59、cd55和adamts13或其任何子集的基因座中的遺傳變體結(jié)合。在一些實施方案中，用熒光染料、比色染料、放射性同位素或自旋標(biāo)記來標(biāo)記探針。在一些實施方案中，探針可以連接至固體支持物或存在于陣列中。在一些實施方案中，將用于擴增所述基因座的引物摻入序列標(biāo)簽。在一些實施方案中，引物連接至固體支持物或存在于陣列中。在一些其它實施方案中，所述試劑盒還包括選自樣品收集容器、樣品收集器具和樣品保存室的樣品收集裝置。

附圖簡述

在所附權(quán)利要求中具體示出本發(fā)明的新特征。參考下述示出說明性實施方案的詳述可以獲得對本發(fā)明特征和優(yōu)勢的更好的理解，其中利用了本發(fā)明的原理，并且其中附圖為：

圖1示出測試的患者群體內(nèi)一組限定的基因變體的分布。該圖顯示群體內(nèi)鑒定的基因變體頻率的“熱圖”。每個垂直列標(biāo)記了14種測試基因，一些具有多種變體(從“熱圖”顯示中排除了cfp、c4bpa和cd59三種基因，因為在該組患者中未檢測到這些變體的存在)。數(shù)值表1-42(第二行)與表2中列出的具體基因變體相關(guān)。每條水平線代表一個研究對象，其中每個研究對象均為造血干細(xì)胞移植(hsct)接受者。雜合變體色彩較暗，以及純合變體顯示為黑色。該圖示出在所有77名hsct接受者中鑒定的基因變體：77個對象中有26個對象(34％)檢測到至少一種基因變體。

圖2進一步示出與未被診斷為tma的那些對象相比，被診斷為tma的對象中所測試的患者群體內(nèi)基因變體的分布。該圖顯示群體內(nèi)鑒定的基因變體頻率的“熱圖”。每個垂直列標(biāo)記了14種測試基因，一些具有多種變體(從“熱圖”顯示中排除了cfp、c4bpa和cd59三種基因，因為在該組患者中未檢測到這些變體的存在)。數(shù)值表1-42(第二行)與表2中列出的具體基因變體相關(guān)。每條水平線代表一個研究對象，其中每個研究對象均為hsct接受者。雜合變體色彩較暗，以及純合變體顯示為黑色。該圖顯示鑒定的大多數(shù)基因變體發(fā)生在患有tma的hsct接受者中(上圖，n＝34)，而在未患tma的hsct接受者中觀察到很少的變體(下圖，n＝43)。在患有tma的接受者中觀察到的測試的基因變體的中位數(shù)為1(0-7)，以及在未患tma的接受者中觀察到的測試的基因變體的中位數(shù)為0(0-2)(p<0.0001)。

圖3進一步示出測試的患者群體內(nèi)基因變體的分布。該圖顯示群體內(nèi)鑒定的基因變體頻率的“熱圖”。每個垂直列標(biāo)記了14種測試基因，一些具有多種變體(從“熱圖”顯示中排除了cfp、c4bpa和cd59三種基因，因為在該組患者中未檢測到這些變體的存在)。數(shù)值表1-42(第二行)與表2中列出的具體基因變體相關(guān)。每條水平線代表一個研究對象，其中每個研究對象均為hsct接受者。雜合變體色彩較暗，以及純合變體顯示為黑色。該圖顯示通過種族和tma分隔的基因變體分布。所有十個(100％)患有tma的非白人檢測到至少一種變體，而12/24(50％)的白人接受者含有鑒定的變體。在患有tma的非白人接受者(n＝7)中僅鑒定出三種或更多種(3-7)變體；這7個對象中有5個對象(71％)死于嚴(yán)重的tma，表明種族和補體基因變體對tma表型的影響。cfd變體c.357+16c>a(標(biāo)記為32號，參見表2)僅在非裔美國人hsct接受者中鑒定到。具有鑒定的基因變體的12個患有tma的白人中，僅3個含有兩種變體，以及另外的9個檢測到單一變體。在39個未患tma的非白人中僅有3人(7.7％)僅檢測到單一變體。

圖4示出與鑒定的基因變體數(shù)目相關(guān)的移植相關(guān)死亡率。將移植相關(guān)死亡率(trm,y-軸)繪制為時間(x-軸)的函數(shù)。含有0-2種檢測到的基因變體的患者中的trm以虛線給出，而含有≥3種檢測到的基因變體的患者中的trm以實線給出。使用卡普蘭-邁耶方法計算研究對象中的trm。使用對數(shù)秩檢驗發(fā)現(xiàn)這兩組顯著不同，p＝0.02。與含有0-2種變體的患者相比(在第1年為21％，以及在第3年為24％)，hsct之后第1年和第3年的trm在含有≥3種基因變體的患者中要高得多(在第1年為57％，以及在第3年為71％)。

圖5示出隨著時間的推移(tma診斷之后的月數(shù)，x-軸)，依庫珠單抗治療的高風(fēng)險tma患者(虛線)相對于未接受依庫珠單抗治療的具有高風(fēng)險特征的患者(歷史對照，實線)的總體存活率(存活概率，y-軸)。高風(fēng)險特征包括腎病范圍的蛋白尿和升高的sc5b-9水平。從tma診斷開始進行卡普蘭-邁耶和對數(shù)秩檢驗。接受依庫珠單抗療法的患有高風(fēng)險tma的患者具有好得多的存活概率(p＝0.002)。

詳述

本發(fā)明的實施方案包括用于治療或預(yù)防包括在高度易感的移植接受者中的tma的前瞻性風(fēng)險評估和干預(yù)的系統(tǒng)、方法和組合物。本文所述的系統(tǒng)、方法和組合物可以用于引導(dǎo)治療策略以改善結(jié)果，以及也可以用于至少部分解決先前在移植接受者中報道的種族差異。

移植后血栓性微血管病(ta-tma)為hsct的常見并發(fā)癥。然而，由于其嚴(yán)重程度的廣泛變化，許多病例自發(fā)解決而未進行干預(yù)或僅利用支持療法，直到臨床癥狀出現(xiàn)才進行常規(guī)篩選。目前，在移植之前，沒有篩選ta-tma的方法。這樣的測試將使醫(yī)療保健提供者能夠指導(dǎo)觀察可能發(fā)展ta-tma的患者，以便在病況進展的早期時間點檢測臨床癥狀，這導(dǎo)致改善的患者結(jié)果。此外，這樣的測試將允許撤銷可能引發(fā)或加劇ta-tma的療法以支持替代治療。這樣的測試還可以允許給予ta-tma的預(yù)防性治療，或在使患者結(jié)果最大化并且減少與ta-tma相關(guān)的發(fā)病率和死亡率的病況進展的時間點允許給予ta-tma的治療。因此，可以在hsct之前對患者給予的測試是必要的，以便為hsct患者提供足夠的觀察和支持性護理。這樣的測試也是治療或預(yù)防ta-tma的方法的組成部分。

一個實施方案為用于確定個體發(fā)展移植后血栓性微血管病的可能性的系統(tǒng)或方法。這些系統(tǒng)和方法可以包括(a)獲得與個體中一組預(yù)選生物標(biāo)志物中每個成員相關(guān)的一種或多種遺傳變異發(fā)生的知識，其中該組生物標(biāo)志物中的每個成員與補體途徑在遺傳上相關(guān)；(b)由獲得的知識產(chǎn)生個體的個性化生物標(biāo)志物特征；和(c)至少部分基于個性化生物標(biāo)志物特征確定個體發(fā)展移植后血栓性微血管病的風(fēng)險。實施方案還可以包括基于個體發(fā)展ta-tma的預(yù)測風(fēng)險來指導(dǎo)個體的另外的觀察和/或治療。在一個實施方案中，與補體途徑相關(guān)的生物標(biāo)志物包括以下表1所示的基因。

一個實施方案為用于確定個體在干細(xì)胞移植之后發(fā)展移植后血栓性微血管病的可能性的系統(tǒng)或方法。在一些實施方案中，本文所述的系統(tǒng)、方法和組合物包括用于確定對象在造血干細(xì)胞移植之后發(fā)展血栓性微血管病的風(fēng)險的方法。其它實施方案包括用于預(yù)測造血干細(xì)胞移植之后的對象中血栓性微血管病的嚴(yán)重程度的方法。一些其它實施方案包括用于確定在造血干細(xì)胞移植之后已經(jīng)發(fā)展或可能發(fā)展血栓性微血管病的對象的預(yù)后的方法。另外的實施方案包括用于治療或預(yù)防造血干細(xì)胞移植之后血栓性微血管病的方法。

其它實施方案包括用于指導(dǎo)造血干細(xì)胞移植之后已經(jīng)發(fā)展或可能發(fā)展血栓性微血管病的對象的治療的系統(tǒng)、方法和組合物。在一些實施方案中，本文所述的方法和組合物包括用于治療造血干細(xì)胞移植之后的血栓性微血管病的方法，其包括前瞻性評估病況的風(fēng)險和嚴(yán)重程度的步驟。

定義

如本文所用，“對象”包括脊椎動物，其包括但不限于哺乳動物、人和人類患者?！皩ο蟆笨梢园ń?jīng)歷移植，包括造血干細(xì)胞移植的哺乳動物、人或人類患者。如本文所用，“對象”和“患者”可以互換使用。

如本文所用，“樣品”包括從活系統(tǒng)或?qū)ο螳@得的任何樣品，其包括流體、血液、血清、組織或細(xì)胞。在一些實施方案中，通過微創(chuàng)或非侵入性方法(例如，尿液收集，糞便收集，抽血，針吸，粘膜拭子，唾液收集和涉及最小風(fēng)險、不適或努力的其它程序)進行取樣來獲得樣品。樣品可以為固體(例如，組織)、氣態(tài)(例如，呼出氣)或液體/流體。液體樣品包括但不限于尿液、血液、間質(zhì)液、水腫液、唾液、淚液、炎性滲出物、滑液、膿腫、積膿或其它被感染的流體、腦脊髓液、汗液、肺分泌物(痰)、精液、排泄物、膽汁、腸分泌物等。樣品還包括臨床樣品，如血清、血漿、其它生物流體或組織樣品。樣品還可以包括培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液。樣品可以在體內(nèi)或為離體的。

如本文所用，術(shù)語“變體”或“基因變體”是指在序列上分別與參考核酸序列或肽序列不同，但保留參考分子的基本特性的核酸序列或肽序列。核酸變體序列的變化可能不改變參考核酸編碼的肽的氨基酸序列或者可能導(dǎo)致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。肽變體序列的變化通常為有限的或保守的，所以參考肽和變體的序列在整體上密切相似，并且在許多區(qū)域中相同。變體和參考肽可以通過一個或多個以任何組合的取代、添加、缺失而在氨基酸序列上不同。核酸或肽的變體可以是天然存在的如等位基因變體，或可以是不知是天然存在的變體。非天然存在的核酸和肽變體可以通過誘變技術(shù)或通過直接合成來制備。

如本文所用，“預(yù)后”是指事件或病況發(fā)生的可能性的前瞻性確定，以及所述事件或病況的可能的嚴(yán)重程度的評估。這樣的嚴(yán)重程度評估可以包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在進行預(yù)后評估時已知的發(fā)病率、死亡率或其它臨床結(jié)果的任何臨床指標(biāo)或預(yù)測因子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將被推定為意識到當(dāng)時該領(lǐng)域的護理標(biāo)準(zhǔn)，以及對護理標(biāo)準(zhǔn)任何可預(yù)見或明顯的改善，如潛在的藥物、手術(shù)或可以改善、加劇或在其它方面改變病況進程的其它干預(yù)。

如本文所用，術(shù)語“造血干細(xì)胞移植”是指來源于骨髓或外周血或臍帶血的干細(xì)胞的移植。這樣的移植可以為自體的，其涉及從患者收集的細(xì)胞；或者為同種異體的，其利用來自除患者之外的供體的細(xì)胞。這樣的移植可以包括在引入移植血液干細(xì)胞之前使用高劑量的化療或放療，包括全身照射以消除病變細(xì)胞。

如本文所用，血栓性微血管病(tma)是指微血管病性溶血性貧血和血小板耗損，其導(dǎo)致微循環(huán)中的血栓形成和纖維蛋白沉積。如本文所用，可以使用cho等人(2010)transplantation90(8):918-926和jodele,s.等人，(2015)bloodrev.29(3):191-204提出的公開診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷tma，將上述文獻通過引用整體并入本文。這些標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于(1)乳酸脫氫酶(ldh)升高到對象年齡的正常上限以上；(2)血小板計數(shù)<50×10⁹/l或血小板計數(shù)降低≥50％的新生血小板減少癥；(3)血紅蛋白低于正常下限的新生貧血或需要輸血支持的貧血；(4)被定義為外周血中存在裂細(xì)胞或組織樣本上存在微血管病的組織學(xué)證據(jù)的微血管病變；(5)蛋白尿，其中隨機尿分析蛋白濃度≥30mg/dl；(6)高血壓，其包括兒科患者的患者年齡、性別和身高的第95百分位數(shù)值的血壓，以及成人中≥140/90mmhg血壓；(7)末端補體激活，如通過sc5b-9升高的血漿濃度在正常實驗室上限之上所示的；和(8)不存在凝血病和陰性的coombs試驗，特別是在患有tma的對象中測量adamts13活性以排除血栓性血小板減少性紫癜的診斷的情況下。應(yīng)理解，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠利用諸如進行臨床診斷時本領(lǐng)域現(xiàn)狀已知的、顯而易見的或可預(yù)見的替代診斷標(biāo)準(zhǔn)。

如本文所用，“臨床診斷”是指參考對象的身體或生理狀態(tài)的觀察而進行的生理學(xué)狀況的診斷，其包括參考諸如在進行診斷時相關(guān)領(lǐng)域現(xiàn)狀包括的實驗室測試。

如本文所用，“治療(treatment)”(及其語法變型，如“治療(treat或treating)”)是指設(shè)計以在臨床病理學(xué)期間改變正治療的個體或細(xì)胞的自然過程的臨床干預(yù)。期望的治療效果包括但不限于降低疾病進展速度、改善或減輕疾病狀態(tài)以及緩解或改善預(yù)后。

如本文所用，“預(yù)防”包括提供關(guān)于個體中疾病或與疾病相關(guān)的癥狀的出現(xiàn)或復(fù)發(fā)的預(yù)防。個體可以易患、易感或處于發(fā)展疾病的風(fēng)險中，但尚未被診斷患有該疾病。

如本文所用，“有效量”或“治療有效量”是指作為單劑量或作為一系列劑量的一部分施用于哺乳動物對象，有效產(chǎn)生期望的治療效果的治療化合物(如補體抑制劑)的量。

如本文所用，除非另有規(guī)定，否則“補體”或“補體系統(tǒng)”是指哺乳動物先天免疫系統(tǒng)的補體系統(tǒng)，例如，如male等人,(2006)immunology(第7版)pp.87-104中所述，其至少包括表1中列出的基因及其轉(zhuǎn)錄本和產(chǎn)物。

如本文所用，“補體修飾療法”是指這樣的任何藥物、程序、生活方式改變或其它干預(yù)：其具有改變補體系統(tǒng)的任何組分的水平使得補體系統(tǒng)對患者的細(xì)胞、組織、器官或身體的影響降低的作用，或具有以其它方式減輕補體系統(tǒng)對患者的細(xì)胞、組織、器官或身體的影響的作用。此類影響的變化或降低可以通過與補體系統(tǒng)的組分的直接相互作用實現(xiàn)或間接實現(xiàn)?！把a體激活療法”應(yīng)被理解為指這樣的任何藥物、程序、生活方式改變或其它干預(yù)：其具有通過直接或間接改變補體系統(tǒng)的任何組分的水平或活性或者通過本領(lǐng)域已知的其它手段來維持或增加補體系統(tǒng)對患者的細(xì)胞、組織、器官或身體的影響的作用。

如本文所用，“篩選”是指評價基因，包括但不限于其序列、表達(dá)水平、甲基化狀態(tài)、差異剪接、rna編輯或染色質(zhì)狀態(tài)的任何方法。用于篩選的方法為諸如以下公開的用于確定和評價核酸序列的方法；以及諸如本領(lǐng)域已知的用于評價基因表達(dá)的方法，其包括但不限于rt-pcr和實時rt-pcr；以及用于確定核酸修飾和染色質(zhì)狀態(tài)的方法，如染色質(zhì)免疫沉淀、甲基化分析和組蛋白乙?；治觥?/p>

本發(fā)明的一個實施方案涉及補體激活與hsct患者中ta-tma的發(fā)展相關(guān)這一發(fā)現(xiàn)，并且我們已經(jīng)鑒定出已知在補體激活中起作用的17種候選基因的變體。我們發(fā)現(xiàn)這些基因中的基因突變可以預(yù)測血管損傷和移植之后tma的嚴(yán)重程度。此處，我們描述單獨的移植前基因篩選或與允許選擇能夠從具體干預(yù)中獲益的高風(fēng)險hsct接受者的功能測試組合的方法。這對于以下尤其如此：hsct為計劃的治療程序，并且可以根據(jù)這些基因的遺傳變異修改移植策略。例如，通常用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和西羅莫司治療hsct患者以降低排斥風(fēng)險或預(yù)防移植物抗宿主病(gvhd)。然而，這些療法還與增加的ta-tma風(fēng)險相關(guān)。通過在hsct程序之前確定ta-tma風(fēng)險，可以將用于控制急性gvhd的替代策略，如離體t-細(xì)胞清除或者使用光分離置換法(prophylaxis)作為預(yù)防法應(yīng)用于具有升高的ta-tma風(fēng)險的患者。

通過在器官損傷發(fā)生之前分析這17種補體激活基因中的遺傳變體并鑒定早期治療干預(yù)的高風(fēng)險患者，總體移植結(jié)果應(yīng)當(dāng)改善。

在一些情況下，補體抑制藥物如依庫珠單抗(alexionpharmaceuticals,cheshire,ct)、其它補體阻斷劑或補體修飾療法如血漿置換術(shù)可以用更可靠的補體阻斷較早開始，一旦通過發(fā)現(xiàn)下表1中所述的補體基因的變體而發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的風(fēng)險，所述補體阻斷可能將導(dǎo)致治療應(yīng)答的進一步改善。

本文公開了確定造血干細(xì)胞移植之后患者發(fā)展ta-tma的風(fēng)險的系統(tǒng)和方法，其包括確定表1中鑒定的任何基因中的變體是否存在于移植接受者中。

表1：

這樣的變體包括但不限于表2中列出的那些變體：

表2：

*rs#：參考snp簇id；&染色體；maf(ea)：基于來自evs數(shù)據(jù)庫(nhlbi外顯子組測序項目)的數(shù)據(jù)的歐裔美國人的最小等位基因頻率；maf(aa)：基于來自evs數(shù)據(jù)庫(nhlbi外顯子組測序項目)的數(shù)據(jù)的非裔美國人的最小等位基因頻率。

一個實施方案為通過以下確定個體發(fā)展移植后血栓性微血管病的可能性的方法：(a)獲得與個體中一組預(yù)選生物標(biāo)志物的每個成員相關(guān)的一種或多種遺傳變異發(fā)生的知識，其中該組生物標(biāo)志物的每個成員與補體途徑在遺傳上相關(guān)；(b)由獲得的知識產(chǎn)生個體的個性化生物標(biāo)志物特征；和(c)至少部分基于個性化生物標(biāo)志物特征確定個體發(fā)展移植后血栓性微血管病的可能性。

在一些實施方案中，該組預(yù)選生物標(biāo)志物包含表1中公開的一組基因中的變體。在一些其它實施方案中，該組預(yù)選生物標(biāo)志物包含表2中公開的基因變體。

在一些實施方案中，方法包括確定個體中表1中公開的所有17種基因的基因變體。在其它實施方案中，該方法包括篩選表1中公開的任何16種基因的可能變化。在其它實施方案中，該方法包括篩選表1中公開的任何15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1種基因。還應(yīng)理解，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到另外的基因座，包括另外的補體相關(guān)的基因，作為其中遺傳變體將可預(yù)知地對于ta-tma風(fēng)險具有等同的預(yù)測價值的基因座。

一些實施方案包括通過在補體相關(guān)基因中未發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)很少相關(guān)變體來確定在患者中發(fā)展ta-tma的風(fēng)險。這表明個體具有較低的發(fā)展ta-tma的風(fēng)險或個體具有嚴(yán)重形式的ta-tma的較低的風(fēng)險。補體相關(guān)基因列表中一種相關(guān)變體的發(fā)現(xiàn)可表明升高的發(fā)展ta-tma的風(fēng)險或個體具有嚴(yán)重形式的ta-tma的升高的風(fēng)險。補體相關(guān)基因中兩種至三種變體的發(fā)現(xiàn)可表明較高的發(fā)展ta-tma的風(fēng)險或個體具有嚴(yán)重形式的ta-tma的較高的風(fēng)險。補體相關(guān)基因中三種或更多種相關(guān)變體的發(fā)現(xiàn)可表明個體發(fā)展ta-tma的高風(fēng)險或個體具有嚴(yán)重形式的ta-tma的高風(fēng)險。在一些實施方案中，相關(guān)變體為表2中公開的那些變體。

在一些實施方案中，通過從對象獲得生物樣品，并通過核苷酸測序?qū)悠穬?nèi)的遺傳物質(zhì)進行分析來實施確定與補體相關(guān)基因相關(guān)的遺傳變異的方法。在一個實施方案中，核苷酸測序可以通過由illumina(sandiego,ca)或thermofisher(sandiego,ca)制造的眾所周知的下一代測序儀進行。還考慮了確定補體相關(guān)基因中變體的其它方法。例如，可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、逆轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)、實時rt-pcr；單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)分析或微陣列分析來分析生物樣品。另外的技術(shù)可以包括消減雜交或雜交分析，其包括通過熒光雜交和/或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)分析。本申請考慮了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于鑒定遺傳基因座中多態(tài)性的任何其它方法。

在一些實施方案中，提供了探針，其包含能夠選擇性鑒定相關(guān)基因座或區(qū)分變體的分子。這樣的探針可以包括但不限于核糖核酸分子、脫氧核糖核酸分子、肽核酸分子、支鏈核酸分子、核酸模擬物以及能夠鑒定指定的基因座或區(qū)分序列變體的任何其它分子。在一些實施方案中，這樣的探針可以包含人工序列標(biāo)簽。在一些實施方案中，探針可以包含用于pcr或測序的引物。在一些實施方案中，探針可以結(jié)合至基底。在一些實施方案中，探針可以摻入放射性標(biāo)記、比色標(biāo)記、熒光標(biāo)記、自旋標(biāo)記、光譜標(biāo)記或者允許探針檢測的其它方法。

如上所述，在一些實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)包括陣列系統(tǒng)。陣列的非限制性實例包括微陣列、珠子陣列、通孔陣列、阱陣列(wellarray)和本領(lǐng)域已知的適用于將探針與靶標(biāo)雜交的其它陣列。陣列可以以任何適當(dāng)?shù)呐渲貌贾?，如例如，行和列的網(wǎng)格。陣列的一些區(qū)域包括序列變體檢測探針，而其它區(qū)域可以用于圖像取向、歸一化對照、信號縮放、降噪處理或者其它分析。對照探針可以置于陣列中的任何位置，其包括沿陣列的周邊、對角地穿過陣列、以交替部分或隨機放置。在一些實施方案中，陣列上的對照探針包括正義和反義探針的探針對。對照探針的數(shù)目可以變化，但通常陣列上對照探針的數(shù)目范圍為1至約500,000。在一些實施方案中，存在至少10、100、500、1,000、5,000、10,000、25,000、50,000、100,000、250,000或500,000個對照探針。當(dāng)使用對照探針對時，探針對的范圍為1至約250,000對。在一些實施方案中，存在至少5、50、250、500、2,500、5,000、12,500、25,000、50,000、125,000或250,000個對照探針對。除探針之外陣列可以含有其它組分，如將探針連接到支持物的接頭。在一些實施方案中，用于制造陣列的材料可以獲自affymetrix(santaclara,california)、gehealthcare(littlechalfont,buckinghamshire,unitedkingdom)或agilenttechnologies(paloalto,california)。

除將探針連接至陣列基底的陣列之外，在公開的系統(tǒng)中可以采用許多其它的技術(shù)用于實施本發(fā)明的方法。在一個實施方案中，如ng等人(ng等人，(2008)biosensors&bioelectronics23:803-810)所公開的將探針連接至珠子，然后將其置于陣列上。

在另一實施方案中，如美國專利6,524,793中所公開的，將探針連接至珠子或微球上，在溶液中進行雜交反應(yīng)，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析珠子，如通過luminex多重分析系統(tǒng)所示例的。在該分析系統(tǒng)中，將同質(zhì)珠子亞組(每個含有標(biāo)志或標(biāo)記有多個相同探針的珠子)組合以產(chǎn)生與樣品雜交的合并的珠子組，然后用流式細(xì)胞術(shù)實時分析。珠子亞組可以通過標(biāo)簽或標(biāo)記的變化，例如使用激光可激發(fā)染料含量的變化彼此區(qū)分開。

在又一實施方案中，如通過veracode多重分析系統(tǒng)所例示的，將探針連接至圓柱形玻璃微珠上。此處，嵌有相同數(shù)字全息元件的微柱亞組被用于產(chǎn)生獨特的探針標(biāo)記的微珠亞組。在雜交之后，微珠被激光激發(fā)，并且在實時多重分析中讀取微珠代碼和探針標(biāo)記。

在另一實施方案中，采用如nanostringncounter分析系統(tǒng)(geiss,g.等人，(2008)naturebiotechnol.26:317-325)所例示的基于溶液的分析系統(tǒng)。使用該方法，將樣品與識別獨特序列的報告探針的溶液混合，并捕獲探針，其允許樣品中的核酸與報告探針之間形成的復(fù)合物固定在固體表面用于數(shù)據(jù)收集。每個報告探針均為彩色編碼的并且通過熒光檢測到。

在又一實施方案中，使用如panomicsquantigeneplex2.0分析系統(tǒng)所例示的支鏈dna技術(shù)。支鏈dna技術(shù)包括用于rna檢測和定量的夾心核酸雜交分析，其放大報告信號而非序列。通過測量樣品來源的rna，該分析避免了靶標(biāo)多核苷酸的提取和擴增中固有的變異或錯誤。可將quantigeneplex技術(shù)與基于多重珠分析系統(tǒng)如上文所述的luminex系統(tǒng)組合，以能夠直接從全細(xì)胞或純化的rna制備物同時定量多個rna靶標(biāo)。

在一些實施方案中，本文所述的方法和組合物包括用于預(yù)防hsct接受者中ta-tma的方法，其包括以下步驟：1)在移植之前，期間或之后，確定個體發(fā)展ta-tma的風(fēng)險，以及2)在具有升高的或高ta-tma風(fēng)險的個體中，撤銷已知引發(fā)或加劇補體激活的療法。這樣的療法包括但不限于鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和西羅莫司(雷帕霉素)。此外，可以包括這樣的療法的替代選擇以降低移植物抗宿主病(gvhd)的可能性，其包括但不限于離體t-細(xì)胞清除和光分離置換法。在其它實施方案中，可以實施用于預(yù)防gvhd的替代療法和/或可以保留已知引發(fā)或加劇補體激活的療法直至已經(jīng)確定個體發(fā)展ta-tma的風(fēng)險之后。在其它實施方案中，確定個體發(fā)展ta-tma的風(fēng)險可以在移植程序期間確定。在其它實施方案中，確定個體發(fā)展ta-tma的風(fēng)險可以在移植程序之后確定。

在一些實施方案中，本文所述的方法和組合物包括用于治療hsct接受者中的ta-tma的方法，其包括以下步驟：在移植之前確定個體發(fā)展ta-tma的風(fēng)險，以及在升高的發(fā)展ta-tma的風(fēng)險時給以患者一種或多種補體修飾療法。這樣的補體修飾療法可以包括但不限于利妥昔單抗、依庫珠單抗和純化的人c1酯酶抑制劑。這樣的補體修飾療法還可以包括但不限于諸如血漿置換術(shù)的程序。

在一些實施方案中，本文所述的方法和組合物包括用于指導(dǎo)hstc接受者治療的方法，其包括以下步驟：確定個體發(fā)展移植后血栓性微血管病的可能性，以及使用發(fā)展的風(fēng)險特征來指導(dǎo)醫(yī)療保健提供者觀察處于升高的發(fā)展ta-tma的對象的ta-tma的早期臨床癥狀。在一些其它實施方案中，該方法指導(dǎo)通過本文方法確定為處于ta-tma低風(fēng)險的個體(例如，不具有表2中給出的鑒定的變體或其等同物的那些個體)進行ta-tma癥狀發(fā)展的有限的一般觀察；而指導(dǎo)密切觀察通過本文的方法確定為處于升高的ta-tma風(fēng)險的個體(例如，具有表2中給出的鑒定的變體之一或其等同物的那些個體)，其包括在發(fā)展tma癥狀的hsct程序之后，立即實施所有必需的臨床和實驗室測試，并在那些癥狀發(fā)作后立即治療；指導(dǎo)通過本文的方法確定為處于發(fā)展ta-tma的高風(fēng)險的患者(例如，具有表2中給出的一種或兩種鑒定的變體或其等同物的那些患者)阻止開始西羅莫司或鈣調(diào)磷酸酶抑制劑療法的過程，支持降低gvhd風(fēng)險的替代方法；以及指導(dǎo)通過本文公開的方法確定為處于非常高的風(fēng)險的患者(例如，具有表2中給出的兩種、三種或更多種鑒定的變體或其等同物的那些患者)除了利用西羅莫司或鈣調(diào)磷酸酶抑制劑療法的替代選擇之外，用諸如依庫珠單抗的補體阻斷藥物進行治療。

在一些實施方案中，本文所述的組合物和方法包括用于確定對象發(fā)展ta-tma的風(fēng)險以及確定對象中ta-tma的可能嚴(yán)重程度的預(yù)后的試劑盒。在一些實施方案中，這樣的試劑盒包括用于pcr擴增與ta-tma相關(guān)的基因組區(qū)域的寡核苷酸引物。在一些實施方案中，這樣的試劑盒包括用于pcr擴增對應(yīng)于表1中指定的基因的序列的寡核苷酸引物。在一些實施方案中，這樣的試劑盒包括用于檢測與ta-tma相關(guān)的序列變體的標(biāo)記的核苷酸探針。在一些實施方案中，這樣的試劑盒包括與基底結(jié)合的用于檢測與ta-tma相關(guān)的序列變體的核苷酸探針。在一些實施方案中，試劑盒包括用于檢測與ta-tma相關(guān)的序列變體的核苷酸探針陣列。在一些實施方案中，這樣的試劑盒包括用于檢測表1中鑒定的所有17個序列的pcr引物、標(biāo)記的探針、與基底結(jié)合的探針和/或其它組合物。在一些實施方案中，這樣的試劑盒包括用于檢測表1中鑒定的任何16個、任何15個、任何14個、任何13個、任何12個、任何11個、任何10個、任何9個、任何8個、任何7個、任何6個、任何5個、任何4個、或任何3個序列的pcr引物、標(biāo)記的探針、與底物結(jié)合的探針或其它組合物。在一些實施方案中，這樣的試劑盒包括根據(jù)本文所述的方法對應(yīng)通過使用試劑盒提供的風(fēng)險確定指導(dǎo)對象治療的說明性材料。

實施例1

為進一步探索tma的機制，我們對已知在補體激活中起作用的17種候選基因進行了前瞻性分析。參見jodeles,等人，(2015)bloodnov24.pii:blood-2015-08-663435.(付印之前的電子文檔公開)，將其通過引用整體并入本文。

研究對象

從2010年9月直至2011年12月，辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心(cchmc)經(jīng)歷hsct的100名連續(xù)患者在機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)后登記進入前瞻性tma生物標(biāo)志物研究。使用如先前所述的前瞻性監(jiān)測，39％的對象滿足tma的標(biāo)準(zhǔn)(jodeles,等人，(2014)blood.124(4):645-653)。tma診斷標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)乳酸脫氫酶(ldh)在正常上限之上；(2)血小板計數(shù)<50×10⁹/l或血小板計數(shù)降低≥50％的新生血小板減少癥；(3)血紅蛋白低于正常下限的新生貧血或需要輸血支持的貧血；(4)被定義為外周血中存在裂細(xì)胞或微血管病的組織學(xué)證據(jù)的微血管病變；和(5)不存在凝血病和陰性的coombs試驗。在tma顯現(xiàn)時間測量adamts13的活性以排除血栓性血小板減少性紫癜(ttp)的診斷。tma確診日期被定義為滿足所有診斷標(biāo)準(zhǔn)的第一個日期。在本研究中存在90名同種異體移植接受者，并且具有充足的基因組移植前dna的那些移植接受者(n＝77)參與遺傳分析。在cchmc移植的最近333名連續(xù)hsct接受者的擴展群組中進行結(jié)果分析，以檢測種族對tma的存活率和發(fā)生的影響。按照赫爾辛基宣言進行該研究。

遺傳測試

在移植之前從接受者的血液分離基因組dna。選擇其它血栓性微血管病的發(fā)病機理中涉及的17種基因進行測試。參見meris(2013)eurjinternmed.24(6):496-502,buf,等人，(2014)jam.soc.nephrol.25(1):55-64,fengs,等人，(2013)blood122(8):1487-1493,bresine,等人，(2013)jamsocnephrol.24(3):475-486,crovettof,等人，(2012)jmatern.fetalneonatalmed.25(11):2322-2325和jodeles,等人，(2013)blood.122(12):2003-2007。測試的基因為：cfh、cfhr1、cfhr3、cfhr4、cfhr5、cd55、cd59、cd46、cfi、cfb、cfp、c5、adamts13、cfd、c3、c4bpa和thbd。使用微滴pcr技術(shù)(raindancetechnologiesinc.,usa)富集/捕獲所有外顯子、側(cè)翼的內(nèi)含子和非翻譯區(qū)(5’和3’)。在illuminahiseq2500儀器(illuminainc.,usa)上使用下一代測序技術(shù)對富集的靶標(biāo)以每個靶堿基>20倍的覆蓋率進行測序。將所得的序列讀取與參考dna序列比對，并且使用nextgene軟件(softgenetics,llc,usa)分析變體。將觀察到的變體與dbsnp(ncbi)進行比較。使用實驗室開發(fā)的生物信息學(xué)工具進一步評價新變體(sivakumaranta,等人，(2013)otolaryngol.headnecksurg.148(6):1007-1)。通過集中于編碼、讀框移位(插入缺失)、無義和剪接修飾改變來過濾變體。基于來自evs數(shù)據(jù)庫(nhlbi外顯子組測序項目)的數(shù)據(jù)，罕見變體被定義為歐裔美國人群或非裔美國人群中最小等位基因頻率小于1％的變體。預(yù)測的致病突變?yōu)槭褂糜嬎銠C模擬分析，包括sift、polyphen2、mutationtaster、aligngvgd和humansplicingfinder剪接位點預(yù)測算法具有高致病性預(yù)測的變體。通過sanger測序(appliedbiosystem)確認(rèn)所有鑒定的變體。此外，使用多重連接依賴的探針擴增(mlpa)方法(mrcholland,amersterdam,netherlands)檢測cfhr3/cfhr1基因座處的缺失。為了完整，我們還包括同義變體。這些對于氨基酸序列變體而言在其它方面的中性能夠產(chǎn)生隱蔽的拼接位點，并代表對tma易感性重要的獨特單倍型，或者它們可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯。

rnaseq分析

基于樣品的可用性，通過辛辛那提大學(xué)的基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)和測序中心(genomics,epigenomicsandsequencingcore)(gesc)對來自具有鑒定的基因變體的8名患有tma的hsct接受者以及未患tma并且無任何鑒定的基因變體的8名hsct接受者的移植前全血單核細(xì)胞(mnc)進行rnaseq。對于該分析，我們選擇移植前rna(假定的靜止?fàn)顟B(tài))，因為我們希望檢測基因型的影響，而不是在移植過程期間補體激活的可能影響。將具有遺傳變體的每個基因以及與補體激活相關(guān)途徑的表達(dá)與患有或未患tma的hsct對象中相同基因的表達(dá)進行比較。

在illuminahiseq系統(tǒng)上使用標(biāo)準(zhǔn)的illumina方案進行50個核苷酸長單一末端讀取的rna測序。使用tophat比對器將序列讀取與參考人類基因組進行比對(trapnellc,等人，(2009)bioinformatics.25(9):1105-1111)，并且使用bioconductor包對與各已知轉(zhuǎn)錄本對齊的讀取進行計數(shù)，用于下一代測序數(shù)據(jù)分析。參見huberw,等人，(2015)natmethods.12(2):115-121。如deseqbioconductor包中實施的，基于讀取計數(shù)的負(fù)二項統(tǒng)計模型，分別對每個基因進行具有特定基因的變體的tma樣品與無變體的非tma樣品之間的差異表達(dá)分析(anderss,等人，(2013)natprotoc.8(9):1765-1786)。使用lr路徑方法(sartorma,等人，(2009)bioinformatics.25(2):211-217)以及基因列表和途徑的msigdb數(shù)據(jù)庫(subramaniana,等人，(2005)procnatlacadsciusa.102(43):15545-15550)分別對上調(diào)和下調(diào)的基因進行途徑富集分析。使用錯誤發(fā)現(xiàn)率調(diào)整富集p-值用于測試msigdb中的所有途徑(storeyjd和tibshiranir.(2003)procnatlacadsciusa.100(16):9440-9445)。

統(tǒng)計分析

報告了中位數(shù)(范圍)和頻率以分別描述連續(xù)變量和分類變量。分別使用fisher精確檢驗和wilcoxon檢驗比較連續(xù)變量和分類變量的組差異。使用卡普蘭-邁耶方法進行存活率和競爭風(fēng)險分析。將對數(shù)秩檢驗用于評估組中總體存活率的差異。將gray法用于檢驗組中累積發(fā)病率的差異。對于累積發(fā)病率，復(fù)發(fā)死亡或全因死亡率被認(rèn)為分別競爭非復(fù)發(fā)死亡率(nrm)和tma的分析中的風(fēng)險。使用r版本3.1.3進行分析。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)的，并且在p<0.05評估顯著性。

結(jié)果

研究人口統(tǒng)計和患者特征

登記進入研究的90名同種異體移植接受者中有77名具有足夠的移植前dna用于分析?；谇罢靶院Y選，這些hsct接受者中有34名具有tma的臨床診斷，以及43名不具有tma的臨床診斷。研究對象為18歲以下的兒童，并且大多數(shù)為白人男性。大多數(shù)患者(66％)具有非惡性病癥(包括骨髓衰竭或免疫缺陷)的hsct。干細(xì)胞來源主要為來自不相關(guān)供體(73％)的骨髓(78％)。相似數(shù)量的患者接受骨髓清除和減少強度方案(53％相對于47％)。

盡管非白人移植接受者僅構(gòu)成我們總研究群組的18％，但非白人具有比白人顯著更高的比例患有tma(71％相對于39％,p＝0.04)。所有移植接受者接受用于移植物抗宿主病(gvhd)預(yù)防的環(huán)孢霉素(csa)。使用統(tǒng)一的藥物監(jiān)測來維持250至350ng/ml的csa谷。發(fā)展成tma的患者與未發(fā)展成tma的患者之間的csa水平?jīng)]有差異(251.6和247.2ng/ml,p＝0.65)。患有范可尼貧血(fa)的兒童具有增加的tma發(fā)病率。這些是唯一接受t細(xì)胞消耗的pbsc和csa的病例，因此我們不能分辨增加的tma的風(fēng)險是否反映出患有fa的人中的增加的易感性或是否與治療方案本身相關(guān)。

類似地，具有惡性診斷的兒童接受csa和甲氨蝶呤用于gvhd預(yù)防。惡性腫瘤和接受甲氨蝶呤均與較低的tma發(fā)病率相關(guān)，因此我們不能鑒定診斷或治療方案是否影響tma發(fā)病率。沒有一個研究對象接受針對tma的任何靶向療法(例如，補體阻斷)。

鑒定的基因變體

在最初質(zhì)量控制(>20倍的覆蓋率，并且通過目測和sanger測序消除假陽性)之后鑒定了17種基因中的總共239種變體。沒有進一步考慮cfp、c4bpa和cd59這三種基因，因為未鑒定出變體。在排除深部內(nèi)含子和非翻譯區(qū)(utr)變體(n＝58)以及常見的單核苷酸多態(tài)性(snp)(n＝139)之后，我們鑒定了42種可能的功能變體，其包括15種先前報告的微血管病相關(guān)變體。在15種先前報告的變體中，已知6種為致病的，以及9種為具有不確定臨床顯著性的變體(vucs)。在27種先前未報告的變體中，通過用于預(yù)測序列變體的功能性結(jié)果的計算機方法，2種被預(yù)測為致病的，10種被認(rèn)為是vucs，以及15種被預(yù)測為可能是良性的。我們使用sift、polyphen2、mutationtaster、aligngvgd和humansplicingfinder剪接位點預(yù)測算法進行致病性預(yù)測以評價先前未描述的27種變體(2種無義變體、9種錯義變體、12種同義變體和3種剪切位點變體)。通過預(yù)測效果的性質(zhì)，cfhr1和cfhr3中的兩種無義變體被認(rèn)為是致病的，以及15種變體(包括同義和剪切位點變體)被預(yù)測為可能是良性的。由于預(yù)測算法的準(zhǔn)確性有限，許多人認(rèn)為僅約70％的時間是正確的，我們不想要忽略預(yù)測的良性變體的重要變化，因此將這些保留在分析中并且在可用樣品上進行基因表達(dá)分析(參見rnaseq分析)。

34％的測試對象(26/77)含有至少一種鑒定的基因變體(圖1)。圖2顯示根據(jù)hsct之后存在或不存在tma而分層的基因變體分布的“熱圖”，顯示了在患有tma的患者中的顯著較高頻率的變體。與未患tma的43個對象中的4個對象(9％)相比，患有tma的34個對象中有22種對象(65％)含有至少一種鑒定的基因變體(p<0.0001)。在cfhr5、cfi和adamts13中觀察到先前在其它微血管病中所述的致病變體，其全部存在于患有tma的接受者中。在tma診斷測試的adamts13活性在含有adamts13變體的對象中略有降低(43-50％)，但仍不符合ttp診斷的標(biāo)準(zhǔn)。先前已在ahus中報告了我們研究中觀察到的3種cfi變體，已知ttp中的2種adamts13變體和1種cfhr5變體引起cfh相關(guān)的蛋白缺乏癥。參見vernon,k.a.,等人，(2012)am.j.kidneydis.60(1):121-125；caprioli,j.,等人，(2006)blood108(4):1267-1279；camiller,r.s.,等人，(2012)j.thromb.haemost.10(9):1792-1801；liuf.,等人，(2005)zhonghuaxueyexuezazhi.26(9):521-524；和cayci,f.s.,等人，(2012)pediatr.nephrol.27(12):2327-2331，將其通過引用整體并入本文。

僅在患有tma的非裔美國人患者中檢測到cfd變體c.357+16c>a。在患有tma的接受者中觀察到的基因變體的中位數(shù)為1(范圍0-7)，以及在未患tma的接受者中觀察到的基因變體的中位數(shù)為0(范圍0-2)(p<0.0001)。除了ngs結(jié)果之外，通過mlpa檢測到兩名患有tma的接受者具有在未患tma的接受者中未觀察到的cfhr3/r1純合子缺失。參見skerka,c.,等人，(2010)semin.thromb.hemost.36(6):625-632，將其通過引用整體并入本文。具有cfhr3/r1純合子缺失的兩名患者均患有嚴(yán)重的多內(nèi)臟tma(multi-visceraltma)并死亡。在未患tma的接受者中未觀察到已知的致病變體。與未患tma的接受者相比，患有tma的接受者中高變體頻率(通過移植的“選擇性壓力”分布的)表明變體與tma相關(guān)，并且不代表測試的基因中的隨機多態(tài)性變異。

在我們的用于評價遺傳變體的研究群組(n＝77)中，非白人中tma的累積發(fā)病率高于白人(71％相對于39％,p＝0.04)。而且，在非白人移植接受者中檢測到比白人移植接受者更多的基因變體：2.5(0-7)相對于0(0-2),p<0.0001。圖3顯示通過種族和tma分層的基因變體的“熱圖”，說明在患有tma的非白人患者中發(fā)生最高數(shù)目的變體。

圖4顯示基因變體數(shù)目與移植相關(guān)死亡率的關(guān)聯(lián)。7名患有tma的患者(均為非白人)各自含有鑒定的3至7種變體(每名有3種變體(n＝3)，每名有4種變體(n＝2)，每名有7種變體(n＝2))。這7名含有≥3種基因變體的非白人患者中有5名患者死于嚴(yán)重的tma，表明種族和補體基因變體的累積作用與tma表型的重要關(guān)聯(lián)。4名未患tma的非白人接受者中僅1名檢測到2種變體。未患tma的白人接受者均含有不多于2種以上的變體。

為解決基因變體是否與種族和tma相關(guān)，我們僅分析白人hsct接受者。與未患tma的白人的7.7％(3/39)相比，患有tma的白人中50％(12/24)含有至少一種變體。與不含任何變體的白人患者的25％(12/48)相比，含有至少一種基因變體的白人患者的80％的發(fā)展成tma(12/15)(p<0.0001)。該觀察結(jié)果表明基因變體的存在在發(fā)展tma的任何種族對象中顯著富集，但非白人含有更多的變體并患有更嚴(yán)重的疾病。

然后，我們比較含有0-2或≥3種基因變體的接受者中的結(jié)果。含有≥3種基因變體的患者(其全部為非白人)具有增加的移植相關(guān)死亡率(trm)(在第1年，57％相對于21％；p＝0.02)(圖3)。這些數(shù)據(jù)導(dǎo)致我們假設(shè)在我們中心移植的非白人的trm將會升高，并且存活率降低。我們分析了在cchmc進行的333個連續(xù)移植者的擴展群組，比較了白人和非白人接受者中患有和未患tma的患者的存活率。該較大群組包括48名非白人接受者，其大多數(shù)(85％)為非裔美國人。在該群組中tma的累積發(fā)病率為35％(在同種異體移植接受者中為40％，以及在自體移植接受者中為8％，p<0.0001)，此外，該tma的累積發(fā)病率在非白人中比白人hsct接受者中顯著更頻繁(52％相對于29％，p＝0.008)。支持我們的假設(shè)，非白人接受者具有比白人差的存活率(在第1年，56％相對于81％，p＝0.0009)，并且與未患tma的hsct接受者相比，患有tma的hsct接受者具有較差的存活率(在第1年，63％相對于85％，p＝0.0001)。此外，在移植之后，患有tma的非白人患者具有比患有tma的白人顯著差的存活率(在第1年，37％相對于69％，p＝0.04)，而在未患tma的對象中，存活率沒有因種族而異(在第1年，73％相對于87％，p＝0.12)，這支持了我們的假設(shè)：在非白人hsct接受者中觀察到的至少一部分較差的存活率是由增加的對嚴(yán)重tma的易感性介導(dǎo)的。

我們使用rnaseq，比較來自含有高數(shù)目的基因變體并患有tma的8名移植接受者以及不含有任何鑒定的變體并且未發(fā)展tma的8名接受者在移植之前收集的外周血中的基因表達(dá)來評價遺傳變體的功能重要性。差異表達(dá)基因的途徑分析表明，與不含有變體的對象相比，含有變體的對象中補體相關(guān)途徑上調(diào)。重要的是，我們甚至在含有通過一些算法預(yù)測為良性的變體的人中，觀察到補體途徑的上調(diào)。特別感興趣的是，被預(yù)測為良性的c5變體c.921g>c(表2，#26)為患有tma的對象中唯一檢測到的變體，并且顯示多個補體途徑上調(diào)支持在疾病中可能的作用。分析沒有提供在含有基因變體的對象中補體途徑下調(diào)的任何證據(jù)。這些數(shù)據(jù)支持我們的假設(shè)，即鑒定的基因變體可促進快速補體激活。

總結(jié)

在經(jīng)歷基因測試的77名對象中，34名對象患有tma。與未患tma的患者的9％相比，患有tma的患者的65％含有表1中17種補體相關(guān)基因中的至少一種的遺傳變體(p<0.0001)。在患有tma的所有種族對象中基因變體增加，但非白人比白人含有更多變體(2.5(0-7)相對于0(0-2),p<0.0001)。僅在患有tma的非白人中鑒定出≥3種基因的變體，并且其與高死亡率(71％)相關(guān)。與未患tma且缺乏測試的基因變體的對象相比，移植前樣品的rna序列分析顯示含有一種或多種測試的基因變體的患有tma的對象中多個補體途徑上調(diào)。我們的數(shù)據(jù)揭示了基于接受者基因型的hsct相關(guān)tma的遺傳易感性的重要差異。

可能的是一些鑒定的遺傳變體在正常生活過程中可能不具有生物學(xué)重要性，但在hsct的壓力下，伴隨著由強烈的輻射和/或化療引起的顯著的血管損傷下，這些易感個體可表現(xiàn)為tma。

鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和西羅莫司與增加的tma風(fēng)險相關(guān)?？梢允褂每刂萍毙詆vhd的替代策略，例如離體t-細(xì)胞清除或使用光分離置換法作為預(yù)防法，并且新的補體阻斷劑可以為高風(fēng)險患者的治療選擇。在發(fā)生器官損傷之前，高風(fēng)險患者的密切監(jiān)測和早期治療干預(yù)應(yīng)改善總體移植結(jié)果。在該臨床環(huán)境中，將依庫珠單抗或其它補體抑制藥物的適當(dāng)使用與使用預(yù)測差的結(jié)果的tma生物標(biāo)志物的使用進行組合，可以用可能將導(dǎo)致治療應(yīng)答的進一步改善的更可靠的補體阻斷更早地開始治療。

實施例2

用依庫珠單抗(alexionpharmaceuticals,cheshire,ct)治療18名顯示ta-tma的高風(fēng)險特征(包括腎病范圍的蛋白尿和升高的sc5b-9水平)的患者。調(diào)整給藥水平以維持100μg/ml的治療性依庫珠單抗?jié)舛?。參見jodeles.等人，(2015),biol.bloodmarrowtransplant.pii:s1083-8791(15)00672-2.doi:10.1016/j.bbmt.2015.10.002.(付印之前的電子文檔公開)，將其通過引用整體并入本文。觀察總?cè)苎a體活性(ch50)和末端補體激活(sc5b-9)以監(jiān)測補體激活和對治療的應(yīng)答。將治療的患者的結(jié)果與來自我們的前瞻性觀察研究的歷史對照的結(jié)果進行比較，所述歷史對照由已經(jīng)顯示相同的高風(fēng)險特征，但未用依庫珠單抗治療的11名個體組成。從tma診斷開始時，使用卡普蘭-邁耶和對數(shù)秩檢驗比較兩組之間的總體存活率。接受依庫珠單抗療法的患有高風(fēng)險tma的患者具有好得多的存活概率(p＝0.002)。圖5顯示用依庫珠單抗治療的患者相對于未經(jīng)治療的患有高風(fēng)險tma的患者的總體存活率的比較。如圖5所示，在30個月之后，用依庫珠單抗治療的患者具有約0.6的存活概率，而在同一時間點，未經(jīng)治療的患者具有大約0.1的存活概率。