本發(fā)明涉及glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽以及抗-il-21抗體在1型糖尿病中的用途。

背景

雖然外源胰島素療法的進(jìn)展已經(jīng)使得患有1型糖尿病的受試者能夠充分地控制其代謝障礙，但仍然沒有應(yīng)對其根本病因的治療選項(xiàng)。因此，存在對1型糖尿病的改善治療和預(yù)防選項(xiàng)的需要。

il-21具有以對于i類細(xì)胞因子而言典型的上-上-下-下(up-up-down-down)拓?fù)鋵W(xué)排列的四螺旋束結(jié)構(gòu)(螺旋1-4/a-d——如例如j.immunol.，2011vol.186no.2，p.708-721中的圖1所定義的)。il-21通過異源二聚體受體復(fù)合物發(fā)信號，該復(fù)合物由私有鏈il-21rα(也被稱為il-21r)和γc/il-2rγ/共有γ鏈組成，其中后者由il-2、il-4、il-7、il-9和il-15共享。γc和il-21rαα與il-21上的非重疊結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合-il-21rα與螺旋1和3結(jié)合而γc與人il-21上的螺旋2和4結(jié)合。il-21rα以高親和力結(jié)合il-21并提供大部分的結(jié)合能。然而，信號傳導(dǎo)需要與γc相互作用，因此結(jié)合il-21rα但無法與γc正確地相互作用的il-21突變體是il-21信號傳導(dǎo)的強(qiáng)效拮抗劑。il-21對先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答發(fā)揮著多效的作用。其主要由激活的cd4+t細(xì)胞、濾泡t細(xì)胞和自然殺傷t細(xì)胞產(chǎn)生。人il-21的氨基酸序列在seqidno1中示出。由于il-21在免疫系統(tǒng)刺激中的多種作用，il-21拮抗作用已被建議作為治療炎癥的可能的途徑。關(guān)于il-21/il-21rα結(jié)合的更多細(xì)節(jié)在jbc，vol.287，no.12，pp.9454-9460，2012年3月16日中描述，并且示例性的抗-il-21抗體在wo2010055366和wo2012098113中描述。

胰高血糖素樣肽-1(glp-1)由于其在葡萄糖代謝中的作用，是一種被充分研究的肽。由于前6個(gè)氨基酸殘基在成熟期間被去除，人glp-1的活性形式被稱為glp-1(7-37)和glp-1-(7-36)nh2。該肽的存在時(shí)間非常短，并且是強(qiáng)效的抗高血糖激素，其能夠刺激葡萄糖依賴性的胰島素分泌并抑制胰高血糖素分泌。用于2型糖尿病治療、促進(jìn)(agonising)glp-1作用的治療性化合物包括利拉魯肽(liraglutide)、艾塞那肽、利司那肽、阿比魯肽(albiglutide)和度拉魯肽(dulaglutide)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明關(guān)注il-21抑制劑和glp-1激動(dòng)劑給藥的組合效應(yīng)，如本文所述的，發(fā)現(xiàn)該組合效應(yīng)對1型糖尿病的治療和預(yù)防是有幫助的。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽以及il-21功能抑制劑用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的用途。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽，以及il-21功能抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法中使用的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于制備用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的一種或多種藥物的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法可包括向有需要的受試者施用有效量的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是優(yōu)選地保留一定的內(nèi)源胰島素產(chǎn)生的近期診斷的1型糖尿病患者。采用glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑的聯(lián)合治療允許患者免除或減少對外源胰島素療法的需求。在一個(gè)實(shí)施方案中，與采用外源胰島素的標(biāo)準(zhǔn)治療相比，采用glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑的聯(lián)合治療保持了β-細(xì)胞功能。

附圖簡述

圖1示出了在未治療的個(gè)體對照動(dòng)物(上圖)和施用利拉魯肽后的個(gè)體動(dòng)物(下圖)的nod模型中，隨時(shí)間變化的血糖(bgv)。

圖2示出了在施用抗-il-21抗體后的個(gè)體動(dòng)物(上圖)和施用利拉魯肽及抗-il-21抗體后的個(gè)體動(dòng)物(下圖)的nod模型中，隨時(shí)間變化的血糖(bgv)。

對于每個(gè)治療方案，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的動(dòng)物數(shù)目為每組10只，然而，在實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程中，一些動(dòng)物由于高血糖值(高于600mg/dl)和/或較差的總體健康而從該研究中移除并施以安樂死；被安樂死的動(dòng)物用“*”表示。對于圖1的下圖和圖2的下圖，所示的時(shí)間段經(jīng)過利拉魯肽治療期(糖尿病發(fā)作后的第0-35天)和額外35天的監(jiān)測(用“停用利拉魯肽”表示)。

圖3和圖4與圖1和圖2相似，但其包括參與實(shí)施例1和2中所描述的研究的全部動(dòng)物。在圖4中，第35天的“#”表示將來自抗-il-21組和聯(lián)合治療組的每一組的3只小鼠處死用于其他目的(組織學(xué)評價(jià))，因此沒有進(jìn)一步監(jiān)測。

圖5示出了kaplan-meier圖——糖尿病發(fā)生率和存活率。

匯編了來自實(shí)施例1和2的數(shù)據(jù)。每日施用利拉魯肽持續(xù)35天?？?il-21施用的時(shí)間安排由x軸上的三角形/箭頭標(biāo)出。通過對數(shù)秩mantel-cox檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。僅示出了具有顯著性差異的比較的p值。所有其他的比較都是不顯著的。在第35天，將來自抗-il-21單藥療法組的三只動(dòng)物以及來自聯(lián)合組的三只小鼠處死以供組織學(xué)分析，因此其未被包含在第70天的存活分析中。a.經(jīng)過治療期仍患糖尿病的小鼠的比例。b.經(jīng)過糖尿病發(fā)作后70天的“存活率”。存活被定義為未變成終末高血糖(連續(xù)2天的bgv≥600mg/dl)的那些動(dòng)物。陰影區(qū)域表示停用利拉魯肽。由于3只小鼠被移出用于組織學(xué)分析，因此處理組3和4中小鼠的總數(shù)僅為每組15只(并非18只)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽以及il-21功能抑制劑的施用在糖尿病受試者中提供了改善的血糖水平控制，如糖尿病受試者中持久的血糖水平正常化。

本發(fā)明涉及glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽以及il-21功能抑制劑用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的用途。換句話說，本發(fā)明涉及一種用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法，該方法包括向有需要的患者施用glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽，以及il-21功能抑制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽以及il-21功能抑制劑在用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法中使用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，將glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽以及il-21功能抑制劑施用至近期診斷出1型糖尿病的受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療在診斷的12周內(nèi)開始。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療在診斷的8周內(nèi)開始。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療在診斷的4周內(nèi)開始。

在一個(gè)實(shí)施方案中，將glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽以及il-21功能抑制劑施用至具有發(fā)展為1型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者，如具有胰島自身抗體的受試者或沒有胰島自身抗體但在遺傳上存在風(fēng)險(xiǎn)的受試者。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及有效量的glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽和有效量的il-21功能抑制劑的施用。

il-21功能抑制劑

根據(jù)本發(fā)明，il-21功能抑制劑是具有抑制il-21介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和生物效應(yīng)的能力的藥劑，可將這樣的藥劑描述為是il-21中和性的。用于本發(fā)明的il-21功能抑制劑(也被稱為il-21/il-21rα拮抗劑)是具有抑制il-21介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和生物效應(yīng)的能力的藥劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的il-21rα拮抗劑是具有與γc或il-21rα競爭結(jié)合il-21的能力的中和性抗-il-21抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑是能夠特異性結(jié)合il-21的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑是抗-il-21抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與受體鏈競爭結(jié)合il-21，其中所述受體鏈選自由il-21rα(私有鏈)和γc(共有γ鏈)組成的列表。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與il-21rα競爭結(jié)合il-21。在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與人il-21的螺旋1和3結(jié)合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與il-21上的不連續(xù)表位結(jié)合，其中所述表位包含如seqidno1中所示的氨基酸i37至y52和n92至p108。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與il-21上的不連續(xù)表位結(jié)合，其中所述表位包含如seqidno1中所示的i37至y52區(qū)域內(nèi)和n92至p108區(qū)域內(nèi)的氨基酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與如seqidno1定義的il-21的r34、r38、q41中的至少一個(gè)以及k102和r105中的至少一個(gè)結(jié)合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與如seqidno1定義的il-21的r34、r38、q41、k102和r105中的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至三個(gè)、至少四個(gè)或全部五個(gè)結(jié)合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與il-21上的不連續(xù)表位結(jié)合，其中所述抑制劑直接接觸(截止值為)氨基酸殘基34、37、38、41、44、45、47、48、51、52、92、94、95、97、98、99、101、102、105、106、107和108中的至少15個(gè)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體直接接觸i37、r38、q41、d44、i45、d47、q48、n51和y52(螺旋1區(qū))。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體直接接觸(螺旋3區(qū))的n92、r94、i95、n97、v98、s99、k101、k102、r105、k106、p107和p108。

與il-21rα競爭結(jié)合il-21的抗-il-21抗體的一個(gè)實(shí)例為“mab5”抗體，該抗體是在wo2010055366中以克隆號362.78.1.44首次披露的人抗體。mab5重鏈和輕鏈的氨基酸序列在seqidno2和3中示出(igg1同種型版本)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑為mab5。該mab5抗體與人il-21的螺旋1和3結(jié)合，或者更具體地，與如seqidno1中所示的氨基酸i37至y52和n92至p108結(jié)合。mab5及其變體的結(jié)合性質(zhì)以及其優(yōu)點(diǎn)(高親和力和效力)在wo2012098113中更詳細(xì)地描述。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑是如wo2010/055366或wo2012098113中所描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑選自在wo2010/055366的表1中列出的抗體組。在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑是由wo2010/055366中被命名為362.78.1.44的雜交瘤產(chǎn)生的抗體或抗體片段，其中該雜交瘤由美國模式培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection)保藏，atcc專利保藏名稱為pta-8790。

jbc，vol.287，no.12，pp.9454-9460，2012年3月16日公開了關(guān)于il-21/il-21rα結(jié)合的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑是一種抗-人il-21單克隆抗體或抗體片段，其包含：

(a)重鏈區(qū)，該重鏈區(qū)包含：

(i)包含seqidno：15的重鏈可變區(qū)cdr1；

(ii)包含seqidno：16的重鏈可變區(qū)cdr2；和

(iii)包含seqidno：17的重鏈可變區(qū)cdr3；以及

(b)輕鏈區(qū)，該輕鏈區(qū)包含：

(i)包含seqidno：19的輕鏈可變區(qū)cdr1；

(ii)包含seqidno：20的輕鏈可變區(qū)cdr2；和

(iii)包含seqidno：21或22的輕鏈可變區(qū)cdr3；

并且其中任選地通過氨基酸置換修飾該抗體的fc部分以降低效應(yīng)子功能。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑是一種抗-人il-21單克隆抗體或抗體片段，其包含i)seqidno：14的氨基酸殘基20至145和seqidno：18的氨基酸殘基21至26；或ii)seqidno：14的氨基酸殘基1至145和seqidno：18的氨基酸殘基1至126；并且其中該抗體的fc部分選自igg1、igg2、igg3和igg4。

可進(jìn)一步優(yōu)化該fc部分以提高生物物理/生物化學(xué)屬性或效應(yīng)子功能屬性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑包含如seqidno2中所示的三個(gè)cdr序列以及如seqidno3中所示的三個(gè)cdr序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑是與γc競爭結(jié)合il-21的抗-il-21抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與人il-21的螺旋2和4結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與包含如seqidno1中所示的氨基酸glu65、asp66、val67、glu68、thr69、asn70、glu72、trp73、lys117、his118、arg119、leu143、lys146、met147、his149、gln150和his151的表位結(jié)合。

與γc競爭結(jié)合il-21的抗-il-21抗體的一個(gè)實(shí)例是“mab14”抗體，該抗體是在wo2010055366中以克隆號366.328.10.63首次披露的人抗體。mab14與人il-21的螺旋2和4結(jié)合。更具體地，如wo2012164021所述，mab14與人il-21的glu65、asp66、val67、glu68、thr69、asn70、glu72、trp73、lys117、his118、arg119、leu143、lys146、met147、his149、gln150和his151結(jié)合。mab14重鏈和輕鏈的氨基酸序列在seqidno4和5中示出。與γc競爭結(jié)合il-21的抗-il-21抗體的進(jìn)一步的實(shí)例在wo2012164021中描述。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑為mab14。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑包含如seqidno4中所示的三個(gè)cdr序列以及如seqidno5中所示的三個(gè)cdr序列。

mab5和mab14類型的抗體的特征通常在于對il-21具有異常高的親和力(在納摩爾的范圍內(nèi))并且具有中和il-21誘導(dǎo)的效應(yīng)的高效力。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與mab5競爭結(jié)合il-21。該抑制劑可以是與mab5相同箱元(bin)的抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑與mab14競爭結(jié)合il-21。該抑制劑可以是與mab5相同箱元的抗體。

用于本發(fā)明的il-21功能抑制劑或中和性il-21rα拮抗劑的進(jìn)一步實(shí)施方案是與il-21競爭結(jié)合il-21rα的那些。用于本發(fā)明的il-21rα拮抗劑優(yōu)選為結(jié)合連接il-21rα的β鏈的環(huán)的藥劑。ab、cd、ef、b′c和f′g′環(huán)以及接頭全都含有與結(jié)合il-21有關(guān)的殘基。在il-21r中，cd環(huán)中的tyr36、ef環(huán)中的met89和asp91以及b′c′環(huán)中的tyr148對結(jié)合表面貢獻(xiàn)最大。最重要的環(huán)為ef環(huán)，其提供il-21r中與結(jié)合il-21有關(guān)的20個(gè)氨基酸中的7個(gè)。

用于本發(fā)明的抗il-21r抗體可與該ef環(huán)結(jié)合。用于本發(fā)明的優(yōu)選抗-il-21r抗體與選自下組的至少10個(gè)氨基酸殘基的組結(jié)合：il-21r(seqidno6)的tyr29、gln52、gln54、tyr55、glu57、leu58、phe86、his87、phe88、met89、ala90、asp91、asp92、ile93、leu113、ala115、pro145、ala146、tyr148、met149、lys153、ser209、tyr210。

用于本發(fā)明的il-21/il-21rα如抗-il-21r抗體或拮抗劑是干擾il-21rα與γc結(jié)合并由此干擾il-21/il-21rα/γc復(fù)合物組裝的抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑結(jié)合il-21并由此抑制il-21功能。該il-21功能抑制劑可以是包含結(jié)合il-21的il-21受體片段的融合蛋白，如由chimerigen生產(chǎn)且可從例如www.biomol.de以產(chǎn)品號chi-hf-21021r-c100商購的重組產(chǎn)物“il-21r(人)：fc(人)(重組)”。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該il-21功能抑制劑以10⁷m^-1或更高、10⁸m^-1或更高、10⁹m^-1或更高、10¹⁰m^-1或更高、10¹¹m^-1或更高或者10¹²m^-1或更高的結(jié)合親和力特異性結(jié)合il-21。

根據(jù)本發(fā)明的“中和性”il-21抑制劑或抗體是具有顯著抑制通過il-21ra的信號傳導(dǎo)的能力的分子?？梢栽谑褂帽磉_(dá)il-21r和γc的細(xì)胞的多種功能試驗(yàn)，例如，如wo2012/098113和wo2012/164021中公開并且在本文中以試驗(yàn)iii和iv示例的使用nk92細(xì)胞的生物活性試驗(yàn)和b細(xì)胞增殖試驗(yàn)中評價(jià)中和效應(yīng)。在b細(xì)胞試驗(yàn)中，納摩爾范圍的ic50被認(rèn)為是高度有效的中和性il-21抑制劑。通常，具有與本文所述的抗體相似的中和效應(yīng)的分子將被認(rèn)為是中和性il-21抑制劑。

如本文所用的術(shù)語“抗體”、“重組抗體”、“單克隆抗體”和“mab”意指根據(jù)本發(fā)明的、具有與抗原特異性結(jié)合的能力的免疫球蛋白分子及其片段。全長抗體包含四條(或更多)多肽鏈，即，通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(h)鏈和至少兩條(l)輕鏈。每條重鏈均由重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由ch1、ch2和ch3這三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。每條輕鏈均由輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為vl)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域cl組成。vh和vl區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分成被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的高變區(qū)，其中散布有被稱為框架區(qū)(fr)的更加保守的區(qū)域。每個(gè)vh和vl區(qū)由三個(gè)cdr和四個(gè)fr組成，它們從氨基末端到羧基末端以如下順序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4?？赏ㄟ^將序列相對于已知可變區(qū)的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對來鑒別抗體序列中的可變區(qū)和cdr(框架和cdr根據(jù)本文的kabat編號方案定義-(kabat，ea，wu，tt，perry，hm等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第五版.美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部(usdepartmentofhealthandhumanservices)，公共衛(wèi)生署(publichealthservice)，國立衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)，nih出版號91-3242，1991))。

抗體的片段可結(jié)晶區(qū)(“fc區(qū)”/“fc域”)包含與被稱為fc受體的細(xì)胞表面受體和補(bǔ)體系統(tǒng)的一些蛋白質(zhì)相互作用的抗體尾區(qū)。該性質(zhì)允許抗體激活免疫系統(tǒng)。然而，fc域可包含導(dǎo)致這些效應(yīng)子功能修飾的氨基酸突變。優(yōu)選地，修飾的fc域包含將分別導(dǎo)致對某些fc受體的親和力降低(l234a、l235e和g237a)以及導(dǎo)致c1q介導(dǎo)的補(bǔ)體固定減少(a330s和p331s)的以上突變中的一種或多種，優(yōu)選全部(殘基根據(jù)eu索引編號)。這樣的fc域?qū)⑷匀槐Ａ糨^長的體內(nèi)循環(huán)半衰期。

被稱為“fab區(qū)”/“fab域”/“fab片段”的抗體的另一部分含有限定抗體可以結(jié)合的特定靶標(biāo)的可變區(qū)。可使用公知的方法，例如，通過用酶如木瓜蛋白酶(以產(chǎn)生fab片段)或胃蛋白酶(以產(chǎn)生f(ab′)2片段)進(jìn)行蛋白水解切割，從完整的抗體生成fab片段。或者，可使用標(biāo)準(zhǔn)的重組dna和蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)，以重組方式產(chǎn)生抗體片段。

因此，包含在術(shù)語“抗體”之內(nèi)的結(jié)合片段的實(shí)例包括但不限于：(i)fab片段，一種由vl、vh、cl和ch1域組成的單價(jià)片段；(ii)f(ab)2和f(ab′)2片段，一種包含在鉸鏈區(qū)處由二硫橋連接的兩個(gè)fab片段的二價(jià)片段；(iii)由vh和ch1域組成的fd片段；(iv)由抗體單臂的vl和vh域組成的scfv片段，(v)dab片段(ward等人，(1989)nature341：544-546)，其由vh域組成；以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。此外，盡管fv片段的兩個(gè)域vl和vh由單獨(dú)的基因編碼，但可以使用重組方法，通過合成接頭將它們連接在一起，該合成接頭使得它們能夠被制成單條蛋白鏈，其中vl和vh區(qū)配對形成單價(jià)分子(被稱為單鏈fv(scfv)；參見例如，bird等人，(1988)science242：423-426；和huston等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：5879-5883)。這樣的單鏈抗體也意欲包含在術(shù)語“抗體”之內(nèi)。單鏈抗體的其他形式如雙抗體(diabodies)也包含在術(shù)語“抗體”之內(nèi)。雙抗體為二價(jià)的雙特異性抗體，其中vh和vl域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用的接頭由于過短而不能允許在同一條鏈上的兩個(gè)域之間配對，使得這些域與另一條鏈的互補(bǔ)域配對，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見例如，hol-liger，p.等人，(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448；poljak，r.j.等人，(1994)structure2：1121-1123)。

應(yīng)當(dāng)理解，抗原可具有一個(gè)或多個(gè)表位，該表位包括(1)由單肽鏈組成的抗原決定簇；(2)包含一條或多條空間上鄰近的肽鏈的構(gòu)象表位，其中該肽鏈各自的氨基酸序列沿多肽序列不連貫地定位；以及(3)整個(gè)或部分地包含翻譯后與抗原共價(jià)連接的分子結(jié)構(gòu)如碳水化合物基團(tuán)等的翻譯后表位。

如本文所用的，術(shù)語“人抗體”是指具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包含例如在cdr中、尤其是cdr3中的、不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。

由來源于另一種哺乳動(dòng)物物種(例如，小鼠)的抗體衍生的cdr序列已被移植到人框架區(qū)上并任選地可能通過誘變進(jìn)一步工程化的抗體被稱為“人源化抗體”。

術(shù)語“嵌合抗體”是指這樣的根據(jù)本發(fā)明的抗體，其中輕鏈和重鏈基因已經(jīng)從屬于不同物種的免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)基因構(gòu)建，一般是通過遺傳工程化構(gòu)建。例如，來自小鼠單克隆抗體的基因的可變區(qū)段可連接到人恒定區(qū)段。

如本文所用的，術(shù)語“表位”在“抗原結(jié)合多肽”如抗體(ab)與其相應(yīng)的抗原(ag)之間的分子相互作用的背景下定義。通常，“表位”是指ag上與ab特異性結(jié)合的區(qū)或區(qū)域，即與ab物理接觸的區(qū)或區(qū)域。物理接觸可采用針對ab和ag分子中的原子的各種標(biāo)準(zhǔn)(例如，距離截止值為如如如或溶劑可及性)來定義。蛋白質(zhì)表位可包含ag中直接參與ab結(jié)合的氨基酸殘基(也稱為表位的免疫顯性組分)以及其他不直接參與結(jié)合的氨基酸殘基，如被ab有效阻斷的ag的氨基酸殘基，即在ab的“溶劑排斥表面”和/或“足跡”內(nèi)的氨基酸殘基。

可采用多種實(shí)驗(yàn)和計(jì)算表位作圖方法在不同的詳細(xì)度水平上描述和表征給定抗體(ab)/抗原(ag)對的表位。該實(shí)驗(yàn)方法包括誘變、x射線晶體學(xué)、核磁共振(nmr)譜法、氫氚交換質(zhì)譜法(hx-ms)以及各種競爭結(jié)合方法；本領(lǐng)域已知的方法。由于每一種方法均依賴于獨(dú)特的原理，因此對表位的描述與確定表位的方法緊密相關(guān)。因此，根據(jù)所采用的表位作圖方法，給定ab/ag對的表位可有不同地描述。

與相同抗原結(jié)合的抗體可就其同時(shí)與其共同抗原結(jié)合的能力進(jìn)行表征，并且可以經(jīng)歷“競爭結(jié)合”/“分箱(binning)”。在該語境下，術(shù)語“分箱”是指對與相同抗原結(jié)合的抗體進(jìn)行分組的方法?？贵w的“分箱”可以基于在以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)為基礎(chǔ)的試驗(yàn)中兩種抗體與其共同抗原的競爭結(jié)合，該標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如是表面等離子體共振(spr)、elisa或流式細(xì)胞術(shù)。

使用參考抗體確定抗體的“箱元”。如果第二抗體不能與參考抗體同時(shí)與抗原結(jié)合，則稱第二抗體與參考抗體屬于同一“箱元”。在這種情況下，參考抗體和第二抗體競爭性地結(jié)合抗原的相同部分，因此被劃歸為“競爭抗體”。如果第二抗體能夠與參考抗體同時(shí)與抗原結(jié)合，則稱第二抗體屬于不同的“箱元”。在這種情況下，參考抗體和第二抗體不會(huì)競爭性地結(jié)合抗原的相同部分，因此被劃歸為“非競爭抗體”。

如本文所用的，術(shù)語“親和力”定義了受體與配體結(jié)合的強(qiáng)度，該結(jié)合經(jīng)常是抗體與表位的結(jié)合?？贵w的親和力通過平衡解離常數(shù)kd來測量，該kd被定義為[ab]x[ag]/[ab-ag]，其中[ab-ag]是抗體-抗原復(fù)合物的摩爾濃度，[ab]是未結(jié)合的抗體的摩爾濃度，而[ag]是平衡時(shí)未結(jié)合的抗原的摩爾濃度。還可以從通過例如spr方法確定的復(fù)合物形成和解離的動(dòng)力學(xué)對kd進(jìn)行描述。與單價(jià)復(fù)合物的結(jié)合和解離相對應(yīng)的速率常數(shù)分別被稱為結(jié)合速率常數(shù)ka(或k結(jié)合)和解離速率常數(shù)kd(或k解離)。然后通過方程kd＝kd/ka，將kd與ka和kd相關(guān)聯(lián)。親和力常數(shù)ka被定義為1/kd。通過競爭性抑制確定抗體特異性和親和力的優(yōu)選方法可見于harlow等人，antibodies：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1988)，colligan等人編著，currentprotocolsinimmunology，greenepublishingassoc.andwileyinterscience，n.y.，(1992，1993)，以及muller，meth.enzymol.92：589-601(1983)。就本發(fā)明而言，使用高親和力抗體是優(yōu)選的，例如，以通過例如spr測量的以下結(jié)合親和力與抗原特異性結(jié)合的抗體：10⁷m^-1或更高、10⁸m^-1或更高、10⁹m^-1或更高、10¹⁰m^-1或更高、10¹¹m^-1或更高，或10¹²m^-1或更高。

在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“抗-il-21抗體”和“抗-il-21”在本文中可互換地使用，并且指具有與il-21特異性結(jié)合的能力的抗體。

用于本發(fā)明的il-21/il-21rα拮抗劑，如抗-il-21抗體，可借助于重組核酸技術(shù)生產(chǎn)。通常，對克隆的野生型蛋白x核酸序列進(jìn)行修飾以使其編碼所需蛋白質(zhì)。然后將該修飾的序列插入至表達(dá)載體中，繼而將該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。

序列

關(guān)于進(jìn)一步的序列信息，請參見序列表。

seqidno1：hil-21(包含跨越氨基酸1-29的信號肽——mab5表位以粗體示出；il-21ra結(jié)合位點(diǎn)以下劃線示出；形成mab14表位的氨基酸殘基以斜體小寫字母示出)。

mrsspgnmeriviclmviflgtlvhksssqgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaolksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds。

跨越以下氨基酸的四個(gè)螺旋′：螺旋1aa32-57、螺旋2aa72-81、螺旋3aa93-103和螺旋4aa133-149。

seqidno2：“mab5”：輕鏈(省略了信號肽——cdr序列以粗體/下劃線示出——恒定區(qū)以小寫字母示出)：

eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygswtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。

seqidno3：“mab5”：igg1同種型的重鏈(省略了信號肽——cdr序列以粗體/下劃線示出——恒定區(qū)以小寫字母示出)：

qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvafiwydgsdkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardgdssdwygdyyfgmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaegapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpssiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

seqidno4：“mab14”輕鏈(省略了信號肽——cdr序列以粗體/下劃線示出，恒定區(qū)以小寫字母示出)：

aiqltqspsslsasvgdrvtitcrasqdidsalawyqqkpgkapkilihdasslesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqfnsypytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。

seqidno5：“mab14”igg4同種型的重鏈(省略了信號肽——cdr序列以粗體/下劃線示出，恒定區(qū)以小寫字母示出)：

evqlvesggglvkpggslrlscaasgfifssysmnwvrqapgkglewvssitsgsyyihyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycvrergwgyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk。

seqidno6：il-21rα(包含信號序列)：

mprgwaapllllllqggwgcpdlvcytdylqtvicilemwnlhpstltltwqdqyeelkdeatscslhrsahnathatytchmdvfhfmaddifsvnitdqsgnysqecgsfllaesikpappfnvtvtfsgqyniswrsdyedpafymlkgklqyelqyrnrgdpwavsprrklisvdsrsvsllplefrkdssyelqvragpmpgssyqgtwsewsdpvifqtqseelkegwnphlllllllvivfipafwslkthplwrlwkkiwavpsperffmplykgcsgdfkkwvgapftgsslelgpwspevpstlevyschpprspakrlqltelqepaelvesdgvpkpsfwptaqnsggsayseerdrpyglvsidtvtvldaegpctwpcsceddgypaldldaglepspgledplldagttvlscgcvsagspglggplgslldrlkppladgedwagglpwggrspggvseseagsplagldmdtfdsgfvgsdcsspvecdftspgdegpprsylrqwvvippplsspgpqas。

seqidno7：γc(共有γ鏈/il-2rγ)包含信號序列：

mlkpslpftsllflqlpllgvglnttiltpngnedttadfflttmptdslsvstlplpevqcfvfnveymnctwnsssepqptnltlhywyknsdndkvqkcshylfseeitsgcqlqkkeihlyqtfvvqlqdpreprrqatqmlklqnlvipwapenltlhklsesqlelnwnnrflnhclehlvqyrtdwdhswteqsvdyrhkfslpsvdgqkrytfrvrsrfnplcgsaqhwsewshpihwgsntskenpflfaleavvisvgsmgliisllcvyfwlertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskglaeslqpdyserlclvseippkggalgegpgaspcnqhspywappcytlkpet。

seqidno11：重組小鼠il-21：

seqidno12：小鼠替代抗-il-21的氨基酸序列-可變輕鏈(miggl/κ同種型)

seqidno13：小鼠替代抗-il-21的氨基酸序列-可變重鏈(migg1/κ同種型)

seqidno14：

seqidno15：sygmh

seqidno16：fiwydgsdkyyadsvkg

seqidno17：dgdssdwygdyyfgmdv

seqidno18：

seqidno19：rasqsvsssyla

seqidno20：gassrat

seqidno21：qqygswt

seqidno22：tygmh

glp-1受體激動(dòng)劑

可將受體激動(dòng)劑定義為與受體結(jié)合并且引起天然配體典型的應(yīng)答的類似物?？蓪⑼耆?dòng)劑定義為引起與天然配體相同大小的應(yīng)答的激動(dòng)劑(參見例如，“principlesofbiochemistry“，allehninger，dlnelson，mmcox，第二版，worthpublishers，1993，第763頁)。

因此，例如，可將“glp-1受體激動(dòng)劑”或“glp-1激動(dòng)劑”定義為能夠與glp-1受體結(jié)合并能夠?qū)⑵浼せ畹幕衔?。而可將“完全”glp-1受體激動(dòng)劑定義為能夠引起與人glp-1相似大小的glp-1受體應(yīng)答的glp-1受體激動(dòng)劑。

glp-1激動(dòng)劑

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑為選自glp-1(7-35)、glp-1(7-36)、glp-1(7-36)-酰胺、glp-1(7-37)、glp-1(7-38)、glp-1(7-39)、glp-1(7-40)、glp-1(7-41)或其類似物或衍生物的glp-1肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，與glp-1(7-37)相比，glp-1肽包含不超過15個(gè)，如不超過10個(gè)或不超過6個(gè)已被置換、插入或缺失的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，與glp-1(7-37)相比，glp-1肽包含不超過5個(gè)，如不超過4個(gè)或不超過3個(gè)已被置換、插入或缺失的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽包含不超過4個(gè)不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑為毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3，毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3類似物，或任何這些的衍生物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑具有g(shù)lp-1活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，“glp-1激動(dòng)劑”被理解為指代包括肽和非肽化合物在內(nèi)的任何化合物，其完全或部分地激活人glp-1受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，“glp-1激動(dòng)劑”是與glp-1受體結(jié)合的任意的肽或非肽小分子，優(yōu)選地，該結(jié)合具有如通過本領(lǐng)域已知的方法(參見例如wo98/08871)測量的、低于1μm例如低于100nm的親和常數(shù)(kd)或效力(ec50)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，“glp-1激動(dòng)劑”被理解為指代完全或部分地激活人glp-1受體的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，“glp-1激動(dòng)劑”是與glp-1受體結(jié)合的任意肽，優(yōu)選地，該結(jié)合具有如通過本領(lǐng)域已知的方法(參見例如wo98/08871)測量的、低于1μm例如低于100nm的親和常數(shù)(kd)或效力(ec50)。在一個(gè)實(shí)施方案中，“glp-1激動(dòng)劑”被理解為指代包括肽和非肽化合物在內(nèi)的任何化合物，其完全或部分地激活人glp-1受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，“glp-1肽”是與glp-1受體結(jié)合的任意的肽或非肽小分子，優(yōu)選地，該結(jié)合具有如通過本領(lǐng)域已知的方法(參見例如wo98/08871)測量的、低于1μm例如低于100nm的親和常數(shù)(kd)或效力(ec50)。在一個(gè)實(shí)施方案中，“glp-1激動(dòng)劑”不是非肽化合物，如非肽小分子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于鑒別glp-1激動(dòng)劑的方法在wo93/19175(novonordiska/s)中描述，而可根據(jù)本發(fā)明使用的適當(dāng)glp-1激動(dòng)劑的實(shí)例包括在wo2005/027978(novonordiska/s)中提到的那些glp-1激動(dòng)劑，這些申請的教導(dǎo)均通過引用并入本文。如本領(lǐng)域所知的，“glp-1活性”是指與glp-1受體結(jié)合并且啟動(dòng)導(dǎo)致促胰島素作用或其他生理學(xué)效應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的能力。例如，可使用本文試驗(yàn)(i)中描述的試驗(yàn)測定本發(fā)明glp-1激動(dòng)劑的glp-1活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑具有任選地通過試驗(yàn)(i)確定的、等于或低于3000pm，如等于或低于500pm，或等于或低于100pm的ec50。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑是穩(wěn)定的glp-1激動(dòng)劑。如本文所用的，“穩(wěn)定的glp-1激動(dòng)劑”(例如，“穩(wěn)定的glp-1肽”)是指任選地通過下文所述的方法確定的，在人體中展現(xiàn)出至少24小時(shí)的體內(nèi)血漿消除半衰期的glp-1激動(dòng)劑。穩(wěn)定的glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)的實(shí)例可以在wo2006/097537中找到。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑是dppiv保護(hù)的glp-1肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽是dppiv穩(wěn)定化的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑具有至少24小時(shí)，如至少48小時(shí)、至少60小時(shí)或至少72小時(shí)，或如至少84小時(shí)、至少96小時(shí)或至少108小時(shí)，或任選地至少120小時(shí)、至少132小時(shí)或至少144小時(shí)的半衰期，其中所述半衰期任選地例如通過試驗(yàn)(ii)在人或小型豬中確定。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于確定化合物在人體中的血漿消除半衰期的方法可以如下進(jìn)行：將化合物溶解在ph7.4的等滲緩沖液、pbs或任何其他合適的緩沖液中。外周注射，優(yōu)選地在腹部或大腿上部注射該劑量。以頻繁的時(shí)間間隔取得用于確定活性化合物的血液樣品，并且持續(xù)到足以覆蓋終末消除部分的時(shí)間(例如，給藥前、給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第2天)、60(第3天)、72(第4天)和84(第4天)小時(shí))?；钚曰衔餄舛鹊拇_定如wilken等人，diabetologia43(51)，2000所述進(jìn)行。使用可商購獲得的軟件winnonlin2.2版(pharsight，cary，nc，usa)，通過使用非房室方法，從每個(gè)受試個(gè)體的濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)計(jì)算出推導(dǎo)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。終末消除速率常數(shù)通過對濃度-時(shí)間曲線的終末對數(shù)-線性部分進(jìn)行對數(shù)-線性回歸來估算，并用于計(jì)算終末半衰期。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑為glp-1衍生物。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，glp-1肽經(jīng)由相對于glp-1(7-37)氨基酸序列的位置23、26、34、36或38處的氨基酸殘基連接至親水性間隔區(qū)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1衍生物包含任選地經(jīng)由親水性間隔區(qū)共價(jià)連接的白蛋白結(jié)合殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述白蛋白結(jié)合殘基任選地經(jīng)由親水性間隔區(qū)共價(jià)連接至所述glp-1肽的c-末端氨基酸殘基或并非c-末端氨基酸殘基的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽經(jīng)由相對于glp-1(7-37)氨基酸序列的位置23、26、34、36或38處的氨基酸殘基連接至親水性間隔區(qū)。

人胰高血糖素樣肽-1是glp-1(7-37)，并且具有序列haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg(seqidno8)。glp-1(7-37)還可被稱為“天然”glp-1。在序列表中，glp-1(7-37)的第一個(gè)氨基酸殘基(組氨酸)被指定為第1號。然而，在下文中，根據(jù)本領(lǐng)域的慣例，該組氨酸殘基被指定為第7號，并且后續(xù)的氨基酸殘基相應(yīng)地編號，結(jié)束于第37號甘氨酸。因此，通常，本文中對于glp-1(7-37)的氨基酸殘基編號或位置編號的任何提及均是參考從位置7處的his開始并在位置37處的gly結(jié)束的序列?？墒褂孟鄳?yīng)的氨基酸位置來提及glp-1類似物。

合適的類似物命名法的一個(gè)非限制性實(shí)例是[aib⁸，arg³⁴，lys³⁷]glp-1(7-37)，其指定這樣一種glp-1(7-37)類似物，其中位置8處的丙氨酸已被α-氨基異丁酸(aib)置換，位置34處的賴氨酸已被精氨酸置換，并且位置37處的甘氨酸已被賴氨酸置換。

如例如在本發(fā)明的glp-1肽的上下文中使用的，術(shù)語“肽”是指包含通過酰胺(或肽)鍵互相連接的一系列氨基酸的化合物。

本發(fā)明的肽包含至少五個(gè)通過肽鍵連接的組成氨基酸。在特定的實(shí)施方案中，該肽包含至少10個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少15個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸、甚至更優(yōu)選至少25個(gè)氨基酸，或最優(yōu)選至少28個(gè)氨基酸。在特定的實(shí)施方案中，該肽由i)29個(gè)，ii)30個(gè)，iii)31個(gè)，或iv)32個(gè)氨基酸組成。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽在glp-1(7-37)的整個(gè)長度上表現(xiàn)出與glp-1(7-37)至少60％、65％、70％、80％或90％的序列同一性。作為用于確定兩個(gè)類似物之間序列同一性的方法的實(shí)例，比對了兩個(gè)肽[aib8]glp-1(7-37)和glp-1(7-37)。[aib8]glp-1(7-37)相對于glp-1(7-37)的序列一致性通過比對的相同殘基的數(shù)目減去不同殘基的數(shù)目再除以glp-1(7-37)中的殘基總數(shù)而得出。因此，在所述實(shí)例中，序列同一性為(31-1)/31。在一個(gè)實(shí)施方案中，在確定序列一致性時(shí)，不包括glp-1肽的非肽部分。

本文中，術(shù)語“衍生物”與術(shù)語“綴合物”不同。衍生物如glp-1衍生物包含共價(jià)連接至肽的一個(gè)或多個(gè)特定氨基酸殘基的明確定義的結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)取代基或側(cè)鏈，本文中該肽主要指glp-1肽。而綴合物是指具有經(jīng)由合成接頭(由此與融合蛋白相區(qū)別)與肽共價(jià)結(jié)合的一般為重組的大分子(如igg-fc或白蛋白)的化合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑為glp-1肽衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文在glp-1肽或類似物的上下文中使用的術(shù)語“衍生物”是指化學(xué)修飾的glp-1肽或類似物，其中一個(gè)或多個(gè)取代基已經(jīng)與該肽或類似物共價(jià)連接。該取代基還可被稱為側(cè)鏈(不要與氨基酸側(cè)鏈混淆)。典型的修飾是酰胺、碳水化合物、烷基基團(tuán)、酰基基團(tuán)、酯等。glp-1(7-37)衍生物的一個(gè)實(shí)例為n^ε26-(γ-glu(n^α-十六碳?；?)-[arg³⁴，lys²⁵])glp-1(7-37)。在特定的實(shí)施方案中，該側(cè)鏈能夠與白蛋白形成非共價(jià)聚集體，由此促進(jìn)該glp-1肽隨血流的循環(huán)，并且由于該glp-1肽與白蛋白的聚集體僅緩慢地分解以釋放活性藥物成分的事實(shí)，其還具有延長該glp-1肽的作用時(shí)間的效果。因此，該取代基或側(cè)鏈作為整體可被稱為白蛋白結(jié)合部分。

在特定的實(shí)施方案中，該側(cè)鏈具有至少10個(gè)碳原子或至少15、20、25、30、35個(gè)或至少40個(gè)碳原子。在進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，該側(cè)鏈可進(jìn)一步包含至少5個(gè)雜原子，特別是o和n，例如至少7、9、10、12、15、17個(gè)或至少20個(gè)雜原子，如至少1、2或3個(gè)n原子，和/或至少3、6、9、12或15個(gè)o原子。

在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合部分包含與白蛋白結(jié)合特別相關(guān)并由此與延長作用特別相關(guān)的部分，該部分因此可被稱為延長部分(protractingmoiety)。相對于延長部分與該肽的連接點(diǎn)，該延長部分可以在該白蛋白結(jié)合部分的對立端處或附近。

在更進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合部分包含在延長部分與至該肽的連接點(diǎn)之間的部分，該部分可被稱為接頭、接頭部分、間隔區(qū)，等等。該接頭可以是任選的，因此在那種情況下，白蛋白結(jié)合部分可以與延長部分相同。

在特定的實(shí)施方案中，白蛋白結(jié)合部分和/或延長部分是親脂性的，和/或在生理學(xué)ph(7.4)下是帶負(fù)電荷的。

可通過?；饔脤椎鞍捉Y(jié)合部分、延長部分或接頭與glp-1肽的賴氨酸殘基共價(jià)連接。用于制備衍生物的其他或替代手段包括烷基化、酯形成或酰胺形成，或例如通過馬來酰亞胺或鹵代乙酰胺(如溴代/氟代/碘代乙酰胺)偶聯(lián)與半胱氨酸殘基偶聯(lián)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，例如包含延長部分和接頭的白蛋白結(jié)合部分的活性酯在酰胺鍵形成(此過程被稱為?；饔?的情況下與賴氨酸殘基的氨基基團(tuán)例如其ε氨基基團(tuán)共價(jià)連接。

除非另有說明，否則當(dāng)提及賴氨酸殘基的?；饔脮r(shí)，應(yīng)理解是對其ε氨基基團(tuán)的提及。

對于本發(fā)明而言，術(shù)語“白蛋白結(jié)合部分”、“延長部分”和“接頭”可包括這些分子的未反應(yīng)形式以及經(jīng)反應(yīng)的形式。根據(jù)使用該術(shù)語的上下文，能夠清楚是指一種形式還是指另一種形式。

通常，延長部分經(jīng)由接頭在指定位置與lys的ε氨基基團(tuán)連接，并且同樣地，在一個(gè)實(shí)施方案中，延長部分、接頭與肽之間的所有連接都是酰胺鍵。

由于半衰期延長的性質(zhì)，脂肪酸可用作所述白蛋白結(jié)合殘基并特別地用作延長部分的關(guān)鍵部分。對于與glp-1肽的連接，脂肪酸的酸基團(tuán)，或脂肪二酸的一個(gè)酸基團(tuán)，經(jīng)由酰胺鍵與glp-1肽中的賴氨酸殘基的ε氨基基團(tuán)直接連接或通過接頭連接。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1衍生物是單酰化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1衍生物在k26處?；?。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1衍生物是雙?；?。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1衍生物在k26和k37、k27和k36或k38和k42處?；?/p>

在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“脂肪酸”是指具有4-28個(gè)碳原子的脂肪族一元羧酸，其任選地是無支鏈的和/或偶數(shù)的，并且其可以是飽和或不飽和的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“脂肪二酸”是指如上定義的脂肪酸，但其在ω位置處具有額外的羧酸基團(tuán)。因此，脂肪二酸是二元羧酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)延長部分包含獨(dú)立地選自c14-c20脂肪酸和c16-c20脂肪二酸的一種或多種脂肪酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，延長部分可包含c16脂肪酸(ch3-(ch2)14-co-)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，延長部分可包含c18二酸基團(tuán)(hooc-(ch2)16-co-)。在一個(gè)實(shí)施方案中，延長部分可包含c20二酸基團(tuán)(hooc-(ch2)18-co-)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，延長部分可包含4-cooh-pho-脂肪酸，其中該4-cooh-pho-結(jié)構(gòu)之后為-(ch2)y-c(＝o)-，其中y為7-11。

在一個(gè)實(shí)施方案中，延長部分可包含化學(xué)式9，其中y＝9。

化學(xué)式4：

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽衍生物的一個(gè)或多個(gè)延長部分是經(jīng)由接頭連接的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的glp-1衍生物的接頭可包含以下的第一接頭元件：

化學(xué)式5：

其中k為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，并且n為1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

在特定的實(shí)施方案中，當(dāng)k＝1并且n＝1時(shí)，可將該接頭元件稱為oeg，或8-氨基-3，6-二氧雜辛酸的二價(jià)基團(tuán)，并且/或者其可由下式表示：

化學(xué)式5a：

*-nh-(ch2)2-o-(ch2)2-o-ch2-co-*。

在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的glp-1肽的每個(gè)接頭均可進(jìn)一步獨(dú)立地包含第二接頭元件，例如，glu二價(jià)基團(tuán)，如化學(xué)式6和/或化學(xué)式7：

化學(xué)式6：

化學(xué)式7：

其中g(shù)lu二價(jià)基團(tuán)可被包含p次，其中p為1-3范圍內(nèi)的整數(shù)。

由于氨基酸谷氨酸的γ羧基基團(tuán)在這里被用于與另一個(gè)接頭元件或賴氨酸的ε氨基基團(tuán)連接，化學(xué)式6還可被稱為γ-glu，或簡稱為gglu。如上文解釋的，例如，另一個(gè)接頭元件可以為另一個(gè)glu殘基或oeg分子。glu的氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)而與延長部分的羧基基團(tuán)，或與例如oeg分子(若存在)的羧基基團(tuán)，或與例如另一個(gè)glu(若存在)的γ羧基基團(tuán)形成酰胺鍵。

由于氨基酸谷氨酸的α羧基基團(tuán)在這里被用于與另一個(gè)接頭元件或賴氨酸的ε氨基基團(tuán)連接，化學(xué)式7還可被稱為α-glu，或簡稱為aglu，或簡寫為glu。

化學(xué)式6和化學(xué)式7的上述結(jié)構(gòu)涵蓋了glu的l形式以及d形式。在特定實(shí)施方案中，化學(xué)式6和/或化學(xué)式7獨(dú)立地為a)l形式，或b)d形式。

在更進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，該接頭具有a)5至41個(gè)c原子；和/或b)4-28個(gè)雜原子。

可使用任何合適的方法確定本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑(glp-1肽)的血漿濃度。例如，可使用lc-ms(液相色譜質(zhì)譜法)，或免疫測定如ria(放射免疫測定)、elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定)以及l(fā)oci(發(fā)光氧通道免疫測定)。合適的ria和elisa測定的一般方案可見于例如wo09/030738第116-118頁。優(yōu)選的測定為loci(發(fā)光氧通道免疫測定)，通常如poulsen和jensen在journalofbiomolecularscreening2007，vol.12，p.240-247中針對胰島素測定所描述的——簡單來說，可以以期望的間隔收集血液樣品，將血漿分離，立即冷凍并保持在-20℃下直至分析相應(yīng)glp-1激動(dòng)劑(例如，glp-1肽)的血漿濃度；將供體珠子用鏈霉親和素包被，并將接受體珠子與識別肽的中間/c末端表位的單克隆抗體綴合；將對n末端具有特異性的另一種單克隆抗體進(jìn)行生物素化；將三種反應(yīng)物與分析物混合并形成雙位點(diǎn)的免疫復(fù)合物；對復(fù)合物的照射使單線態(tài)氧原子從供體珠子上釋放，該單線態(tài)氧原子被引導(dǎo)至接受體珠子中并觸發(fā)可以在envision酶標(biāo)儀中測量的化學(xué)發(fā)光；光的量與化合物的濃度成比例。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽包含式(i)(seqidno9)的氨基酸序列：

式(i)：xaa7-xaa8-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-xaa16-ser-xaa18-xaa19xaa20gluxaa22-xaa23-ala-xaa25-xaa26-xaa27-phe-ile-xaa30-trp-leu-xaa33-xaa34-xaa35--xaa36-xaa37-xaa38-xaa39-xaa40-xaa41-xaa42-xaa43-xaa44-xaa45-xaa46

其中

xaa7為l-組氨酸、d-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、n^α-乙酰基-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；

xaa8為ala、gly、val、leu、ile、lys、aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；

xaa16為val或leu；

xaa18為ser、lys或arg；

xaa19為tyr或gln；

xaa20為leu或met；

xaa22為gly、glu或aib；

xaa23為gln、glu、lys或arg；

xaa25為ala或val；

xaa26為lys、glu或arg；

xaa27為glu或leu；

xaa30為ala、glu或arg；

xaa33為val或lys；

xaa34為lys、glu、asn或arg；

xaa35為gly或aib；

xaa36為arg、gly或lys；

xaa37為gly、ala、glu、pro、lys、酰胺或不存在；

xaa38為lys、ser、酰胺或不存在；

xaa39為ser、lys、酰胺或不存在；

xaa40為gly、酰胺或不存在；

xaa41為ala、酰胺或不存在；

xaa42為pro、酰胺或不存在；

xaa43為pro、酰胺或不存在；

xaa44為pro、酰胺或不存在；

xaa45為ser、酰胺或不存在；

xaa46為酰胺或不存在；

條件是如果xaa38、xaa39、xaa40、xaa41、xaa42、xaa43、xaa44、xaa45或xaa46不存在，則每個(gè)下游氨基酸殘基也不存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽包含式(ii)(seqidno10)的氨基酸序列：

式(ii)：xaa7-xaa8-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-xaa18-tyr-leu-glu-xaa22-xaa23-ala-ala-xaa26-glu-phe-ile-xaa3o-trp-leu-val-xaa34-xaa35-xaa36-xaa37xaa38

其中

xaa7為l-組氨酸、d-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、-羥基-組氨酸、高組氨酸、n^α-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；

xaa8為ala、gly、val、leu、ile、lys、aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；

xaa18為ser、lys或arg；

xaa22為gly、glu或aib；

xaa23為gln、glu、lys或arg；

xaa26為lys、glu或arg；xaa30為ala、glu或arg；

xaa34為lys、glu或arg；

xaa35為gly或aib；

xaa36為arg或lys；

xaa37為gly、ala、glu或lys；

xaa38為lys、酰胺或不存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽為利拉魯肽。利拉魯肽是用于每日一次給藥的單?；痝lp-1肽，其由novonordiska/s銷售，并且在wo98/08871的實(shí)施例37中公開。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括glp-1激動(dòng)劑(例如，glp-1肽)的藥學(xué)上可接受的鹽。這樣的鹽包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽、藥學(xué)上可接受的金屬鹽、銨鹽和烷基化的銨鹽。藥學(xué)上可接受的酸加成鹽還意欲包括本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑(例如，glp-1肽)能夠形成的水合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽包含在位置8處的aib殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所用的術(shù)語“aib”是指α-氨基異丁酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述glp-1肽的位置7處的氨基酸殘基選自d-組氨酸、脫氨基組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、n^α-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑肽包含下式的氨基酸序列：h-his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑包含經(jīng)由親水性間隔區(qū)與所述glp-1肽的c末端氨基酸殘基連接的白蛋白結(jié)合殘基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑包含與不是c末端氨基酸殘基的氨基酸殘基連接的第二白蛋白結(jié)合殘基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑(例如，glp-1肽)選自利拉魯肽和司美魯肽(semaglutide)。

利拉魯肽是用于每日一次給藥的單?；痝lp-1激動(dòng)劑，其由novonordiska/s自2009年起銷售，在wo98/08871的實(shí)施例37中公開。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽為司美魯肽。wo06/097537公開了司美魯肽(實(shí)施例4)，它是一種用于每周一次給藥的單?；痝lp-1激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽具有結(jié)構(gòu)his-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-lys-aib-arg。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽包含arg34glp-1(7-37)或[aib8，arg34]glp-1-(7-37)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑包含igg的fc片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑包含igg的fc片段以及一個(gè)或多個(gè)、例如兩個(gè)glp-1肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑選自阿比魯肽和度拉魯肽(dulaglitide)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽具有以下結(jié)構(gòu)：his-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-lys-aib-arg。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽具有以下結(jié)構(gòu)：與人白蛋白重組融合的(his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-lys-gly-arg)2。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽為度拉魯肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，配制glp-1激動(dòng)劑以使其在人體中具有至少48小時(shí)的半衰期。這可以通過本領(lǐng)域已知的持續(xù)釋放制劑獲得。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑為毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3，毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3類似物，或任何這些的衍生物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽選自艾塞那肽、阿比魯肽和度拉魯肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽為艾塞那肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽包含下式的氨基酸序列：h-his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2。艾塞那肽是在鈍尾毒蜥(gilamonster)唾液中發(fā)現(xiàn)的一種激素——毒蜥外泌肽-4的合成形式。艾塞那肽展現(xiàn)出與glp-1相似的生物學(xué)性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，組合物為(含艾塞那肽的plga顆粒的長效釋放配方)。在一個(gè)實(shí)施方案中，“組合物”是指包含艾塞那肽、聚(d，l-丙交酯-共-乙交酯)和蔗糖的粉末，其在臨注射前，在包含羧甲基纖維素鈉、氯化鈉、聚山梨酯20、磷酸二氫鈉(例如其一水合物)、磷酸氫二鈉(例如其七水合物)和注射用水的溶劑中重建。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽具有結(jié)構(gòu)：與人白蛋白遺傳融合的(his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-lys-gly-arg)2。阿比魯肽是一種重組的人血清白蛋白(hsa)-glp-1雜合蛋白，像是與hsa融合的glp-1二聚體。組成glp-1肽是其中位置8處的ala已被glu置換的類似物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽為度拉魯肽。度拉魯肽是一種glp-1-fc構(gòu)建體(glp-1-接頭-來自igg4的fc)。

藥物組合物

藥物組合物的制備是本領(lǐng)域已知的。為方便起見，參考remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第19版，1995。

根據(jù)本發(fā)明的制劑可包含緩沖液體系、防腐劑、張度劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物制劑為水性制劑，即包含水的制劑。這樣的制劑通常是溶液或懸浮液。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，該藥物制劑為水溶液。術(shù)語“水性制劑”被定義為包含至少50％w/w水的制劑。類似地，術(shù)語“水溶液”被定義為包含至少50％w/w水的溶液，并且術(shù)語“水性懸浮液”被定義為包含至少50％w/w水的懸浮液。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑為無需任何預(yù)先溶解即可備用的干燥制劑(例如，冷凍干燥的或噴霧干燥的)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液可選自乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、磷酸鹽、磷酸氫鹽和三(羥甲基)氨基甲烷(tris)、n-二(羥乙基)甘氨酸(bicine)、n-三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、琥珀酸鹽、天冬氨酸、天冬酰胺或其混合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物的ph在5-10，如6-9、6-8、5-7、7-9或如5.5-7.5的范圍內(nèi)。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述防腐劑選自苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、芐醇、氯丁醇、氯甲酚、芐索氯銨或其混合物。防腐劑在藥物組合物中的應(yīng)用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第19版，1995。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含等滲劑。該等滲劑可選自鹽(例如氯化鈉)，糖如單糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖(包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐)，或糖醇如氨基酸(例如l-甘氨酸、l-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)，醛醇(例如甘油(丙三醇)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如peg400)，或其混合物。糖醇包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿糖醇。

等滲劑在藥物組合物中的應(yīng)用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第19版，1995。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含螯合劑。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，該螯合劑選自乙二胺四乙酸(edta)、檸檬酸和天冬氨酸、egta的鹽，及其混合物。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑在藥物組合物中的應(yīng)用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第19版，1995。

本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含一定量的氨基酸堿，該量足以減少該組合物儲(chǔ)存期間多肽或蛋白質(zhì)的聚集體形成?！鞍被釅A”意指氨基酸或氨基酸的組合，其中任何給定的氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。該氨基酸可以是精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、氨基胍、鳥氨酸和n-單乙基l-精氨酸、乙硫氨酸和丁硫氨酸以及s-甲基-l半胱氨酸。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含選自高分子量聚合物或低分子量化合物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，該穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如，peg3350)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羥基纖維素或其衍生物(例如，hpc、hpc-sl、hpc-l和hpmc)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)如單硫代甘油、巰基乙酸和2-甲基硫代乙醇，以及不同的鹽(例如氯化鈉)。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含表面活性劑。典型的表面活性劑(其中商品名的例子在方括號[]中給出)為聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單月桂酸酯[吐溫20]、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單棕櫚酸酯[吐溫40]或聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單油酸酯[吐溫80]、泊洛沙姆如聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物[pluronicf68/泊洛沙姆188]、聚乙二醇辛基苯基醚[tritonx-100]或聚氧乙二醇十二烷基醚[brij35]。表面活性劑在藥物組合物中的應(yīng)用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第19版，1995。

在特定的實(shí)施方案中，利拉魯肽可以以包含5-10.0mg/ml利拉魯肽、1-2mg/ml磷酸二鈉二水合物、10-20mg/ml丙二醇和2-8mg/ml苯酚的水溶液施用。

在特定的實(shí)施方案中，利拉魯肽可以以由6.0mg/ml利拉魯肽、1.42mg/ml磷酸二鈉二水合物、14.0mg/ml丙二醇、5.5mg/ml苯酚以及用于將ph調(diào)節(jié)至8.15的naoh和/或hcl組成的水溶液施用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)和il-21功能抑制劑的組合物。glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)和il-21功能抑制劑可包含在單個(gè)組合物或不同的組合物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑以不同的組合物提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑一起配制的一種或多種本發(fā)明il-21功能抑制劑和/或glp-1激動(dòng)劑(如glp-1肽)的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明使用的組合物單獨(dú)地配制成分別包含適合于glp-激動(dòng)劑和il-21抑制劑的不同緩沖液和賦形劑。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含抗體的水溶液和緩沖液，其中該抗體以1mg/ml或以上(例如1-200、1-100、50-200、50-150、50-100、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200mg/ml)的濃度存在，并且其中所述組合物具有從約6.0至約8.0的ph，例如約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7，9或8.0。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體制劑包含組氨酸、蔗糖、精氨酸、聚山梨酯和氯化鈉。高濃度抗體制劑的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的并且在例如wo2011/104381中描述。

在一個(gè)實(shí)施方案中，配制glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)以使其在人體中具有至少48小時(shí)的半衰期。這可以通過本領(lǐng)域已知的持續(xù)釋放組合物獲得。

給藥模式

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的給藥可通過若干種給藥途徑，例如，舌部給藥、舌下給藥、頰部給藥、口中給藥、口服給藥、胃腸中給藥、鼻部給藥、肺部給藥，例如通過細(xì)支氣管和肺泡或其組合、表皮給藥、真皮給藥、經(jīng)皮給藥、陰道給藥、直腸給藥、眼部給藥，例如通過結(jié)膜，輸尿管給藥以及腸胃外給藥來給予需要這樣的治療的患者。

藥物組合物可在若干個(gè)部位處施用至需要這樣的治療的患者，例如，在局部部位例如皮膚和粘膜部位，在繞開吸收的部位例如在動(dòng)脈、靜脈、心臟中給藥，以及在與吸收有關(guān)的部位例如在皮膚中、皮膚下、肌肉中或腹部中給藥。

可借助于注射器，任選地筆式注射器，通過皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行腸胃外給藥。或者，可借助于輸液泵進(jìn)行腸胃外給藥。進(jìn)一步的選項(xiàng)是可以為用于以鼻部或肺部噴霧的形式施用化合物的溶液或懸浮液的組合物。作為更進(jìn)一步的選項(xiàng)，還可使含有本發(fā)明的[蛋白質(zhì)]化合物的藥物組合物適應(yīng)于例如通過無針注射或從貼片(任選地離子電滲貼片)經(jīng)皮給藥，或經(jīng)粘膜例如頰部給藥。

本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑(如glp-1肽)和il-21功能抑制劑可單獨(dú)或組合施用，例如各自以分開的劑量形式施用或以單劑量形式組合施用。

本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑(如glp-1肽)和il-21功能抑制劑可伴隨地或順序地施用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑與在本文定義的治療中使用的其他治療活性劑一起共施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述其他治療活性劑為胰島素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑和/或il-21功能抑制劑的給藥途徑可以是有效地將活性化合物轉(zhuǎn)運(yùn)至適當(dāng)或期望的作用部位的任何途徑，如腸胃外途徑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑和/或il-21功能抑制劑的藥物或藥物組合物可以腸胃外施用至有需要的患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，可借助于注射器，任選地筆式注射器，通過皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行腸胃外給藥。

本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)和/或il-21功能抑制劑可腸胃外施用，如靜脈內(nèi)施用，如肌肉內(nèi)施用，如皮下施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，該glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)和/或il-21功能抑制劑通過腸胃外給藥如皮下注射施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可借助于注射器，任選地筆式注射器，通過皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行腸胃外給藥。或者，可借助于輸液泵進(jìn)行腸胃外給藥。進(jìn)一步的選項(xiàng)是可以為用于以鼻部或肺部噴霧的形式施用glp-1激動(dòng)劑的粉末或液體的組合物。作為更進(jìn)一步的選項(xiàng)，該glp-1激動(dòng)劑還可以經(jīng)皮或經(jīng)粘膜施用，例如，頰部施用。

或者，本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)和/或il-21功能抑制劑可經(jīng)由非腸胃外途徑施用，如經(jīng)口或局部施用。本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)和/或il-21抑制劑可預(yù)防性地施用。本發(fā)明的glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)和/或il-21抑制劑可治療性地(按需)施用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，皮下施用glp-1激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)或皮下施用il-21抑制劑。

glp-1激動(dòng)劑和il-21抑制劑的頻率和劑量將取決于多個(gè)因素，特別是受試者中取決于給藥途徑的治療劑半衰期和生物利用度。

已用于治療2型糖尿病的glp-1激動(dòng)劑每日一次或兩次施用。具有進(jìn)一步延長的半衰期的glp-1激動(dòng)劑適合于每周一次給藥。如果可能，只要半衰期和生物利用度支持，甚至更加不頻繁的給藥如每10天或每兩星期(2周)都可以是合適的。根據(jù)關(guān)于glp-1激動(dòng)劑治療的一般知識調(diào)整劑量方案。可以使用更低的起始劑量來減少副作用。

同樣，根據(jù)在給定組合物中的治療劑的半衰期和生物利用度，可以每日或每周施用il-21抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，il-21抑制劑如抗體分子具有延長的半衰期，因此給藥較不頻繁，如每月或至多每4周給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，每年施用約6-10個(gè)劑量單位，如每4-8周(如每5-7周)一個(gè)劑量單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，glp-1肽每日施用而il-21抑制劑每6周施用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所用的，關(guān)于數(shù)字或間隔給出的具體值可被理解為該具體值或大約該具體值。

治療和/或預(yù)防

1型糖尿病是一種進(jìn)行性自身免疫疾病，其中身體產(chǎn)生胰島素的能力隨著胰腺的β細(xì)胞被破壞而逐漸降低。

1型糖尿病被認(rèn)為是一種慢性病，其通?？焖龠M(jìn)展至胰島素依賴性階段，例如，患者需要外源胰島素來使血糖保持得較低。1型糖尿病(type1diabetesmellitus)(t1dm)或僅僅1型糖尿病(type1diabetes)(t1d)的臨床診斷為：

●hba1c≥6.5％，或

●空腹血漿葡萄糖≥7.0(126mg/dl)，或

●在葡萄糖負(fù)荷為在水中的75克無水葡萄糖的口服葡萄糖耐量試驗(yàn)期間，2小時(shí)血漿葡萄糖≥11.1mmol/dl(200mg/dl)，或者

●高血糖癥的典型癥狀并且隨機(jī)血漿葡萄糖≥11.1mm/l。

1型糖尿病的典型治療是補(bǔ)充外源胰島素，以便替代失去的胰島素并由此獲得血糖的控制。健康個(gè)體能夠非常嚴(yán)格地調(diào)節(jié)血糖水平。即使使用現(xiàn)代的胰島素產(chǎn)品，糖尿病患者仍難以獲得類似地良好調(diào)控的血糖，并且仍存在低血糖和高血糖發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明涉及新診斷的個(gè)體中的1型糖尿病的治療和預(yù)防。在一個(gè)實(shí)施方案中，該個(gè)體具有至少0.2nmol/l的非空腹c-肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，該個(gè)體具有至少0.2nmol/l的空腹c-肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，已檢測到該個(gè)體中一種或多種胰島自身抗體的存在。

如上文所述，本發(fā)明涉及通過施用有效量的glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽和有效量的il-21功能抑制劑治療和/或預(yù)防1型糖尿病。在本案中，治療和/或預(yù)防不一定指完全治愈或阻止1型糖尿病進(jìn)展。本發(fā)明涉及最近診斷的1型糖尿病患者或具有發(fā)展為1型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的治療。如上所述，1型糖尿病是一種進(jìn)行性疾病，其中患者逐漸喪失產(chǎn)生足夠胰島素的能力。

多數(shù)1型糖尿病患者需要胰島素治療，而本文所述的方法允許遵循正常指南的伴隨性胰島素治療，以便實(shí)現(xiàn)代謝控制。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療保持p細(xì)胞功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療增強(qiáng)內(nèi)源胰島素分泌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，從治療開始起，β細(xì)胞功能保持至少一年，如至少兩年。

可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量β細(xì)胞功能，例如產(chǎn)生胰島素的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療增加空腹c-肽的濃度。

c-肽在胰島素產(chǎn)生過程中釋放。在健康個(gè)體中，c-肽的濃度為0.5至2.7納克/毫升(ng/ml)。盡管1型糖尿病患者在診斷時(shí)產(chǎn)生一些胰島素并因此產(chǎn)生相似量的c-肽，但該能力通常在相對較短的時(shí)期內(nèi)喪失。

在患有t1dm的一些個(gè)體中，診斷后可能產(chǎn)生非常少量的胰島素，持續(xù)延長的一段時(shí)間(＞10年)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，從治療開始起，c-肽濃度保持至少一年，如至少兩年。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以響應(yīng)于混合餐耐量試驗(yàn)(mmtt)測量產(chǎn)生胰島素的能力。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，在該試驗(yàn)中測量c-肽的量，并與治療前響應(yīng)于該試驗(yàn)測得的c-肽的量相比較。參數(shù)可以是血液中c-肽的auc0-2h、auc0-4h或最大mmx。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與標(biāo)準(zhǔn)治療相比，非空腹c-肽分泌的減少是降低的。在一個(gè)實(shí)施方案中，與標(biāo)準(zhǔn)胰島素治療相比，非空腹c-肽分泌的減少(mmtt)是降低的，持續(xù)至少一年或例如兩年。

在一個(gè)實(shí)施方案中，非空腹c-肽的水平從治療開始起得到維持。在一個(gè)實(shí)施方案中，非空腹c-肽相對于基線(治療開始)的減少為1年后至多10％，或例如1年后至多5％。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療改善了血糖控制。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的治療和/或預(yù)防使受試者的平均血糖降低。該治療可幫助患者達(dá)成治療目標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者達(dá)到了低于使用標(biāo)準(zhǔn)治療通常獲得的hba1c。糖尿病患者的一般目標(biāo)是保持hba1c低于6.5％。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療在治療期內(nèi)降低hba1c。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療在延長的一段時(shí)間內(nèi)降低hba1c。在一個(gè)實(shí)施方案中，更多患者獲得低于6.5％的hba1c(與標(biāo)準(zhǔn)治療相比)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與治療前的空腹血漿葡萄糖的測量值相比，該治療改善了空腹血漿葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，與使用標(biāo)準(zhǔn)胰島素治療達(dá)到的平均值相比，該治療改善了空腹血漿葡萄糖。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療延長了受試者產(chǎn)生內(nèi)源胰島素的時(shí)間段。因此，該治療因此可以使受試者需要(外源)胰島素的時(shí)間點(diǎn)延后，并且/或者降低所需(外源)胰島素的量。因此，該治療可減緩β細(xì)胞破壞的進(jìn)展并減低對外源胰島素的依賴性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療降低對外源胰島素的依賴性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的治療和/或預(yù)防允許受試者降低外源胰島素例如胰島素注射的量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療降低空腹血漿葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療減輕胰島炎。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在1-4周或1-6個(gè)月的時(shí)間框架內(nèi)觀察治療。由于1型糖尿病被認(rèn)為是一種進(jìn)行性慢性疾病，因此所觀察到的效果應(yīng)該優(yōu)選地維持長達(dá)一年或兩年。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療使β細(xì)胞功能保持6、12、18或24周。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療使β細(xì)胞功能保持36、42、48或52周。

在一個(gè)實(shí)施方案中，大多數(shù)患者維持β細(xì)胞功能至少一年。在一個(gè)實(shí)施方案中，大多數(shù)患者維持β細(xì)胞功能至少兩年。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療允許患者減少外源胰島素的量，該減少是通過減少每日劑量(以經(jīng)過三天的平均值計(jì)算的單位/kg)或每天施用的胰島素注射的次數(shù)(三天平均值)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療使胰島素需求降低6、12、18或24周。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療使胰島素需求降低36、42、48或52周。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的glp-1激動(dòng)劑和有效量的il-21抑制劑。如上文所述，兩種化合物可以分開施用，然而應(yīng)當(dāng)理解，glp-1激動(dòng)劑和l-21抑制劑的聯(lián)合給藥才是如本文所述對1型糖尿病治療有效的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療1型糖尿病的方法，其包括向有需要的受試者施用組合起來有效的一定量的glp-1激動(dòng)劑和一定量的il-21功能抑制劑。

可根據(jù)glp-1和il-21抑制劑的身份調(diào)整確切劑量?？筛鶕?jù)產(chǎn)品的半衰期調(diào)整劑量和劑量頻率。

對于glp-1肽衍生物，如利拉魯肽，每劑量單位施用0.01-100mg如0.1-1.8mg的劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，每劑量單位施用0.5mg至2mg。通常施用一個(gè)每日劑量。對于半衰期延長的glp-1激動(dòng)劑(包括glp-1肽)，給藥可以為每周兩次或一次。如果生物利用度擴(kuò)大，甚至可以預(yù)見每月給藥一次。

對于抗體il-21抑制劑，每單位劑量施用5-20mg/kg的劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用10-15mg/kg。與glp-1激動(dòng)劑相比，抗體產(chǎn)品的施用通常不那么頻繁，例如至多每周一次。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體il-21抑制劑每4-10周施用，如每4-8周，如每6周施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，每6周施用12mg/kg的抗-il-21抗體。

雖然本文描述和示出了本發(fā)明的某些特征，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員現(xiàn)將想到許多修改、替換、改變和等同物。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本申請旨在涵蓋落在本發(fā)明的真正精神內(nèi)的所有這類修改和變化。所附的實(shí)施方案和權(quán)利要求不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明。

本發(fā)明的實(shí)施方案

1.glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽以及il-21功能抑制劑用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的用途。

2.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述抑制劑中和il-21功能。

3.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑是能夠特異性結(jié)合il-21的抗體。

4.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑為抗-il-21抗體。

5.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑與受體競爭結(jié)合il-21，其中所述受體選自由il-21rα和γc組成的列表。

6.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑與il-21rα競爭結(jié)合il-21。

7.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑與人il-21的螺旋1和3結(jié)合。

8.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑與il-21上的不連續(xù)表位結(jié)合，其中所述表位包含如seqidno1中所示的氨基酸i37至y52和n92至p108。

9.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑包含如seqidno2中所示的三個(gè)cdr序列以及如seqidno3中所示的三個(gè)cdr序列。

10.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑是與γc競爭結(jié)合il-21的抗-il-21抗體。

11.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑與人il-21的螺旋2和4結(jié)合。

12.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑與包含如seqidno1中所示的氨基酸glu65、asp66、val67、glu68、thr69、asn70、glu72、trp73、lys117、his118、arg119、leu143、lys146、met147、his149、gln150和his151的表位結(jié)合。

13.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑包含如seqidno4中所示的三個(gè)cdr序列以及如seqidno5中所示的三個(gè)cdr序列。

14.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述il-21功能抑制劑以10⁷m^-1或更高、10⁸m^-1或更高、10⁹m^-1或更高、10¹⁰m^-1或更高、10¹¹m^-1或更高或者10¹²m^-1或更高的結(jié)合親和力特異性結(jié)合il-21。

15.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述glp-1肽為利拉魯肽。

16.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑伴隨地或順序地施用。

17.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述glp-1激動(dòng)劑每日施用而所述il-21抑制劑每6周施用。

18.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被施用至近期診斷出1型糖尿病的受試者。

19.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被施用至具有至少0.2nmol/l的非空腹c-肽的受試者。

20.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被施用至具有發(fā)展為1型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者，如具有胰島自身抗體的受試者或沒有胰島自身抗體但在遺傳上存在風(fēng)險(xiǎn)的受試者。

21.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中從治療開始起，β-細(xì)胞功能保持至少一年。

22.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中與標(biāo)準(zhǔn)胰島素治療相比，平均每日胰島素需求降低。

23.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中每個(gè)劑量單位施用0.01-100mg，如0.1-1.8mg的glp-1激動(dòng)劑，如glp-1肽。

24.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被包含在任選地含有一種或多種額外賦形劑的組合物中。

25.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被任選地含有一種或多種額外賦形劑的單獨(dú)藥物組合物所包含。

26.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物為水性組合物或冷凍干燥組合物的形式。

27.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物具有在5-10如6-8范圍內(nèi)的ph。

28.一種用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽，以及il-21功能抑制劑。

29.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抑制劑中和il-21功能。

30.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑是能夠特異性結(jié)合il-21的抗體。

31.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑為抗-il-21抗體。

32.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑與受體競爭結(jié)合il-21，其中所述受體選自由il-21rα和γc組成的列表。

33.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑與il-21rα競爭結(jié)合il-21。

34.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑與人il-21的螺旋1和3結(jié)合。

35.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑與il-21上的不連續(xù)表位結(jié)合，其中所述表位包含如seqidno1中所示的氨基酸i37至y52和n92至p108。

36.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑包含如seqidno2中所示的三個(gè)cdr序列以及如seqidno3中所示的三個(gè)cdr序列。

37.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑是與γc競爭結(jié)合il-21的抗-il-21抗體。

38.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑與人il-21的螺旋2和4結(jié)合。

39.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑與包含如seqidno1中所示的氨基酸glu65、asp66、val67、glu68、thr69、asn70、glu72、trp73、lys117、his118、arg119、leu143、lys146、met147、his149、gln150和his151的表位結(jié)合。

40.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑包含如seqidno4中所示的三個(gè)cdr序列以及如seqidno5中所示的三個(gè)cdr序列。

41.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述il-21功能抑制劑以10⁷m^-1或更高、10⁸m^-1或更高、10⁹m^-1或更高、10¹⁰m^-1或更高、10¹¹m^-1或更高或者10¹²m^-1或更高的結(jié)合親和力特異性結(jié)合il-21。

42.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述glp-1激動(dòng)劑為利拉魯肽。

43.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑伴隨地或順序地施用。

44.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述glp-1激動(dòng)劑每日施用而所述il-21抑制劑每6周施用。

45.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被施用至近期診斷出1型糖尿病的受試者。

46.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被施用至具有至少0.2nmol/l的非空腹c-肽濃度的受試者。

47.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被施用至具有發(fā)展為1型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者，如具有胰島自身抗體的受試者或沒有胰島自身抗體但在遺傳上存在風(fēng)險(xiǎn)的受試者。

48.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑。

49.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中與標(biāo)準(zhǔn)治療相比，非空腹c-肽分泌的減少是降低的。根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中從治療開始起，β細(xì)胞功能保持至少一年。

50.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中與標(biāo)準(zhǔn)胰島素治療相比，平均每日胰島素需求降低。

51.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中每個(gè)劑量單位施用0.01-100mg，如0.1-1.8mg的glp-1激動(dòng)劑，如glp-1肽。

52.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被任選地含有一種或多種額外賦形劑的單獨(dú)藥物組合物所包含。

53.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物為水性組合物或冷凍干燥組合物的形式。

54.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物具有在5-10如6-8范圍內(nèi)的ph。

55.在用于治療和/或預(yù)防1型糖尿病的一種或多種藥物的制備中使用的glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽，以及il-21功能抑制劑。

56.在治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法中使用的glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽，以及il-21功能抑制劑。

57.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述抑制劑中和il-21功能。

58.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑是能夠特異性結(jié)合il-21的抗體。

59.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑為抗-il-21抗體。

60.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑與受體競爭結(jié)合il-21，其中所述受體選自由il-21rα和γc組成的列表。

61.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑與il-21rα競爭結(jié)合il-21。

62.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑與人il-21的螺旋1和3結(jié)合。

63.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑與il-21上的不連續(xù)表位結(jié)合，其中所述表位包含如seqidno1中所示的氨基酸i37至y52和n92至p108。

64.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑包含如seqidno2中所示的三個(gè)cdr序列以及如seqidno3中所示的三個(gè)cdr序列。

65.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑是與γc競爭結(jié)合il-21的抗-il-21抗體。

66.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑與人il-21的螺旋2和4結(jié)合。

67.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑與包含如seqidno1中所示的氨基酸glu65、asp66、val67、glu68、thr69、asn70、glu72、trp73、lys117、his118、arg119、leu143、lys146、met147、his149、gln150和his151的表位結(jié)合。

68.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑包含如seqidno4中所示的三個(gè)cdr序列以及如seqidno5中所示的三個(gè)cdr序列。

69.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述il-21功能抑制劑以10⁷m^-1或更高、10⁸m^-1或更高、10⁹m^-1或更高、10¹⁰m^-1或更高、10¹¹m^-1或更高或者10¹²m^-1或更高的結(jié)合親和力特異性結(jié)合il-21。

70.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述glp-1激動(dòng)劑為利拉魯肽。

71.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑伴隨地或順序地施用。

72.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述glp-1激動(dòng)劑每日施用而所述il-21抑制劑每6周施用。

73.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被施用至近期診斷出1型糖尿病的受試者。

74.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被施用至具有至少0.2nmol/l的非空腹c-肽濃度的受試者。

75.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被施用至具有發(fā)展為1型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者，如具有胰島自身抗體的受試者或沒有胰島自身抗體但在遺傳上存在風(fēng)險(xiǎn)的受試者。

76.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中從治療開始起，β細(xì)胞功能保持至少一年。

77.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中與標(biāo)準(zhǔn)胰島素治療相比，平均每日胰島素需求降低。

78.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中每個(gè)劑量單位施用0.01-100mg，如0.1-1.8mg的glp-1激動(dòng)劑。

79.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被包含在任選地含有一種或多種額外賦形劑的組合物中。

80.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述glp-1激動(dòng)劑和所述il-21功能抑制劑被任選地含有一種或多種額外賦形劑的單獨(dú)藥物組合物所包含。

81.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑和il-21功能抑制劑，其中所述組合物為水性組合物或冷凍干燥組合物的形式。

82.根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽以及il-21功能抑制劑，其中所述組合物具有在5-10如6-8范圍內(nèi)的ph。

實(shí)施例

材料與方法

glp-1肽利拉魯肽是可商購獲得的，并且可以如wo98/08871的實(shí)施例37所述生產(chǎn)。例如，可通過用人il-21或小鼠il-21免疫，如wo2010/055366的實(shí)施例1所述生產(chǎn)抗-il-21抗體，并且如其中的后續(xù)實(shí)施例所述表征中和活性。

試驗(yàn)(i)：glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽的體外效力

該實(shí)施例的目的在于在體外測試glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)的活性或效力。glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)的效力可如下確定，即，作為在含有表達(dá)人glp-1受體的膜的培養(yǎng)基中形成環(huán)amp(camp)的刺激。

原理；用所討論的glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)刺激來自穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系bhk467-12a(tk-ts13)、表達(dá)人glp-1受體的純化的質(zhì)膜，并使用來自perkinelmerlifesciences的alphascreentmcamp測定試劑盒測量camp產(chǎn)生的效力。alphascreen測定的基本原理是內(nèi)源camp與外源添加的生物素-camp之間的競爭。通過使用綴合至接受體珠子的特異性抗體實(shí)現(xiàn)camp的捕獲。

細(xì)胞培養(yǎng)和膜的制備；選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和高表達(dá)的克隆以供篩選。細(xì)胞在5％co2下于dmem、5％fcs、1％pen/strep(青霉素/鏈霉素)和0.5mg/ml選擇性標(biāo)記g418中生長。將約80％匯合度的細(xì)胞用pbs洗滌2次并用維爾烯(versene)(乙二胺四乙酸四鈉鹽的水溶液)收獲，在1000rpm下離心5min并去除上清液。其他步驟全部在冰上進(jìn)行。用ultrathurax將細(xì)胞沉淀物在10ml緩沖液1(20mmna-hepes，10mmedta，ph＝7.4)中勻漿化20-30秒，在20,000rpm下離心15min，并將沉淀物在10ml緩沖液2(20mmna-hepes，0.1mmedta，ph＝7.4)中重懸。將懸浮液勻漿化20-30秒并在20,000rpm下離心15min。將在緩沖液2中的懸浮、勻漿化和離心重復(fù)一次，并將膜在緩沖液2中重懸。確定蛋白質(zhì)濃度，并將膜儲(chǔ)存在-80℃下直至使用。在平底的1/2區(qū)域96孔板(例如costar目錄號：3693)中進(jìn)行測定。每孔的最終體積為50μl。

溶液和試劑；示例性的溶液和試劑在下文給出。

來自perkinelmerlifesciences的alphascreentmcamp測定試劑盒(目錄號：6760625m)；含有抗camp接受體珠子(10u/μl)，鏈霉親和素供體珠子(10u/μl)和生物素化的camp(133u/μl)。

alphascreen緩沖液，ph＝7.4：50mmtris-hcl(sigma，目錄號：t3253)；5mmhepes(sigma，目錄號：h3375)；10mmmgcl2，6h2o(merck，目錄號：5833)；150mmnacl(sigma，目錄號：s9625)；0.01％吐溫(merck，目錄號：822184)。在使用前，將以下試劑添加至alphascreen緩沖液(示出了最終濃度)：bsa(sigma，目錄號a7906)：0.1％；ibmx(sigma，目錄號i5879)：0.5mm；atp(sigma，目錄號a7699)：1mm；gtp(sigma，目錄號g8877)：1μm。

camp標(biāo)準(zhǔn)物(測定中的稀釋倍數(shù)＝5)：camp溶液：5μl的5mmcamp儲(chǔ)備液+495μlalphascreen緩沖液。

制備了camp標(biāo)準(zhǔn)物以及待測glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽在alphascreen緩沖液中的合適的稀釋系列，例如，如下八個(gè)濃度的glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽：10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13和10^-14m，以及camp的從例如10^-6至3x10^-11的系列。

膜/接受體珠子；使用hglp-1/bhk467-12a膜；6μg/孔，對應(yīng)于0.6mg/ml(每個(gè)孔所用的膜的量可能變化)?！盁o膜”：在alphascreen緩沖液中的接受體珠子(最終15μg/ml)。“6μg/孔的膜”：膜+在alphascreen緩沖液中的接受體珠子(最終15μg/ml)。將10μl“無膜”添加至camp標(biāo)準(zhǔn)物(每個(gè)孔，一式兩份)以及陽性和陰性對照。將10μl“6μg/孔的膜”添加至glp-1和glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)(每孔，一式兩份/一式三份)。陽性對照：10μl“無膜”+10μlalphascreen緩沖液。陰性對照：10μl“無膜”+10μlcamp儲(chǔ)備溶液(50μm)。由于珠子對直射光是敏感的，因此任何處理均在暗處(盡可能暗)或綠光中進(jìn)行。所有稀釋都在冰上進(jìn)行。

程序；1)制備alphascreen緩沖液。2)將glp-1激動(dòng)劑/camp標(biāo)準(zhǔn)物(例如glp-1肽/camp標(biāo)準(zhǔn)物)在alphascreen緩沖液中溶解并稀釋。3)制備供體珠子溶液并在室溫下溫育30min。4)向平板上添加camp/glp-1激動(dòng)劑(例如camp/glp-1肽)：每孔10μl。5)制備膜/接受體珠子溶液并將其添加至平板：每孔10μl。6)添加供體珠子：每孔30μl。7)將平板包裹在鋁箔中并在室溫下(非常緩慢地)在搖床上溫育3小時(shí)。8)在alphascreen上計(jì)數(shù)-計(jì)數(shù)前將每個(gè)平板在alphascreen中預(yù)溫育3分鐘?？墒褂胓raph-padprism軟件(第5版)計(jì)算ec50[pm]值。如需要，可將關(guān)于glp-1的倍數(shù)變化計(jì)算為ec50(glp-1)/ec50(類似物)-3693.2。

試驗(yàn)(ii)：glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)在小型豬中的半衰期

該研究的目的在于確定在向小型豬靜脈內(nèi)給藥后，glp-1激動(dòng)劑(例如glp-1肽)的體內(nèi)延長作用，即其作用時(shí)間的延長。這在藥代動(dòng)力學(xué)(pk)研究中完成，其中確定了所討論的glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽的終末半衰期。終末半衰期通常是指在初始分布階段后測量的、達(dá)到某個(gè)血漿濃度的一半所花費(fèi)的時(shí)間。

本研究使用的雄性哥延根小型豬從ellegaardminipigs(dalmose，denmark)獲得，年齡約7-14個(gè)月并且重量約16-35kg。將小型豬單獨(dú)圈養(yǎng)，并嚴(yán)格地每日喂食sds小型豬飲食(specialdietsservices，essex，uk)一次或兩次。在至少2周的適應(yīng)后，將兩條永久性中央靜脈導(dǎo)管植入每只動(dòng)物的尾側(cè)腔靜脈或顱側(cè)腔靜脈中。使動(dòng)物在手術(shù)后恢復(fù)1周，然后用于反復(fù)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，在給藥之間具有適當(dāng)?shù)南疵撈凇?/p>

使動(dòng)物在給藥前禁食約18h并且在給藥后禁食至少4h，但整個(gè)時(shí)期內(nèi)其隨意獲取水。

將glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽溶解在ph7.4的50mm磷酸鈉、145mm氯化鈉、0.05％吐溫80中，達(dá)到通常為20-60nmol/ml的濃度。通過一條導(dǎo)管給予該化合物的靜脈內(nèi)注射(體積通常對應(yīng)于1-2nmol/kg，例如0.033ml/kg)，并在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)對血液進(jìn)行取樣，直到給藥后13天(優(yōu)選地通過另一條導(dǎo)管)。將血液樣品(例如0.8ml)收集在edta緩沖液(8mm)中，然后在4℃和1942g下離心10分鐘。將血漿移取至干冰上的micronic管中，并在-20℃下保存，直到使用elisa或類似的基于抗體的測定或lc-ms分析相應(yīng)glp-1化合物的血漿濃度。通過winnonlinv.5.0(pharsightinc.，mountainview，ca，usa)中的非房室模型分析單獨(dú)的血漿濃度-時(shí)間譜，并確定所得到的終末半衰期(調(diào)和平均值)。

試驗(yàn)(iii)：il-21介導(dǎo)的stat-3磷酸化的抑制

可使用stat3的磷酸化作為讀出，在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中測量抗-il-21抗體中和il-21的能力。使用了用il-21受體(il-21r)轉(zhuǎn)染的baf3細(xì)胞，并且當(dāng)il-21誘導(dǎo)stat3磷酸化時(shí)，其被抗-il-21抗體的降低反映了il-21中和活性。

通過測量baf3/kz134/hil-21r細(xì)胞中配體-受體相互作用后的stat3磷酸化水平，來確定在含有抗體的上清液的存在下鼠il-21活性的降低。

根據(jù)磷酸化的stat3水平相對于與單獨(dú)配體一起溫育的對照細(xì)胞的降低百分比來確定相對中和活性。將baf3/kz134/hil-21r細(xì)胞以50,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔圓底組織培養(yǎng)板中。將鼠il-21與來自每個(gè)測試孔的上清液一起預(yù)溫育，之后轉(zhuǎn)移至接種的細(xì)胞。根據(jù)制造商的說明(bio-radlaboratories)停止反應(yīng)并將細(xì)胞裂解。收集上清液，將其與測定緩沖液混合并儲(chǔ)存。根據(jù)制造商的說明(bio-radlaboratories)，將捕獲珠子(bio-plexphospho-stat3assay，bio-radlaboratories)接種在96孔過濾板中并與細(xì)胞裂解物樣品混合并溫育。添加檢測抗體(bioradlaboratories)和鏈霉親和素-pe，并將反應(yīng)在重懸緩沖液(bioradlaboratories)中重懸。根據(jù)制造商的說明，在陣列讀取儀(bio-plex，bio-radlaboratories)上確定磷酸化stat3的水平。裂解物中磷酸化stat3轉(zhuǎn)錄因子水平的增加表明小鼠il-21受體-配體相互作用。對于中和試驗(yàn)，磷酸化stat3轉(zhuǎn)錄因子水平的降低表明mab能夠中和il-21受體-配體相互作用。

試驗(yàn)(iv)：il-21驅(qū)動(dòng)的b細(xì)胞增殖的抑制。

作為功能性測試，測試了抗mil-21中和mil-21驅(qū)動(dòng)的b細(xì)胞增殖的能力?？蛇M(jìn)行等同的試驗(yàn)來測試抗hil-21抗體，如采用從健康人類志愿者中分離的pbmc的wo2013/164021實(shí)施例10。關(guān)于抑制b細(xì)胞成熟的能力的進(jìn)一步信息可如wo2012/098113的實(shí)施例6和12中所述獲得。

材料

板：u型底96孔板(corningcostar#3894)

完全培養(yǎng)基：含有g(shù)lutamax的rpmi(目錄號61870)、0.5mm丙酮酸鈉、5ml非必需氨基酸(100x)、50μm2-me、pen/strep和10％hifbs。

純化的抗cd40：bd#553787：

純化的抗-igm：jackson#115-006-020

cd45r(b220)微珠：miltenyibiotec130-049-501

3h-胸苷：amersham，trk-565。

測試和對照材料

小鼠抗-mil-21mab，克隆397.18.2.1

重組小鼠il-21(rmil-21)

小鼠igg1同種型(抗-tnp)

從6-8周齡的野生型c57bl/6小鼠收獲脾臟，從該脾臟純化小鼠b細(xì)胞。通過迫使該器官通過70μm細(xì)胞濾器進(jìn)入pbs而制備單細(xì)胞的脾細(xì)胞。根據(jù)制造商的方案，使用磁珠和automacs細(xì)胞分離器(miltenyibiotec)，通過經(jīng)由磁珠的抗-b220陽性選擇來純化b細(xì)胞。

用以下物質(zhì)在體外刺激細(xì)胞：a)可溶性抗-igm(1μg/ml)，b)可溶性抗-cd40(1μg/ml)，和c)mil-21(25、50、100ng/ml)。在96孔板中每孔添加10⁵個(gè)純化的b細(xì)胞，并在抗-il-21抗體或同種型對照抗體的存在下，在37℃下用可溶性igm(1μg/ml)、可溶性抗-cd40igm(1μg/ml)和rmil-21(100ng/ml)刺激72h。對于溫育的最后18h，向每個(gè)孔中添加3h-胸苷，并在topcounter液體閃爍儀(perkinelmer)上測量胸苷摻入(增殖)。

結(jié)果表明，抗-mil-21抗體能夠以依賴于濃度的方式抑制b細(xì)胞增殖。

試驗(yàn)(v)：在nod模型中血糖效應(yīng)的確定

該實(shí)驗(yàn)的目的在于確定glp-1激動(dòng)劑如glp-1肽和/或il-21功能抑制劑的施用對血糖的影響。

使用近期發(fā)作的nod小鼠模型。每周篩選小鼠兩次，并將糖尿病發(fā)作定義為連續(xù)2個(gè)血糖值＞250mg/dl。小鼠從11周齡開始加入該實(shí)驗(yàn)，并且持續(xù)加入直到26周齡。給藥是基于體重的。

通過將血糖儀(bayercontourusb)與相應(yīng)的血糖試紙一起使用來測量血糖。連續(xù)兩天血糖水平＞250mg/dl的小鼠被認(rèn)為是患糖尿病的。當(dāng)?shù)谝淮斡^察到高血糖時(shí)，次日再次測量血糖。如果該測量值再次＞250mg/dl，則將動(dòng)物記錄為患糖尿病的，加入處理組，并進(jìn)一步監(jiān)測直到其達(dá)到連續(xù)兩個(gè)讀數(shù)＞600mg/dl。此時(shí)將該小鼠處死。如果如通過體重和/或總體表現(xiàn)確定的，小鼠的總體狀況正在惡化，則還在其達(dá)到血糖值＞600mg/dl之前將其處死。如果第二個(gè)測量值沒有確認(rèn)糖尿病的發(fā)作(即，＜250mg/dl)，則留下該動(dòng)物直到下一次常規(guī)測量，并且重復(fù)上述程序。

實(shí)施例1-nod模型中利拉魯肽與抗-il-21的組合

該實(shí)驗(yàn)的目的在于確定抗-il-21抗體與利拉魯肽的組合對血糖的影響。測試了短療程的小鼠替代抗-il-21抗體與每日利拉魯肽給藥組合是否可以逆轉(zhuǎn)高血糖癥。通過皮下注射在佐劑混合物中的重組小鼠il-21來免疫6至8周齡的balb/c小鼠，由此制備小鼠替代抗-il-21抗體。重組小鼠il-21可商購獲得，并具有序列mhksspqgpdrllirlrhlidiveqlkiyendldpellsapqdvkghcehaafacfqkaklkpsnpgnnktftidlvaqlrrrlparrggkkqkhiakcpscdsyekrtpkeflerlkwllqkmihqhls(seqidno13)。首先，使用標(biāo)準(zhǔn)捕獲型elisa測定選擇結(jié)合mil-21的抗體克隆，隨后選擇如通過上述stat3磷酸化試驗(yàn)所確定的具有強(qiáng)中和活性的克隆。

如本文試驗(yàn)(v)中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)如下：以下為處理組：(1)未治療的；(2)抗-il-2125mg/kg，5次給藥；(3)利拉魯肽，每日1mg/kg持續(xù)5周；以及(4)抗-il-2125mg/kg，5次給藥+利拉魯肽，每日1mg/kg持續(xù)5周。在包含小鼠后立即開始，即從第0天開始，每周兩次腹膜內(nèi)施用抗-il-21，5次。利拉魯肽以其銷售的組合物形式皮下施用，從第0天的0.3mg/kg、第1天的0.6mg/kg到隨后第2天及之后的1mg/kg緩慢升高。利拉魯肽治療在糖尿病發(fā)作后0-35天進(jìn)行；額外監(jiān)測血糖35天，每周兩次。小鼠替代抗-il-21是一種migg1/κ同種型，其具有以下vl氨基酸序列：mdfqvqifsfllisasvilsrgqtvliqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymh

wyqqksgtspkrwiydtsklasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycq

qwnsnpptfgggtklemk，和以下vh氨基酸序列：mnfgpsliflvlilkgvqcevqlvesggglvkpggslklscaasgftfnrysmsw

vrqspekrlewvaeisvggsytqyvdivtgrftisrdnakntlylemsslrsedt

amyycarlyysgsgdsyyyamdywgqgtsvtvss?？?il-21的儲(chǔ)備濃度為在ph＝7.4的20mm磷酸鹽、150mmnacl中的11mg/ml；內(nèi)毒素水平＜0.01eu/mg且純度＞95％，并且長期儲(chǔ)存在-80℃下進(jìn)行。使用前，將抗-il-21在緩沖液(20mm磷酸鹽，150mmnacl，ph＝7.4)中稀釋。用于注射至動(dòng)物中的抗-il-21的等份只解凍一次。結(jié)果在表1和圖1-2中示出。

表1.在nod模型中施用利拉魯肽和/或抗-il-21后的平均血糖(mg/dl)+/-sd(標(biāo)準(zhǔn)偏差)(發(fā)作時(shí)每組n＝10只。在實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程中，一些動(dòng)物由于高血糖值(高于600mg/dl)和/或較差的總體健康而從研究中移除并施以安樂死。剩余的n在表中示出)。所示的時(shí)間段經(jīng)過利拉魯肽治療期(糖尿病發(fā)作后的第0-35天)和額外35天的監(jiān)測。葡萄糖計(jì)的檢測極限為600mg/dl。

*)利拉魯肽僅在糖尿病發(fā)作后0-35天施用。

結(jié)果進(jìn)一步由圖1和圖2說明，圖1和圖2清楚地顯示出組1或組2中沒有動(dòng)物在70天期間存活下來。相反，在處理組3和4中被移除的小鼠的數(shù)目少得多，其中聯(lián)合治療最有效，只有一只小鼠在70天期間從研究中被移除。

來自該實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，采用抗-il-21的單一治療劑治療能夠逆轉(zhuǎn)一些小鼠中的高血糖癥。利拉魯肽單藥療法與之前的實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)一致，不影響向終末高血糖癥的進(jìn)展，盡管在給藥的前幾天記錄到血糖值的顯著卻短暫的下降。只有在兩種治療(即抗-il-21和利拉魯肽)聯(lián)合時(shí)，幾乎全部動(dòng)物才經(jīng)歷持久的血糖水平正?；Ｓ腥さ氖?，許多經(jīng)治療的動(dòng)物在停用利拉魯肽后保持正常血糖，提示功能性β-細(xì)胞群的擴(kuò)充和/或恢復(fù)。

實(shí)施例2-nod模型中利拉魯肽與抗-il-21的組合-補(bǔ)充數(shù)據(jù)

分別向處理組1至4中加入9、8、8和8個(gè)受試者來繼續(xù)如實(shí)施例1所述的小鼠的加入。新受試者的平均血糖測量值被包含在表2中，而完整數(shù)據(jù)集的平均血糖測量值被包含在表3中。

與上述受試者不同，這些數(shù)據(jù)包含3只僅僅是暫時(shí)性糖尿病的未治療小鼠(低bgv持續(xù)到第70天)。這是不常見的，但已觀察到以一定的頻率出現(xiàn)，特別是如果小鼠在糖尿病發(fā)作時(shí)相對較老。單獨(dú)用抗-il-21治療的小鼠的平均bgv受到三只“已治愈”小鼠(具有低bgv)移除的影響，因此剩余小鼠的平均bgv高于仍包含所有小鼠時(shí)將會(huì)得到的結(jié)果。

表2(額外的小鼠)

*利拉魯肽僅在糖尿病發(fā)作后0-35天施用。

^#在第35天從單獨(dú)的抗-il-21和利拉魯肽+抗-il-21組取走三只小鼠以獲得組織學(xué)樣品，因此n從5降至2和從8降至5并不反映由高bgv或較差的總體健康導(dǎo)致的小鼠的移除。

實(shí)施例3-nod模型中利拉魯肽與抗-il-21的組合-來自實(shí)施例1和實(shí)施例2的數(shù)據(jù)的匯編

來自實(shí)施例1和實(shí)施例2的所有數(shù)據(jù)都已被匯編，以提供如下表中所示的四個(gè)處理組中總共19、18、18和18個(gè)受試者的數(shù)據(jù)。

如上所述，表3中包含平均bgv值。

實(shí)施例1和2的所有小鼠的平均bgv值在圖3和圖4中示出，再次表明，未治療組和利拉魯肽治療組中存活小鼠的數(shù)目非常少，而相當(dāng)多數(shù)目的采用單獨(dú)的或與利拉魯肽聯(lián)合的抗-il-21治療的小鼠在整個(gè)70天的研究期內(nèi)保持存活。同樣，從這兩組中移除三只動(dòng)物導(dǎo)致該數(shù)據(jù)表示與實(shí)際效果不完全一致。

表3(全部小鼠)

*利拉魯肽僅在糖尿病發(fā)作后0-35天施用。

^#在第35天從單獨(dú)的抗-il-21和利拉魯肽+抗-il-21組中取出三只小鼠以獲得組織學(xué)樣品，因此n從5降至2和從8降至5并不反映由高bgv或較差的總體健康導(dǎo)致的小鼠的移除。

為評估該結(jié)果，平均bgv值必須與相對于在研究期間由于具有終末疾病而被移除的小鼠的數(shù)目而言參與并保留在該研究中的小鼠的數(shù)目相組合。這通過圖5的kaplan-meyer圖示出。上圖(圖5a)示出了仍患糖尿病的小鼠(例如bgv高于250的小鼠)的分?jǐn)?shù)(百分比)，并且包括由于bgv高于600或較差的總體健康而從研究中移除的小鼠。不出所料，只有少數(shù)未經(jīng)治療的或利拉魯肽治療的小鼠在35天時(shí)期內(nèi)自發(fā)地恢復(fù)。相反，用抗-il-21治療能夠在一半的小鼠中逆轉(zhuǎn)糖尿病(使bgv降低至250mg/ml以下)，并且與利拉魯肽聯(lián)合時(shí)，在代表治療期的該研究的前35天期間，(18只中)只有2只小鼠仍患有糖尿病。

下圖(圖5b)示出了每個(gè)處理組的存活率，其被定義為相對于每組的n，整個(gè)期間(70天)都保留在研究中的小鼠數(shù)目?？梢钥吹?，抗-il-21和聯(lián)合治療的n為15(而非18)，這解釋了被移除以供組織學(xué)檢查的3+3只小鼠。同樣，聯(lián)合治療是有效的，因?yàn)?5只小鼠中僅有2只由于終末高血糖或較差的總體健康而被處死。還注意到，到第70天時(shí)，未治療的和利拉魯肽治療的動(dòng)物中分別只有3只和0只未變成終末高血糖。

組織學(xué)檢查：組織學(xué)分析在來自每個(gè)組的小鼠子集的胰腺組織上進(jìn)行。將切片用蘇木精和伊紅(h&e)染色以評價(jià)胰島炎，并用cd8和胰島素或cd4和胰島素進(jìn)行免疫熒光染色以評價(jià)胰島炎并同時(shí)表征浸潤物內(nèi)的細(xì)胞類型。未治療的小鼠和利拉魯肽治療的小鼠保留有較少的可見胰島(如在已變成終末高血糖(bgv＞600mg/dl)的小鼠中所預(yù)期的)。來自這些小鼠的胰腺表現(xiàn)出重度細(xì)胞浸潤，而用單獨(dú)的或與利拉魯肽聯(lián)合的抗-il-21治療的小鼠顯示出降低的浸潤程度。在用單獨(dú)的或與利拉魯肽聯(lián)合的抗-il-21治療的存活小鼠中，胰島炎減輕。

實(shí)施例4-nod模型中利拉魯肽與抗-il-21的組合-確認(rèn)研究

本研究使用如下表所示的處理組，如實(shí)施例1所述進(jìn)行。

此處未包含詳細(xì)數(shù)據(jù)，因?yàn)榭傮w結(jié)果與較早的研究一致。

簡要說明：抗-il-21單藥療法在疾病發(fā)作后的前35天內(nèi)成功地治愈了75％患有確定的高血糖癥的小鼠，而單獨(dú)的利拉魯肽對糖尿病進(jìn)展影響較小，其中60％的小鼠在利拉魯肽治療期結(jié)束前變成終末高血糖，而剩余的40％在之后很快變成終末高血糖。

然而，當(dāng)抗-il-21和利拉魯肽聯(lián)合施用時(shí)，此方案逆轉(zhuǎn)了87％的經(jīng)治療小鼠中的確定的高血糖癥，并且直到高血糖癥發(fā)作后70天，與未治療的小鼠和用單獨(dú)利拉魯肽治療的小鼠相比，還導(dǎo)致了提高的存活率(對于聯(lián)合療法，80％存活；對于單獨(dú)利拉魯肽治療和未治療，0％存活)。與未治療的和用單獨(dú)利拉魯肽治療的小鼠相比，抗-il-21單藥療法還提供了提高的存活率(75％)。

數(shù)據(jù)表明，與采用任一種藥劑的單藥療法相比，抗-il-21加上利拉魯肽的聯(lián)合療法提供了增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)確定的糖尿病的效力。即使在停用利拉魯肽后，大多數(shù)小鼠的這種向正常血糖的恢復(fù)仍保持穩(wěn)定。