專利名稱：Gm3合酶作為糖尿病微血管并發(fā)癥的治療靶標(biāo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及GM3合酶抑制劑用于治療糖尿病微血管并發(fā)癥的用途，和篩選該酶抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
微血管病是糖尿病的慢性并發(fā)癥，其特征為微血管結(jié)構(gòu)和功能的改變。視網(wǎng)膜和腎是病理條件的兩個主要靶標(biāo)，該病理條件導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病。
在發(fā)達(dá)國家，糖尿病視網(wǎng)膜病變是排在第二位的失明原因。患此疾病約二十年后，幾乎所有的1型糖尿病患者和超過60％的2型糖尿病患者患有微血管并發(fā)癥(Fong等人，2003)。毛細(xì)血管經(jīng)歷進(jìn)行性的結(jié)構(gòu)改變，如基底膜增厚和周細(xì)胞的特異性丟失和內(nèi)皮細(xì)胞增殖和功能的繼發(fā)改變。這些改變結(jié)合局部缺血共同損傷微血管壁并促進(jìn)過度的毛細(xì)血管透性，導(dǎo)致危脅視力的水腫(oedemas)、微動脈瘤(microaneurisms)和出血(Forrester等人，1997)。
有20到30年糖尿病史的病人的50到60％受到腎病影響。其被認(rèn)為是這些病人的主要死亡原因(Krolewski等人，1997)。該病理條件的主要特征之一是腎小球增大，其產(chǎn)生原因是基底膜增厚和由于生長停滯中的系膜細(xì)胞營養(yǎng)不足以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)積聚而產(chǎn)生的血管系膜擴(kuò)張。這些事件結(jié)合血流動力不足共同誘發(fā)腎小球硬化、腎小球濾過或改變的腎小球濾過水平和微量蛋白尿，導(dǎo)致嚴(yán)重的腎功能不全(Wolf等人，2000)。
通常通過檢查微量蛋白尿來評估糖尿病患者發(fā)展腎病的風(fēng)險。目前使用的延緩糖尿病腎病發(fā)生和/或發(fā)展的預(yù)防或治療手段包括監(jiān)測糖血、施用抗高血壓藥特別是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、采用低蛋白質(zhì)飲食或施用如他汀類(statins)的降血脂藥(Rippin等人，2004)。
由于其對公共健康和經(jīng)濟(jì)方面的影響，預(yù)防和治療糖尿病微血管并發(fā)癥的新方法的鑒定構(gòu)成主要的治療挑戰(zhàn)。
盡管對糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)還不完全理解，細(xì)胞增殖的調(diào)控和細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用的調(diào)控看似具有重要作用。已提出許多生化假說解釋糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)展，特別是糖化終產(chǎn)物(AGE)形成增多的機(jī)制(Singh等人，2001)。
還原糖，如蔗糖與蛋白質(zhì)的氨基基團(tuán)、脂質(zhì)和核酸經(jīng)由一系列形成希夫堿和阿馬道里(Amadori)產(chǎn)物的反應(yīng)發(fā)生非酶促反應(yīng)，最終產(chǎn)生AGE。取決于葡萄糖濃度的糖化作用在糖尿病中有所上升。該糖化作用更多的發(fā)生在暴露于血液葡萄糖的長壽蛋白質(zhì)，如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)或循環(huán)蛋白質(zhì)，從而改變它們的結(jié)構(gòu)和功能。
另外，AGE能夠結(jié)合膜受體通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激(Lal等人，2002；Schmidt等人，1994)、核因子κB的激活(Singh等人，2001；Schmidt等人，1994)和不同基因，如促炎癥細(xì)胞因子或黏著分子的表達(dá)(Hofmann等人，1999；Schmidt等人，1995)而引起細(xì)胞應(yīng)答。
所有這些改變具有重要的生物效應(yīng)，可以解釋在糖尿病微血管并發(fā)癥中觀察到的多種變化，特別是血管滲透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和剛性的增加、以及在細(xì)胞基質(zhì)相互作用和細(xì)胞生長的變化(Stitt等人，2003)。事實上，許多體內(nèi)和體外研究已表明AGE涉及與糖尿病相關(guān)的視網(wǎng)膜病變和腎病的發(fā)展(Stitt等人，2003；Wautier等人，2001)。
神經(jīng)節(jié)苷脂是集中在質(zhì)膜微域且特征為在其結(jié)構(gòu)中存在唾液酸的鞘糖脂。對乳糖苷神經(jīng)酰胺成功的唾液酸化產(chǎn)生單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂(GM3)、雙唾液神經(jīng)節(jié)苷脂(GD3)和三唾液神經(jīng)節(jié)苷脂(GT3)。這些神經(jīng)節(jié)苷脂繼而通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化的序列反應(yīng)轉(zhuǎn)化成更復(fù)雜的神經(jīng)節(jié)苷脂，分別形成a、b和c系列(Van Echten等人，1993)。已知神經(jīng)節(jié)苷脂通過與黏著受體，如整聯(lián)蛋白或基質(zhì)蛋白質(zhì)(膠原蛋白和纖連蛋白)或其它鞘糖脂相互作用在細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)識別中發(fā)揮主要作用。神經(jīng)節(jié)苷脂，特別是a系列的神經(jīng)節(jié)苷脂還通過調(diào)節(jié)不同生長因子的活性而參與調(diào)控細(xì)胞增殖(Hakomori等人，1990)。
已報道AGE在視網(wǎng)膜微血管的周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞引起鞘糖脂代謝的改變(Natalizio等人，2001)。這些改變特別伴隨著GM3合酶活性的增加(A.Daleme-Natalizio，doctoral thesis at the Institut National desSciences Appliquées de Lyon，8 February 2002)。
本發(fā)明人業(yè)已表明神經(jīng)節(jié)苷脂涉及AGE介導(dǎo)的導(dǎo)致病理條件DR和DN的效應(yīng)。發(fā)明人因而業(yè)已證明由AGE引起的對視網(wǎng)膜周細(xì)胞和腎系膜細(xì)胞增殖的抑制(兩種類型細(xì)胞分別涉及糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病)至少部分的基于GM3合酶活性的增加和系列a神經(jīng)節(jié)苷脂的累積。而且，在給予AGE的糖尿病小鼠模型觀察到GM3合酶活性的增加。這些結(jié)果確定GM3合酶和系列a神經(jīng)節(jié)苷脂作為治療糖尿病微血管并發(fā)癥的靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
定義“糖尿病的微血管并發(fā)癥”指特征為微血管結(jié)構(gòu)和功能變化的I型或II型糖尿病的慢性并發(fā)癥。這些并發(fā)癥主要包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和糖尿病神經(jīng)病。外周神經(jīng)病影響身體四肢的神經(jīng)，喪失足部感覺是其最普遍的形式。不適和疼痛(感覺異常和感覺過敏)也是該病非常普遍的且使人虛弱的癥狀。該神經(jīng)病可以導(dǎo)致足部潰瘍和嚴(yán)重的可能必須進(jìn)行切除的組織損傷。
在本專利申請的框架內(nèi)，“GM3合酶”指乳糖苷神經(jīng)酰胺α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.9)，該酶催化唾液酸殘基從唾液酸供體到唾液酸受體半乳糖殘基的3-羥基基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的，唾液酸供體是CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸和唾液酸受體是糖脂(如乳糖苷神經(jīng)酰胺(LacCer))的半乳糖殘基。催化反應(yīng)可以是CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸+β-D-半乳糖基-1，4-β-D-葡糖神經(jīng)酰胺＝Cmp+α-N-乙酰神經(jīng)氨酸基-2，3-β-D-半乳糖基-1，4-β-D-葡糖神經(jīng)酰胺。優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的GM3合酶是人GM3合酶或是如嚙齒類(如大鼠或小鼠)、貓、犬、靈長類(猴)等非人哺乳動物的GM3合酶。例如，編碼人和鼠的GM3合酶的基因已被分別置于Genbank數(shù)據(jù)庫登錄號NM 003896(SEQ ID NO1)和NM 011375(SEQ ID NO3)之下。對應(yīng)的氨基酸序列分別描述于序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO4。
在本專利申請的框架內(nèi)，“GM3合酶抑制劑”指化合物，其(i)在體外和/或體內(nèi)抑制GM3合酶的活性和/或表達(dá)；和/或(ii)阻斷唾液酸殘基從唾液酸供體到唾液酸受體半乳糖殘基的3-羥基基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，特別阻止形成神經(jīng)節(jié)苷脂GM3；和/或(iii)阻斷神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的細(xì)胞內(nèi)合成。抑制或阻止可以是局部的或整體的。
“神經(jīng)節(jié)苷脂”被理解為指包含一個或多個唾液酸殘基的鞘糖脂。更具體而言，“系列a神經(jīng)節(jié)苷脂”指在乳糖苷神經(jīng)酰胺的半乳糖僅有一個唾液酸殘基的神經(jīng)節(jié)苷脂。系列a神經(jīng)節(jié)苷脂包括化合物GM3(α-N-乙酰神經(jīng)氨酸基-2，3-β-D-半乳糖基-1，4-β-D-葡糖神經(jīng)酰胺)、GM2、GM1、GD1a和GT1a(參見圖2)。
治療應(yīng)用本發(fā)明人已證明涉及糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)展的提高的糖化終產(chǎn)物(AGE)是通過GM3合酶活性的增加來介導(dǎo)其影響。
因此本發(fā)明提出治療糖尿病微血管并發(fā)癥的方法，其中施用GM3合酶基因的表達(dá)或活性的抑制劑于患者。
本發(fā)明還涉及GM3合酶基因表達(dá)或活性的抑制劑用于制備治療糖尿病微血管并發(fā)癥的藥物的用途。
優(yōu)選的，糖尿病微血管并發(fā)癥選自糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和糖尿病神經(jīng)病。特別優(yōu)選的，糖尿病微血管并發(fā)癥是糖尿病腎病。
在本發(fā)明的框架內(nèi)，“處理”指疾病的預(yù)防或治療性處理，即對疾病或與該疾病相連系的一種或多種并發(fā)癥所采取的逆轉(zhuǎn)、減慢或抑制其進(jìn)展或阻止其發(fā)展的行為。
“患者”指人或非人哺乳動物，如小鼠、大鼠、狗、貓、豬或猴，其受到或易于受到糖尿病微血管并發(fā)癥的侵襲。優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的患者是已檢測出糖尿病的受試者。
優(yōu)選的，抑制劑是GM3合酶基因的表達(dá)或活性的特異性抑制劑，即對除GM3合酶之外的基因或蛋白質(zhì)基本沒有影響的抑制劑。
在第一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法或用途使用GM3合酶基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)的抑制劑。該抑制劑可以阻止或抑制基因的轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)錄信使(mRNA)的翻譯。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以針對此目的選擇最適合的策略。
可以使用反義策略抑制GM3合酶的表達(dá)。該方法可以使用如反義核酸或核酶，其通過反義核酸掩蔽mRNA或通過核酶切割mRNA來阻斷特定mRNA轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明文中，“反義”廣泛包括RNA-RNA相互作用、RNA-DNA相互作用、核酶、干擾RNA、適體和RNA酶H介導(dǎo)的抑制。反義療法通常使用載體，如帶有反義序列的病毒載體，由于該載體將整合入基因組，所以該抑制通常是穩(wěn)定的。還可能使用暫時抑制表達(dá)的反義寡核苷酸。反義技術(shù)的概述可見于《Antisense DNA and RNA》中(ColdSpring Harbor Laboratory，D.Melton，編輯，1988)。
由此優(yōu)選的GM3合酶基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)抑制劑選自反義核酸、核酶、干擾RNA和適體。
“反義核酸”或“反義寡核苷酸”是單鏈核酸分子，其在胞質(zhì)條件下與互補(bǔ)DNA或RNA分子雜交時，抑制后者功能?？梢杂稍诩?xì)胞中表達(dá)的重組基因編碼反義核酸(參見，例如，US專利No.5814500和5811234)，或可以通過合成制備反義核酸(參見，例如US專利No.5780607)。可以設(shè)計GM3合酶的反義核酸與編碼GM3合酶的同源序列特異性雜交，如與SEQ ID NO1所示的人GM3合酶序列或SEQ ID NO3所示的鼠GM3合酶序列特異性雜交。
“能夠與核酸序列特異性雜交的序列”指能夠與參考核酸序列在高度嚴(yán)格條件下雜交的序列(Sambrook等人，1989)。定義嚴(yán)格條件的參數(shù)決定于50％的匹配鏈分離的溫度(Tm)和離子強(qiáng)度。對于包含了多于30個堿基的序列，通過以下公式定義TmTm＝81.5+0.41(％G+C)+16.6log(陽離子濃度)-0.63(％甲酰胺)-(600/堿基數(shù))(Sambrook等人，1989)。對于短于30個堿基的序列，通過以下公式定義TmTm＝4(G+C)+2(A+T)。在非特異性序列不雜交的適當(dāng)嚴(yán)格條件下，可以優(yōu)選低于Tm5到10℃的雜交溫度并優(yōu)選使用高離子強(qiáng)度的雜交緩沖液，如6×SSC溶液。例如，對應(yīng)于Tm和離子條件的高度嚴(yán)格雜交條件，如使用含有50％甲酰胺溶液和5×或6×SSC(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)所得到的高度嚴(yán)格雜交條件。
根據(jù)本發(fā)明的反義核酸可以被如此使用，例如注射如人或動物以預(yù)防或治療糖尿病微血管并發(fā)癥。具體而言，根據(jù)描述于國際專利申請WO90/11092的技術(shù)可以以裸DNA形式注射反義核酸。還可以通過與如葡聚糖-DEAE(Pagano等人，1967)、核蛋白質(zhì)(Kaneda等人，1989)或脂質(zhì)(Felgner等人，1987)形成復(fù)合物的形式、通過脂質(zhì)體的形式(Fraley等人，1980)或通過其它相似的方法施用反義核酸。
優(yōu)選核酸序列構(gòu)成載體的部分。使用載體可能提高核酸向代處理細(xì)胞的施用，還可能提高核酸在這些細(xì)胞中的穩(wěn)定性，提供延長的治療效果。
術(shù)語“載體”指DNA或RNA序列可以經(jīng)由其導(dǎo)入宿主細(xì)胞以轉(zhuǎn)化宿主并獲得表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄和翻譯)的載體。載體包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。
“核酶”是能夠以相當(dāng)類似于DNA限制性核酸內(nèi)切酶的方式特異性切割其它單鏈RNA分子的RNA分子。核酶是通過證明某些mRNA能夠切割它們自己的內(nèi)含子而被發(fā)現(xiàn)。通過改變這些核酶的核苷酸序列，可能產(chǎn)生識別RNA分子中特定的核苷酸序列并對其切割的分子(Cech，1989)。由于這一特異性，僅失活具有特定序列的mRNA。
還可以使用干擾RNA獲得對GM3合酶轉(zhuǎn)錄的可逆抑制。RNA干擾(RNAi)技術(shù)通過使用小RNA分子，如“小干擾RNA”(siRNA)阻止基因表達(dá)。該技術(shù)受益于RNA干擾是從植物到昆蟲乃至哺乳動物的多種生物的多數(shù)細(xì)胞中天然的基因滅絕的生物機(jī)制這一事實(Sharp，2001)。RNA干擾通過破壞中間mRNA來阻止基因產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)(Bass，2000；Sharp，2001)?？梢砸月懵兜男问交蛲ㄟ^整合入載體使用siRNA。優(yōu)選阻斷GM3合酶轉(zhuǎn)錄的干擾RNA能夠有序列GGGUUAUUCUGAACAUGUUtt(SEQ ID NO5)。
還可以使用適體抑制GM3合酶轉(zhuǎn)錄。適體是能夠以高度的親和力和特異性識別幾乎任何類型靶分子的寡核苷酸序列?？梢允褂帽环Q為SELEX(指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化)的篩選方法從隨機(jī)序列文庫中分離這些配體，該方法描述于Tuerk和Gold(1990)。可以使用組合化學(xué)的手段通過DNA合成獲得隨機(jī)序列文庫。在這種文庫中，每個成員是對應(yīng)于唯一序列的線性寡聚體(任選為經(jīng)化學(xué)修飾的)。這類分子的可能的修飾、應(yīng)用和優(yōu)勢已由Jayasena作了綜述(1999)。
在另一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法或用途包括使用GM3合酶蛋白質(zhì)活性的抑制劑。可以使用如本專利申請所述的篩選方法(包括細(xì)胞或體外生化測試)方便的鑒定GM3合酶活性的抑制劑。抑制劑可以是肽、擬肽或非肽模擬物(Rubin-Carrez，2000)，如能夠干擾GM3合酶活性的小有機(jī)分子，例如通過阻止或降低唾液酸基團(tuán)從供體到唾液酸受體的轉(zhuǎn)移，和/或通過阻斷或降低GM3合成。
GM3合酶抑制劑還可以是抗體，特別是針對序列SEQ ID NO2所示的人GM3合酶或序列SEQ ID NO4所示的鼠GM3合酶的抗體。上述抗體可以是多克隆或單克隆抗體或其片段、或嵌合抗體，特別是人源化的或免疫綴合的抗體。
可以通過慣用方法從用蛋白質(zhì)免疫的動物血清中獲得多克隆抗體。例如，所用抗原可以是合適的肽復(fù)合物，如GM3合酶通過反應(yīng)殘基與蛋白質(zhì)(如匙孔槭血藍(lán)蛋白，KLH)或另一肽偶聯(lián)的復(fù)合物。根據(jù)Benoit等人所述方法(1982)，用等量的1mg的肽抗原免疫兔子。每隔四周用200μg抗原注射動物，并在其后10到14天取血。第三次注射后，對抗血清進(jìn)行檢測以測定其結(jié)合用氯胺-T方法制備的碘-放射標(biāo)記的肽抗原的能力，和隨后將抗血清通過羧甲基纖維素(CMC)離子交換柱以層析法純化。接著從哺乳動物收集抗體分子和通過技術(shù)人員熟知的方法分離抗體至想要的濃度，例如通過使用DEAE交聯(lián)葡聚糖獲得IgG級份。為了增加多克隆血清的特異性，可以通過免疫親和層析法，在固相使用免疫多肽純化抗體。令抗體與固相的免疫抗原接觸足夠的時間使多肽和抗體分子發(fā)生免疫反應(yīng)從而在固相形成免疫復(fù)合物。
可以通過由Khler和Milstein所述(1975)的常規(guī)的淋巴細(xì)胞融合和雜交瘤培養(yǎng)方法獲得單克隆抗體。其它制備單克隆抗體的方法也為人所知(Harlow等人，1988)?？梢酝ㄟ^免疫哺乳動物(例如小鼠、大鼠或兔子，或甚至人等)和使用淋巴細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生雜交瘤(Khler和Milstein，1975)來制備單克隆抗體。存在該慣用技術(shù)的備選技術(shù)。例如可能通過表達(dá)克隆自雜交瘤的核酸產(chǎn)生單克隆抗體。還可以在載體中導(dǎo)入抗體cDNA通過噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生抗體，該載體通常是在噬茵體表面具有V基因文庫的絲狀噬菌體(如用于大腸桿菌的fUSE5，Scott和Smith，1990)。構(gòu)建這些抗體文庫的方法描述于Marks等人(1991)。
本發(fā)明的抗體或抗體片段可以是如嵌合抗體、人源化抗體或Fab和F(ab’)2片段。也可以采用免疫綴合或標(biāo)記的抗體形式。
適體構(gòu)成在分子識別方面代表替代抗體的一類分子。
可以使用一種或多種可藥用賦形劑制備GM3合酶的表達(dá)或活性抑制劑。如前所述，這些抑制劑可以是化學(xué)合成的化合物、反義或干擾RNA或抗GM3合酶抗體。
“賦形劑”或“可藥用載體”被理解為指在人或動物中不產(chǎn)生次級反應(yīng)，例如變態(tài)反應(yīng)的任何溶劑、分散介質(zhì)、吸收阻滯劑等。
劑量自然的取決于所討論的活性物質(zhì)、施用方式、治療指征和患者的年齡及狀態(tài)。優(yōu)選蛋白質(zhì)或抗體的劑量為每天0.1到250mg/kg和特別優(yōu)選每天1到100mg/kg。當(dāng)藥物組合物包括核酸時，施用核酸(序列或載體)的劑量也要特別適應(yīng)于施用方式、靶標(biāo)病理條件和治療持續(xù)時間。一般而言，如果使用重組病毒，以約為104到1014pfu/ml和優(yōu)選106到1010pfu/ml的劑量配制和施用。術(shù)語“pfu”(蝕斑形成單位)反映病毒溶液的感染性，并能夠通過感染合適的細(xì)胞培養(yǎng)物以及測量被感染細(xì)胞的蝕斑數(shù)(通常在48小時后)來確定。用于確定病毒溶液pfu滴度的技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。
如果設(shè)想腸胃外施用，更具體的采用注射，本發(fā)明的組合物包括采用可注射的溶液和懸浮液劑型包裝于安瓿或用于緩慢灌注的瓶子的活性成分。
對于口服施用的情況，本發(fā)明的組合物采用的劑型包括明膠膠囊、起泡片劑、有包衣或無包衣的片劑、香囊(sachet)、糖衣丸、口服的安瓿劑或溶液、微?；蚓忈寗┬?。
以常規(guī)方法將活性成分與緩沖液、穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑和懸浮劑混合得到腸胃外施用的劑型。隨后將這些混合物使用已知技術(shù)滅菌后以靜脈注射的劑型包裝。
技術(shù)人員使用的緩沖液可以是基于有機(jī)磷酸鹽的緩沖液。
懸浮劑的實例包括甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、金合歡和羧甲基纖維素鈉。
此外，根據(jù)本發(fā)明使用的穩(wěn)定劑是亞硫酸鈉和偏亞硫酸氫鈉，而提到的防腐劑可以是對羥基苯甲酸鈉、山梨酸、甲酚和氯甲酚。為了制備口服溶液或懸浮液，將活性成分溶解或懸浮于含有分散劑、濕潤劑、懸浮劑(如聚乙烯吡咯烷酮)、防腐劑(如對羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙酯)、矯味劑或著色劑的合適載體。
為了制備微囊，將活性成分與合適的稀釋劑、合適的穩(wěn)定劑、活性物的緩釋劑、或用于形成核心的任何其它類型的添加劑混合，隨后將其用合適的聚合物(如水溶的樹脂或不溶于水的樹脂)包被。為此目的使用技術(shù)人員所熟知的技術(shù)。
任選的，產(chǎn)生的微囊隨后被配制成合適的劑量單位。
還可以設(shè)想經(jīng)眼途徑施用藥物。
如果是經(jīng)眼給藥，本發(fā)明的藥物組合物采用局部施用于眼的眼組合物劑型，例如眼洗劑或眼霜。
抑制劑還可以配制成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是由磷脂形成，磷脂分散于水介質(zhì)且能自發(fā)形成多層同心雙分子層小泡。這些小泡通常直徑為25nm到4μm，可以被超聲形成直徑為200到500中心含有水溶液的更小的單層小泡。
在施用活性成分于明確的細(xì)胞或組織靶標(biāo)時使用脂質(zhì)體特別有利?？梢酝ㄟ^使脂質(zhì)體與尋靶分子(如尋靶肽，例如激素)、或抗體化學(xué)偶聯(lián)而實現(xiàn)篩選方法本發(fā)明還涉及篩選或鑒定用于治療和/或預(yù)防糖尿病微血管并發(fā)癥的化合物的體外方法，其中評估至少一種測試化合物抑制GM3合酶活性的能力，該酶活性水平的下降是化合物有效治療和/或預(yù)防糖尿病微血管并發(fā)癥的指征。
優(yōu)選糖尿病微血管并發(fā)癥選自糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和糖尿病神經(jīng)病。更優(yōu)選糖尿病微血管并發(fā)癥是糖尿病腎病。
測試化合物可以是任何類型。其可以是天然或合成的化合物或這些化合物的混合物。還可以是結(jié)構(gòu)被詳細(xì)定義的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)未知的物質(zhì)，例如生物提取物。
可以將存在測試化合物時GM3合酶活性水平與缺乏測試化合物時的對照活性水平比較。
在第一個實施方案中，篩選方法所包括由以下組成的步驟將至少一種測試化合物與表達(dá)GM3合酶的細(xì)胞接觸，并測定所述化合物抑制(即阻止或減少)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)節(jié)苷脂GM3合成的能力。與未暴露于測試化合物的細(xì)胞相比，細(xì)胞中神經(jīng)節(jié)苷脂GM3合成水平的下降是化合物有效治療和/或預(yù)防糖尿病微血管并發(fā)癥的指征。
細(xì)胞可以是內(nèi)源性表達(dá)GM3合酶的細(xì)胞，例如視網(wǎng)膜周細(xì)胞或腎系膜細(xì)胞。細(xì)胞還可以是經(jīng)過轉(zhuǎn)染借助于表達(dá)GM3合酶基因產(chǎn)物的載體以暫時或穩(wěn)定的方式表達(dá)GM3合酶的細(xì)胞。可以通過向原核或真核宿主細(xì)胞導(dǎo)入插入于載體上且含有編碼GM3合酶序列的核苷酸序列而獲得這些細(xì)胞，隨后在允許所轉(zhuǎn)染的核苷酸序列復(fù)制和/或表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞。
可以用技術(shù)人員熟悉的任何技術(shù)將含有編碼GM3合酶序列的DNA載體，例如質(zhì)粒載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。具體而言，可以用裸露的形式，即沒有借助任何類型的促進(jìn)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的媒介物或系統(tǒng)(EP 465 529)導(dǎo)入DNA載體。其它可用的技術(shù)有微量注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀或借助于納米膠囊或脂質(zhì)體的制劑。生物可降解的聚烷基氰基丙烯酸酯納米膠囊是特別有用的。對于脂質(zhì)體的情況，使用陽離子脂質(zhì)有利于帶負(fù)電荷的核酸的包裝，和促進(jìn)與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜的融合。
備選的，載體可以是重組病毒的形式，該重組病毒包括插入其基因組的編碼GM3合酶的核酸序列。優(yōu)選的，病毒載體選自腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是慢病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、痘苗病毒等。
技術(shù)人員熟知如何實施這些重組表達(dá)技術(shù)。
宿主細(xì)胞的實例特別包括哺乳動物細(xì)胞(如CHO、COS-7、293和MDCK細(xì)胞)、昆蟲細(xì)胞(如SF9細(xì)胞)、細(xì)菌(如大腸桿菌)和酵母菌株。
可以直接或通過如報告基因檢測基因的轉(zhuǎn)錄水平或GM3合酶基因編碼蛋白質(zhì)的翻譯水平，從而評估表達(dá)水平。
跟蹤靶基因(本例為GM3合酶基因)或報告基因轉(zhuǎn)錄(即檢測轉(zhuǎn)錄水平)的最常用的測試是基于Northern印跡技術(shù)。跟蹤GM3合酶蛋白質(zhì)或報告蛋白質(zhì)的翻譯(即檢測翻譯水平)的測試可以特別基于免疫測定技術(shù)或者可以使用熒光、發(fā)光或其它檢測報告蛋白質(zhì)(綠色熒光蛋白，GFP；熒光素酶；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，CAT；等)的技術(shù)。
可以根據(jù)多種技術(shù)人員熟知的形式(例如通過ELISA、放射免疫測定、原位免疫測定、Western印跡、免疫熒光等)實行免疫測定技術(shù)?？梢园凑杖缦旅枋錾a(chǎn)用于檢測GM3合酶蛋白質(zhì)的抗GM3合酶蛋白質(zhì)的抗體。
在另一實施方案中，篩選方式包括的步驟組成為將至少一種測試化合物與天然、突變或重組的GM3合酶或生物來源的GM3合酶接觸，并測定所述化合物抑制(即阻止或減少)唾液酸殘基從唾液酸供體轉(zhuǎn)移到唾液酸受體半乳糖殘基的3-羥基基團(tuán)的能力。與缺乏所述化合物時的唾液酸轉(zhuǎn)移水平相比，存在所述化合物時唾液酸轉(zhuǎn)移活性水平的下降是抑制GM3合酶和有效治療和/或預(yù)防糖尿病的微血管并發(fā)癥的化合物的指征。
可以通過在允許唾液酸從供體轉(zhuǎn)移至受體的合適條件下使GM3合酶與唾液酸供體和唾液酸受體接觸來方便的評估GM3合酶的活性水平。一般而言，合適條件指催化反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)介質(zhì)。該介質(zhì)可以包括如緩沖液、氧化和/或還原劑和輔助因子。通常調(diào)整pH、溫度和介質(zhì)的離子濃度。優(yōu)選在pH緩沖范圍為6到7并優(yōu)選6.5到6.7之間的介質(zhì)中，在35到39℃并優(yōu)選在37℃的溫度下評估GM3合酶活性。含有10mM Mn2+，例如10mM MnCl2的介質(zhì)有利于反應(yīng)的進(jìn)行。GM3合酶測試已被特別描述于國際專利申請WO 97/47749，US專利6555371或Wakarchuk等人的文獻(xiàn)(1996)。
優(yōu)選的，通過定量唾液酸的轉(zhuǎn)移(即唾液酸從唾液酸供體，如CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸到乳糖苷神經(jīng)酰胺(LacCer)半乳糖殘基的3-羥基基團(tuán)以形成神經(jīng)節(jié)苷脂GM3)評估GM3合酶活性。在CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸和/或乳糖苷神經(jīng)酰胺的消失和/或GM3的形成方面的減少是抑制GM3合酶的化合物的指征。因此根據(jù)本發(fā)明的方法，包括在存在或缺乏測試化合物條件下測定從CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸到乳糖苷神經(jīng)酰胺的唾液酸轉(zhuǎn)移水平。
以可檢測的方式標(biāo)記唾液酸供體和/或受體是有利的。可以使用技術(shù)人員所熟知的任何合適的技術(shù)實現(xiàn)標(biāo)記。其可以是如放射性、酶促、發(fā)光或熒光標(biāo)記或這些技術(shù)的組合。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的篩選測試描述于圖7。在此測試中，將GM3合酶和[14C]-CMP-唾液酸以及偶聯(lián)了生物素的乳糖苷神經(jīng)酰胺接觸。SPA技術(shù)(Amersham Biosciences)是基于某些放射性元素分裂產(chǎn)生的β粒子的發(fā)射。如果放射性分子充分接進(jìn)SPA閃爍珠，放射性分裂刺激微粒中閃爍體的基團(tuán)產(chǎn)生光發(fā)射?？梢杂瞄W爍計數(shù)和/或CCD成像儀檢測信號。另一方面，在含有SPA珠的溶液中游離的放射性分子情況下(即放射性分子不與SPA珠相互作用)，伴隨著放射性分子分裂的β發(fā)射沒有足夠能量到達(dá)SPA珠，并且不產(chǎn)生光發(fā)射。在本測試中，由于在反應(yīng)介質(zhì)中只有該化合物經(jīng)由生物素/鏈霉抗生物素復(fù)合物與SPA珠相連且?guī)в蟹派湫酝僖核峄鶊F(tuán)，因此發(fā)光信號的測量反映GM3的量。
下面的實施例和附圖意在說明而非限制本發(fā)明。
附1顯示AGE對周細(xì)胞(BRP)和腎系膜細(xì)胞(RMC)增殖的抑制。細(xì)胞暴露于3μM BSA或AGE 4天(RMC)或7天(BRP)。隨后用胰蛋白酶消化細(xì)胞并用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)，并確定蛋白質(zhì)的總量。結(jié)果用BSA對照的百分?jǐn)?shù)表示，并代表6次(BRP)或9次(RMC)獨立試驗的平均數(shù)±SEM，每次試驗一試兩份。針對BSA對照*P＜0.05。
圖2顯示基于van Echten等人發(fā)表文獻(xiàn)(1993)修改的神經(jīng)節(jié)苷脂生物合成途徑。在BRP和RMC(周圍的神經(jīng)節(jié)苷脂)僅系列a和b神經(jīng)節(jié)苷脂被檢測。
圖3表明周細(xì)胞和系膜細(xì)胞中的神經(jīng)節(jié)苷脂譜的調(diào)節(jié)。周細(xì)胞(A)或系膜細(xì)胞(B)分別暴露于3μM BSA或AGE4或7天，隨后收獲細(xì)胞。使用HPTLC提取、純化分析神經(jīng)節(jié)苷脂，使用間苯二酚染色顯影，方法如“材料和方法”部分所述。結(jié)果以BSA對照的百分?jǐn)?shù)表示并代表6次(BRP)或9次(RMC)獨立試驗的平均數(shù)±SEM，每次試驗一試兩份。針對BSA對照*P＜0.05。在(C)和(D)，用1μCi/ml的[14C]-半乳糖代謝標(biāo)記神經(jīng)節(jié)苷脂，使用HPTLC提取、分離神經(jīng)節(jié)苷脂，并使用放射自顯影分析。結(jié)果以BSA對照的百分?jǐn)?shù)表示，并代表3次獨立試驗的平均數(shù)±SEM。
圖4顯示在分離的神經(jīng)纖維球和細(xì)胞中由AGE造成的GM3合酶活性的增加。(A)用3μM BSA或AGE處理細(xì)胞4天(RMC)或7天(BRP)。在細(xì)胞勻漿中檢測GM3合酶活性，方法如“材料和方法”部分所述。在BRP和RMC中對照活性分別是2.7和5.1pmol/h/mg蛋白質(zhì)。結(jié)果以BSA對照的百分?jǐn)?shù)表示，并代表4或5次獨立試驗的平均數(shù)±SEM。(B)在對照小鼠(db/m)和db/db小鼠神經(jīng)纖維球的高度純化的勻漿中測量GM3合酶活性。對照活性是4.7pmol/h/mg蛋白質(zhì)。結(jié)果以對照的百分?jǐn)?shù)表示，并代表4到5只動物的平均數(shù)±SEM。針對BSA對照或?qū)φ招∈螅?P＜0.05。
圖5表明外源的系列a神經(jīng)節(jié)苷脂造成的對細(xì)胞增殖的抑制。用神經(jīng)節(jié)苷脂-BSA復(fù)合物分別處理周細(xì)胞(A)或系膜細(xì)胞(B)4或7天。處理結(jié)束時測量總蛋白質(zhì)。結(jié)果以BSA對照的百分?jǐn)?shù)表示，并代表5到6次獨立試驗的平均數(shù)±SEM，每次試驗一試三份。針對BSA對照*P＜0.05。
圖6顯示抗系列a神經(jīng)節(jié)苷脂的GM2和GM1抗體針對AGE效果的保護(hù)作用。在存在或缺乏每孔5μg的抗GM2或抗GM1多克隆抗體條件下，用3μM BSA或AGE處理周細(xì)胞(A)或系膜細(xì)胞(B)。處理結(jié)束后洗滌細(xì)胞并裂解，測量蛋白質(zhì)的總量。結(jié)果以BSA對照的百分?jǐn)?shù)表示，并代表5到6次獨立試驗的平均數(shù)±SEM，每次試驗一試三份。針對AGE處理的細(xì)胞*P＜0.05。
圖7表明通過一種測試來檢測GM3合酶活性，所述測試通過閃爍照像和發(fā)光組合檢測反應(yīng)產(chǎn)物——神經(jīng)節(jié)苷脂。GM3合酶催化標(biāo)記的唾液酸從[14C]-CMP-唾液酸到偶聯(lián)生物素的乳糖苷神經(jīng)酰胺(生物素-LacCer)的轉(zhuǎn)移。將偶聯(lián)鏈霉抗生物素的SPA(親近閃爍測定法，AmershamBioscience)珠與產(chǎn)生的偶聯(lián)生物素并用14C標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)苷脂GM3接觸。隨后測量由GM3放射活性和SPA珠相互作用產(chǎn)生的SPA信號。
圖8顯示用GM3合酶siRNA轉(zhuǎn)染保護(hù)RMC。用400nM GM3合酶siRNA轉(zhuǎn)染RMC24小時后，用3μM BSA對照或AGE處理細(xì)胞。處理結(jié)束時測量總蛋白質(zhì)。結(jié)果以BSA對照的百分?jǐn)?shù)表示，并代表6次獨立試驗的平均數(shù)±SEM。針對AGE處理的細(xì)胞*P＜0.05。
圖9表明在糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中GM3和GD3合酶活性以及GM3水平有所改變。測量對照小鼠(db/m)和糖尿病小鼠(db/db)腎皮質(zhì)勻漿中的GM3合酶活性(A)和GD3合酶活性(B)。顯示對照小鼠(db/m)和糖尿病小鼠(db/db)的GM3水平(C)。對照小鼠的GM3水平為66±9ng/ml蛋白質(zhì)。結(jié)果以BSA對照的百分?jǐn)?shù)表示，并代表4到6只動物的平均數(shù)±SEM。針對AGE處理的細(xì)胞*P＜0.05。
實施例實施例1-材料和方法細(xì)胞分離和培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜周細(xì)胞(BRP)分離自牛視網(wǎng)膜微血管，方法如先前所述(Lecomte等人，1996)。簡言之，通過對從當(dāng)?shù)赝涝讏龅玫降恼呐Ｑ墼跓o菌條件下解剖獲得視網(wǎng)膜。在去除污染的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后，將視網(wǎng)膜(每個培養(yǎng)皿2個)切成小片并用Dounce勻漿機(jī)在Hanks平衡鹽溶液(無Ca2+/Mg2+的氧化HBSS，補(bǔ)充以Hepes 10mM，pH7.4、抗生素1％、牛血清白蛋白(BSA，Sigma，Saint-Quentin Fallavier，法國)0.5％)中勻漿化。勻漿物在1000g于4℃離心5分鐘，殘余物重懸于含有膠原酶/分散酶(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)(1mg/ml在無Ca2+/Mg2+的氧化HBSS，Hepes 10mM，pH7.4、抗生素1％、DNA酶20U/ml和Nα-甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮(TLCK)150ng/ml，Sigma)的酶促溶液。消化(20分鐘于37℃)后，將微血管碎片置于40μm尼龍濾膜上，并保存(deposited)在纖連蛋白覆蓋的6厘米皿中。原代培養(yǎng)物培養(yǎng)在補(bǔ)充10％的胎牛血清(Gibco，Invitrogen公司，N.Y.，美國)、1％的谷氨酰胺和1％的青霉素/鏈霉素(Sigma)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle’s培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)基每兩天更換一次。細(xì)胞貼壁后，在48小時后出現(xiàn)來自微血管的周細(xì)胞小瘤，細(xì)胞在約10天達(dá)到匯合。由其帶有偽足的不規(guī)則多邊形形態(tài)和生長成為非并生細(xì)胞(non-apposed cell)的特征以及通過α1-肌動蛋白和特異性的糖脂抗原(3G5抗體)的陽性標(biāo)記和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的馮維勒布蘭德因子的陰性標(biāo)記(Lecomte等人，1996)所進(jìn)行的評估均證明BRP培養(yǎng)物是100％純的。細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA(Sigma)(1∶3)傳代，培養(yǎng)物被維持于相同的培養(yǎng)基直到第二代，在第二代處理BRP。
從年輕雄性Wistar大鼠(Charles River，I′Arbresle，法國)的純化的神經(jīng)纖維球獲得大鼠腎系膜細(xì)胞(RMC)。簡言之，在無菌條件下從新摘除的大鼠腎分離皮質(zhì)碎片。以機(jī)械力使HBSS緩沖液中的小碎片通過230μm篩孔。隨后向通過此篩孔的神經(jīng)纖維球施加壓力使其通過73.7μm篩孔。最后將其置于70μm篩孔上并放置于纖連蛋白覆蓋的6厘米皿中(每兩個腎神經(jīng)纖維球用4個皿)，皿內(nèi)的DMEM中補(bǔ)充20％的胎牛血清、1％的谷氨酰胺和1％的青霉素/鏈霉素培養(yǎng)。貼壁后，3周之后出現(xiàn)來自神經(jīng)纖維球的RMC小瘤，隨后對細(xì)胞進(jìn)行第5次傳代以去除殘余的上皮和內(nèi)皮細(xì)胞。RMC的特征在于其形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(星形，匯合時呈燈芯形)和波形蛋白、平滑肌α-肌動蛋白和Thy-1抗原的陽性標(biāo)記。隨后在補(bǔ)充了15％的胎牛血清、1％的谷氨酰胺和1％的青霉素/鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞。使用在第5代和15代之間的細(xì)胞。
小鼠神經(jīng)纖維球的分離使用如Takemoto等人所述的(Takemoto等人，2002)磁珠灌流技術(shù)從糖尿病(db/db)或?qū)φ?db/m)的11周齡小鼠(Charles River)獲得高度純化的神經(jīng)纖維球。簡言之，用Dynabeads溶液(Dynal，Compiègne，法國)經(jīng)心臟灌流小鼠，隨后取出腎，細(xì)細(xì)切片并用膠原酶(Roche Diagnostics)消化。過濾后，在其毛細(xì)血管中積累了磁珠的神經(jīng)纖維球由于磁力被保留，隨后在勻漿前洗滌兩次。該技術(shù)提供了低程度組織污染的神經(jīng)纖維球的純制品。
小鼠腎皮質(zhì)的分離從糖尿病(db/db)或?qū)φ?db/m)的11周齡小鼠(Charles River)腎分離腎皮質(zhì)碎片。簡言之，麻醉并處死動物，取出腎。隨后通過解剖和用Dounce勻漿機(jī)在含有1mM EDTA和10μl/ml蛋白酶抑制劑的25mMHepes緩沖液中機(jī)械勻漿獲得腎皮質(zhì)碎片。
AGE的制備將牛血清白蛋白(終濃度7.2mg/ml)(Sigma)和100mM甲基乙二醛(Sigma)在37℃孵育50小時制備AGE。在不合甲基乙二醛的相同條件下孵育牛血清白蛋白(BSA)并用作對照制品(BSA對照)。用PD10交聯(lián)葡聚糖G25柱(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)純化AGE和BSA對照以去除鹽和未反應(yīng)的羰基，隨后通過過濾滅菌并保存在-20℃直到使用。
AGE處理在接種24小時后將AGE和BSA對照(終濃度3μM)加入培養(yǎng)基。每種細(xì)胞類型處理一代(BRP約7天和RMC約4天)。每兩天更換新鮮培養(yǎng)基。
細(xì)胞生長的測量處理結(jié)束時，用胰蛋白酶收獲細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液(冰過的PBS)(Sigma)洗滌細(xì)胞殘余物兩次。對于每種樣品，使用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)一整分試樣以確定細(xì)胞數(shù)。另一整分試樣用于使用Bradford技術(shù)進(jìn)行的蛋白質(zhì)測量。
神經(jīng)節(jié)苷脂的分析為了代謝標(biāo)記神經(jīng)節(jié)苷脂，將0.2μCi/ml或1μCi/ml的[14C(U)]-D-半乳糖(329.5mCi/mmo1)(PerkinElmer Life Sciences，波士頓，MA)加入培養(yǎng)基過夜用于具有高度比活性的標(biāo)記試驗(GM2和GM1測量試驗)。隨后用胰蛋白酶消化細(xì)胞(5-8×105個周細(xì)胞或12-20×105個系膜細(xì)胞)，PBS洗滌細(xì)胞3次。按照由Bouchon等人所述(Bouchon等人，1990)Natalizio等人修改(Natalizio等人，2002)的方法從細(xì)胞殘余物中提取神經(jīng)節(jié)苷脂。簡言之，將細(xì)胞殘余物分散在2ml的氯仿(C)/甲醇(M)(1∶1，v/v)，劇烈混合并于4℃抽提過夜。離心后，用同樣的2ml溶劑抽提細(xì)胞殘余物兩次。合并總脂質(zhì)的抽提物，真空干燥并借助1mM C/M/PBS溶液(10∶10∶7，v/v/v)分離。隨后，含有神經(jīng)節(jié)苷脂的上層相在C18硅膠柱(Waters Corporation，Milford，MA)上脫鹽，并用HPTLC分析(Merck，Darmstadt，德國)。在0.2％C/M/CaCl2(55∶45∶10，v/v/v)的流動相中展開板。使用磷掃描和Storm 820(MolecularDynamics，Amersham Pharmacia Biotech，皮斯卡塔韋，美國)通過放射自顯影方法和使用Image Master VDS-CL(Amersham PharmaciaBiotech)通過間苯二酚(神經(jīng)節(jié)苷脂的特異性染色間苯二酚0.3％(Sigma)、CuSO40.03％、HCl 30％)標(biāo)記方法顯現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂。使用Image Quant(Molecular Dynamics)進(jìn)行定量。由于在BRP和RMC的神經(jīng)節(jié)苷脂譜中均缺乏GT1b，在脂質(zhì)抽提前將其加入樣品作為內(nèi)標(biāo)。
GM3合酶活性的測量處理結(jié)束時用PBS洗滌細(xì)胞，而后在50μl裂解緩沖液(20mM二甲胂酸鈉，pH6.6(Sigma)、0.2％的Triton X-100、1mM EDTA、10μl/ml的蛋白酶抑制劑(Calbiochem，La Jolla，加利福尼亞，美國))中于4℃孵育20分鐘，隨后刮下細(xì)胞并收集。合并4盤BRP(約2-3×106個細(xì)胞)和3盤RMC(約3-6×106個細(xì)胞)。細(xì)胞裂解液在10000g離心5分鐘，測量上清液中蛋白質(zhì)的GM3合酶活性。在含有1mM EDTA和10μl/ml蛋白酶抑制劑的25mM Hepes中使用注射器對腎小球殘余物機(jī)械勻漿。所得勻漿在1000g離心2分鐘，測量核后上清液中的GM3合酶活性。使用每份樣品的等量的蛋白質(zhì)(細(xì)胞約500μg和神經(jīng)纖維球約100μg)進(jìn)行測試。將樣品與等體積的反應(yīng)緩沖液混合，該緩沖液含有0.1mM乳糖苷神經(jīng)酰胺(Matreya，Biovalley，Marne la Vallée，法國)、4μCi/ml的[唾液酸4，5，6，7，8，9-14C]-CMP-唾液酸(325.2mCi/mmol)(PerkinElmer LifeSciences)、100μM CMP-唾液酸(Sigma)、10mM MgCl2、0.2％的TritonX-100和100mM二甲胂酸鈉，pH6.6。攪拌后將反應(yīng)混合物在37℃孵育50分鐘。通過將樣品加至硅膠60柱(Merck)進(jìn)而從產(chǎn)物中分離出多余的底物來終止反應(yīng)。用水滌洗柱之后，用C/M(1∶1，v/v)洗脫神經(jīng)節(jié)苷脂，在氮氣中干燥該溶劑。最后，用薄層層析(Merck)分離神經(jīng)節(jié)苷脂并用放射自顯影顯影反應(yīng)產(chǎn)物。以產(chǎn)生的GM3的pmol/h/mg的蛋白質(zhì)表示GM3合酶活性。
用外源神經(jīng)節(jié)苷脂處理細(xì)胞被培養(yǎng)于96孔板以評估外源神經(jīng)節(jié)苷脂對BRP和RMC增殖的影響。將外源糖脂(GM3、GM2、GM1和GD1a)、葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖苷神經(jīng)酰胺(Matreya)加入完全培養(yǎng)基，在DMEM/10mM Hepes，pH7.4中這些加入物與BSA形成的1∶1比例的復(fù)合物的終濃度為50μM。處理結(jié)束時，用PBS洗細(xì)胞兩次并在50μl Ripa裂解緩沖液PBS 10mM、NP40 1％(Pierce，Perbio Science，Brebières，法國)、脫氧膽酸鈉0.5％、SDS 0.1％、蛋白酶抑制劑10μl/ml)中于37℃裂解30分鐘。由于實驗中的細(xì)胞數(shù)是用總蛋白質(zhì)濃度校正的(參考

圖1)，使用BCA蛋白質(zhì)測試(Pierce)測量總蛋白質(zhì)以評估細(xì)胞增殖。
用抗系列a神經(jīng)節(jié)苷脂抗體處理為封閉系列a神經(jīng)節(jié)苷脂的潛在影響，細(xì)胞被培養(yǎng)于96孔板并在存在或缺乏50μg/ml的抗GM2多克隆抗體(Calbiochem)或抗GM1多克隆抗體(Matreya)條件下用3μM AGE或BSA對照處理細(xì)胞。處理結(jié)束時，細(xì)胞用PBS洗兩次并在50μl的Ripa裂解緩沖液中裂解且測量蛋白質(zhì)以定量細(xì)胞增殖。
用GM3合酶siRNA轉(zhuǎn)染RMC為封閉GM3合酶活性，RMC被培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板至30％匯合，而后使用Oligofectamine試劑(Invitrogen Corporation)轉(zhuǎn)染針對大鼠cDNA序列(Ambion，Huntingdon，英國)設(shè)計的特異于GM3合酶的干擾RNA(siRNA)。所用的GM3合酶反義序列是GGGUUAUUCUGAACAUGUUtt(SEQ ID NO5)。在預(yù)試驗中，通過用增加濃度的siRNA(0-800nM)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行劑量-響應(yīng)的研究。轉(zhuǎn)染72小時后，測量轉(zhuǎn)染的細(xì)胞勻漿中的GM3合酶活性。隨后評估用siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的增殖。為此目的，在用400nM siRNA轉(zhuǎn)染24小時后，用3μM BSA對照或AGE處理細(xì)胞(3天)。接著細(xì)胞用PBS洗滌兩次和在Ripa裂解緩沖液中裂解，測量其蛋白質(zhì)以評估細(xì)胞增殖。
統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM表示，并代表對照的百分?jǐn)?shù)。在細(xì)胞研究中，使用Wilcoxon等級測試來評估組間差異的顯著性。T-檢驗被用于評估小鼠實驗中的GM3合酶活性。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計顯著性。
實施例2-結(jié)果1-AGE抑制周細(xì)胞和系膜細(xì)胞的增殖為了比較AGE對于周細(xì)胞和系膜細(xì)胞增殖的效果，用濃度為3μM的BSA或AGE處理細(xì)胞4到7天。細(xì)胞計數(shù)表明AGE分別減少了33％和40％的周細(xì)胞和系膜細(xì)胞數(shù)(圖1)?？偟鞍踪|(zhì)也被測量并發(fā)現(xiàn)其下降與細(xì)胞數(shù)相關(guān)。這些結(jié)果證明AGE對于周細(xì)胞和系膜細(xì)胞增殖都有相似的不利影響并使本發(fā)明人能夠闡明在這兩種細(xì)胞類型中涉及AGE應(yīng)答的共同機(jī)制。
2-AGE增加周細(xì)胞和系膜細(xì)胞中的系列a神經(jīng)節(jié)苷脂本發(fā)明人先前的結(jié)果表明AGE能夠調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微血管細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷脂譜(Natalizio等人，2001)。在BRP和RMC細(xì)胞中對應(yīng)答B(yǎng)SA對照或AGE的神經(jīng)節(jié)苷脂譜進(jìn)行分析。神經(jīng)節(jié)苷脂譜是特異于細(xì)胞類型的。在對照條件下，周細(xì)胞中主要的神經(jīng)節(jié)苷脂是系列a神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(占檢測的總神經(jīng)節(jié)苷脂的63％)和GM1(9％)和系列b神經(jīng)節(jié)苷脂GD3(28％)。系膜細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂譜的差別在于非常少量的GD3(5％)和系列a存在GD1a(20％)，GM3仍然是主要的神經(jīng)節(jié)苷脂(75％)。
在用AGE處理的兩種細(xì)胞類型中都觀察到系列a神經(jīng)節(jié)苷脂的增加和系列b神經(jīng)節(jié)苷脂的減少(圖3)。在周細(xì)胞，系列a神經(jīng)節(jié)苷脂GM3和GM1增加約40％，而系列b神經(jīng)節(jié)苷脂GD3減少24％(圖3A)。在系膜細(xì)胞，GM3增加33％，而GD3減少30％；GD1a水平不受影響(圖3B)。在標(biāo)記半乳糖后通過放射自顯影得到了相似的結(jié)果。由于BRP中的系列a神經(jīng)節(jié)苷脂GM2和RMC中的系列a神經(jīng)節(jié)苷脂GM2和GM1難以通過間苯二酚標(biāo)記檢測，使用高比活性的[14C]-D-半乳糖標(biāo)記細(xì)胞并隨后分析對照細(xì)胞和AGE處理的細(xì)胞中的神經(jīng)節(jié)苷脂。結(jié)果顯示BRP中的GM2增加55％(圖3C)，RMC中的GM2和GM1增加25％到35％(圖3D)。這些結(jié)果表明AGE在周細(xì)胞和系膜細(xì)胞中均誘導(dǎo)神經(jīng)節(jié)苷脂譜發(fā)生相似的改變。還表明系列a神經(jīng)節(jié)苷脂的增加可能是細(xì)胞增殖下降的共同機(jī)制。
3-AGE增加周細(xì)胞和系膜細(xì)胞中的GM3合酶活性。
為了解釋觀察到的系列a神經(jīng)節(jié)苷脂增加的相應(yīng)機(jī)制，在對照和處理細(xì)胞中檢測合成系列a神經(jīng)節(jié)苷脂的限制性酶GM3合酶的活性。圖4給出的結(jié)果顯示用AGE處理以約1.8(周細(xì)胞)和約1.5(系膜細(xì)胞)的系數(shù)增加GM3合酶的活性，其很可能是由增加酶反應(yīng)的最大速率導(dǎo)致的結(jié)果。這些結(jié)果表明AGE通過調(diào)控GM3合酶影響RMC和BRP中的共同機(jī)制。
4-外源系列a神經(jīng)節(jié)苷脂抑制周細(xì)胞和系膜細(xì)胞的增殖本發(fā)明人就外源加入系列a神經(jīng)節(jié)苷脂是否影響周細(xì)胞和系膜細(xì)胞的增殖進(jìn)行了研究。細(xì)胞用50μM神經(jīng)節(jié)苷脂處理一代(BRP7天和RMC4天)，并用未唾液酸化的葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖苷神經(jīng)酰胺前體處理作為對照。圖5顯示GM2、GM1和GD1a最有效的抑制周細(xì)胞和系膜細(xì)胞增殖(約15到30％)。GM3弱抑制周細(xì)胞增殖，但對系膜細(xì)胞無顯著影響。作為對照使用的葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖苷神經(jīng)酰胺沒有影響。這些結(jié)果表明系列a神經(jīng)節(jié)苷脂抑制周細(xì)胞和系膜細(xì)胞的增殖。特別是GM2和GM1在應(yīng)答AGE的BRP和RMC中增加，且其降低這兩種細(xì)胞類型的增殖；因此系列a神經(jīng)節(jié)苷脂可能是AGE作用的通用傳遞介質(zhì)。
5-抗系列a神經(jīng)節(jié)苷脂抗體保護(hù)周細(xì)胞和系膜細(xì)胞免于由AGE引起的增殖抑制。
為了研究GM2和GM1是否介導(dǎo)AGE的影響，在抗GM1和抗GM2抗體存在下用AGE處理細(xì)胞。用BSA處理的對照細(xì)胞中，存在或缺乏抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體時的增殖沒有差別。用AGE處理的細(xì)胞中，存在抗GM2和抗GM1抗體能部分地阻止周細(xì)胞和系膜細(xì)胞增殖的下降(圖6)。根據(jù)外源神經(jīng)節(jié)苷脂的影響，這些觀察表明系列a神經(jīng)節(jié)苷脂，特別是GM1和GM2，是周細(xì)胞和系膜細(xì)胞中由AGE誘導(dǎo)的增殖抑制的通用傳遞介質(zhì)。
6-在糖尿病小鼠神經(jīng)纖維球中GM3合酶活性增加為了體內(nèi)評估糖尿病環(huán)境對GM3合酶活性的影響，測量db/db糖尿病小鼠模型的高純化的神經(jīng)纖維球中的酶活性。圖4B的結(jié)果顯示與對照(db/m)相比，糖尿病細(xì)胞的神經(jīng)纖維球中的GM3合酶活性增加約50％。
7-GM3合酶siRNA部分的保護(hù)細(xì)胞免于AGE誘導(dǎo)的效果為了更詳細(xì)的闡明系列a神經(jīng)節(jié)苷脂在介導(dǎo)AGE影響中的作用，用GM3合酶siRNA轉(zhuǎn)染RMC。預(yù)試驗顯示siRNA有效抑制RMC中的GM3合酶活性。隨后，測量所轉(zhuǎn)染細(xì)胞和所處理細(xì)胞的增殖。如圖8所示，在轉(zhuǎn)染了GM3合酶siRNA的細(xì)胞中，AGE對于RMC增殖的影響被部分地抑制。這些結(jié)果清楚證明神經(jīng)節(jié)苷脂涉及介導(dǎo)AGE的作用。該作用的部分性質(zhì)可以通過下列事實解釋(i)如果在更高匯合度處理細(xì)胞以增加轉(zhuǎn)染效率，AGE的影響弱于先前實驗，且(ii)GM3合酶活性僅被抑制50％。
8-糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中的GM3和GD3合酶活性和GM3水平改變?yōu)榱穗x體評估糖尿病環(huán)境對神經(jīng)節(jié)苷脂生物合成途徑的影響，測量db/db糖尿病小鼠模型的腎皮質(zhì)勻漿中的GM3和GD3合酶活性。圖9A-B的結(jié)果顯示與對照(db/m)相比，糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中的GM3合酶活性增力80％，而GD3合酶活性減少50％。在db/db糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中的GM3水平也被分析并顯示出有所增加(盡管不具有統(tǒng)計顯著性)(圖9C)?？傊?，這些結(jié)果因而證明在AGE處理的RMC和BRP所獲得的結(jié)果的病理生理學(xué)意義。
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<400>1ctgagcgggg gagcggcggc ccccagctga atgggcgcga gagcggcgct gggggcgggt 60gggggcgcgg ggtaccgggc tggcggccgg ccggcgcccc ctcattagta tgcggacgaa120ggcggcgggc tgcgcggagc ggcgtcccct gcagccgcgg accgaggcag cggcggcacc180tgccggccga gcaatgccaa gtgagtacac ctatgtgaaa ctgagaagtg attgctcgag240gccttccctg caatggtaca cccgagctca aagcaag atg aga agg ccc agc ttg 295Met Arg Arg Pro Ser Leu1 5tta tta aaa gac atc ctc aaa tgt aca ttg ctt gtg ttt gga gtg tgg 343Leu Leu Lys Asp Ile Leu Lys Cys Thr Leu Leu Val Phe Gly Val Trp10 15 20atc ctt tat atc ctc aag tta aat tat act act gaa gaa tgt gac atg 391Ile Leu Tyr Ile Leu Lys Leu Asn Tyr Thr Thr Glu Glu Cys Asp Met25 30 35aaa aaa atg cat tat gtg gac cct gac cat gta aag aga gct cag aaa 439Lys Lys Met His Tyr Val Asp Pro Asp His Val Lys Arg Ala Gln Lys40 45 50
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<221>CDS<222>(151)..(1314)<223>
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ttg aat tac acc gct gaa gaa tgt gac atg aaa aga atg cac tat gtg 366Leu Asn Tyr Thr Ala Glu Glu Cys Asp Met Lys Arg Met His Tyr Val60 65 70gac cct gac cgg ata aag aga gct cag agc tat gct cag gaa gtc ttg 414Asp Pro Asp Arg Ile Lys Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Glu Val Leu75 80 85cag aag gaa tgt cgg ccc agg tac gcg aag acg gct atg gct ctg tta 462Gln Lys Glu Cys Arg Pro Arg Tyr Ala Lys Thr Ala Met Ala Leu Leu90 95 100ttt gag gac agg tac agc atc aac ttg gag cct ttt gtg cag aag gtc 510Phe Glu Asp Arg Tyr Ser Ile Asn Leu Glu Pro Phe Val Gln Lys Val105 110 115 120ccc acg gcc agt gaa gct gag ctc aag tat gac ccg cct ttt gga ttc 558Pro Thr Ala Ser Glu Ala Glu Leu Lys Tyr Asp Pro Pro Phe Gly Phe125 130 135cgg aag ttc tcc agt aaa gtc cag agc ctc ttg gat atg ctg ccc gaa 606Arg Lys Phe Ser Ser Lys Val Gln Ser Leu Leu Asp Met Leu Pro Glu140 145 150cat gac ttt tct gaa cac ttg aga gcc aag gcc tgc aag cgc tgt gtg 654His Asp Phe Ser Glu His Leu Arg Ala Lys Ala Cys Lys Arg Cys Val155 160 165gtt gtt ggg aac ggg ggc atc ctg cac gga cta gag ctg ggt cac gcc 702Val Val Gly Asn Gly Gly Ile Leu His Gly Leu Glu Leu Gly His Ala170 175 180ctc aac cag ttc gat gtg gta ata agg ttg aac agt gcg cca gtt gag 750Leu Asn Gln Phe Asp Val Val Ile Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val Glu185 190 195 200ggt tac tct gaa cac gtt ggg aat aaa act act ata agg atg act tac 798Gly Tyr Ser Glu His Val Gly Asn Lys Thr Thr Ile Arg Met Thr Tyr205 210 215cca gag ggt gcg cca ctg tcg gac gtt gaa tac tac gcc aat gat ttg 846Pro Glu Gly Ala Pro Leu Ser Asp Val Glu Tyr Tyr Ala Asn Asp Leu220 225 230ttc gtt act gtt tta ttt aag agt gtt gat ttc aag tgg ctt caa gca 894Phe Val Thr Val Leu Phe Lys Ser Val Asp Phe Lys Trp Leu Gln Ala235 240 245
atg gta aaa aat gaa agc ctg ccc ttt tgg gtt cgc ctc ttc ttt tgg 942Met Val Lys Asn Glu Ser Leu Pro Phe Trp Val Arg Leu Phe Phe Trp250 255 260aag caa gtg gca gaa aaa gtc cca ctc cag cca aag cac ttc agg att 990Lys Gln Val Ala Glu Lys Val Pro Leu Gln Pro Lys His Phe Arg Ile265 270 275 280ttg aac cca gtt atc atc aaa gaa act gcc ttc gac atc ctt cag tac1038Leu Asn Pro Val Ile Ile Lys Glu Thr Ala Phe Asp Ile Leu Gln Tyr285 290 295tca gag cct cag tca aga ttc tgg ggc cat gat aag aac atc ccc acg1086Ser Glu Pro Gln Ser Arg Phe Trp Gly His Asp Lys Asn Ile Pro Thr300 305 3l0atc ggc gtc att gcc gtt gtc ttg gct aca cat ctg tgt gat gaa gtc1134Ile Gly Val Ile Ala Val Val Leu Ala Thr His Leu Cys Asp Glu Val315 320 325agc ctg gca ggc ttt ggc tac gac ctc agt caa ccc agg acc cct ctg1182Ser Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Asp Leu Ser Gln Pro Arg Thr Pro Leu330 335 340cac tac ttt gac agt cag tgc atg ggc gcc atg cac tgg cag gtc atg1230His Tyr Phe Asp Ser Gln Cys Met Gly Ala Met His Trp Gln Val Met345 350 355 360cac aat gtg acc aca gag acc aag ttc ctc ctg aag ctc ctc aag gag1278His Asn Val Thr Thr Glu Thr Lys Phe Leu Leu Lys Leu Leu Lys Glu365 370 375ggc gtg gtg gag gac ctc agc ggc ggc atc cac tga gaactcggaa 1324Gly Val Val Glu Asp Leu Ser Gly Gly Ile His380 385cacggcaaac ctcacccagc accgcagctg agagcgtggt gagcagcctc cacagggact 1384tcaccctgca gctgcttcga tgtgcagcta gtgttttcaa actccacatt ttttttaaaa 1444aaggaaaaga aagaacaaca gcaacaacaa aagctctgct ctgtgcacct cttcgtccta 1504tttatttgaa gtcagtgttg gattttgcac agttttgtaa gttaatctta agaatgggat 1564tggaaggact tttcaaagag aattgtatag tttattgttt tttaaggaag taatttaatt 1624tgcagaaact gtacacacgt actctgctca ggtgttgagg tgggaggaga ggggcttctg 1684gcccctggat gatggctgtg atgcccgata ctggggtctg ctgctctgtt tggtagaact 1744
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Leu Glu Pro Phe Val Gln Lys Val Pro Thr Ala Ser Glu Ala Glu Leu115 120 125Lys Tyr Asp Pro Pro Phe Gly Phe Arg Lys Phe Ser Ser Lys Val Gln130 135 140Ser Leu Leu Asp Met Leu Pro Glu His Asp Phe Ser Glu His Leu Arg145 150 155 160Ala Lys Ala Cys Lys Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly Gly Ile Leu165 170 175His Gly Leu Glu Leu Gly His Ala Leu Asn Gln Phe Asp Val Val Ile180 185 190Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val Glu Gly Tyr Ser Glu His Val Gly Asn195 200 205Lys Thr Thr Ile Arg Met Thr Tyr Pro Glu Gly Ala Pro Leu Ser Asp210 215 220Val Glu Tyr Tyr Ala Asn Asp Leu Phe Val Thr Val Leu Phe Lys Ser225 230 235 240Val Asp Phe Lys Trp Leu Gln Ala Met Val Lys Asn Glu Ser Leu Pro245 250 255Phe Trp Val Arg Leu Phe Phe Trp Lys Gln Val Ala Glu Lys Val Pro260 265 270Leu Gln Pro Lys His Phe Arg Ile Leu Asn Pro Val Ile Ile Lys Glu275 280 285Thr Ala Phe Asp Ile Leu Gln Tyr Ser Glu Pro Gln Ser Arg Phe Trp290 295 300Gly His Asp Lys Asn Ile Pro Thr Ile Gly Val Ile Ala Val Val Leu305 310 315 320
Ala Thr His Leu Cys Asp Glu Val Ser Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Asp325 330 335Leu Ser Gln Pro Arg Thr Pro Leu His Tyr Phe Asp Ser Gln Cys Met340 345 350Gly Ala Met His Trp Gln Val Met His Asn Val Thr Thr Glu Thr Lys355 360 365Phe Leu Leu Lys Leu Leu Lys Glu Gly Val Val Glu Asp Leu Set Gly370 375 380Gly Ile His385<210>5<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>干擾RNA<220>
<221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>n＝t 5-甲基尿苷<400>5ggguuauucu gaacauguun n 2權(quán)利要求
1.GM3合酶抑制劑用于制造旨在治療糖尿病微血管并發(fā)癥的藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中糖尿病微血管并發(fā)癥是糖尿病腎病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中抑制劑是GM3合酶基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)抑制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中抑制劑選自反義核酸、核酶、干擾RNA和適體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中抑制劑是在高度嚴(yán)格條件下與序列SEQ ID NO1特異性雜交的反義核酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中抑制劑是GM3合酶活性抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中抑制劑是針對人GM3合酶的單克隆或多克隆的抗體。
8.篩選或鑒定用于治療和/或預(yù)防糖尿病微血管并發(fā)癥的化合物的體外方法，其中評估至少一種測試化合物抑制GM3合酶活性的能力，GM3合酶活性水平的下降是化合物有效治療和/或預(yù)防糖尿病微血管并發(fā)癥的指征。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中糖尿病微血管并發(fā)癥是糖尿病腎病。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，所述篩選方法包括由以下組成的步驟將至少一種測試化合物與表達(dá)GM3合酶的細(xì)胞接觸，并確定所述化合物抑制細(xì)胞中神經(jīng)節(jié)苷脂GM3合成的能力，細(xì)胞中神經(jīng)節(jié)苷脂GM3合成水平的下降是化合物有效治療和/或預(yù)防糖尿病微血管并發(fā)癥的指征。
11.根據(jù)權(quán)利要求8到10中任一項的方法，所述篩選方法包括由一下組成的步驟將至少一種測試化合物與GM3合酶接觸，并確定所述化合物抑制唾液酸殘基從唾液酸供體到唾液酸受體半乳糖殘基的3-羥基基團(tuán)的轉(zhuǎn)移能力，唾液酸轉(zhuǎn)移活性水平的下降是化合物抑制GM3合酶和有效治療和/或預(yù)防糖尿病微血管并發(fā)癥的指征。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中測定從CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸到乳糖苷神經(jīng)酰胺的唾液酸轉(zhuǎn)移水平。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中以可檢測的方式標(biāo)記唾液酸供體和/或受體。
全文摘要
本發(fā)明涉及GM3合酶基因的表達(dá)或活性抑制劑用于治療糖尿病微血管并發(fā)癥的用途，以及篩選治療和/或預(yù)防這些并發(fā)癥的化合物的方法。
文檔編號G01N33/50GK1985002SQ200580014602
公開日2007年6月20日 申請日期2005年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月7日
發(fā)明者S·埃爾巴瓦布, E·馬松, D·魯吉洛, N·維爾恩斯佩爾格, M·拉佳德, L·特龍錫 申請人:默克專利有限公司