專利名稱：早產(chǎn)的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在妊娠哺乳動物中檢測早產(chǎn)(preterm labour)的方法。特別地，但不是排他性地，本發(fā)明涉及用于人類的這樣一種方法。本發(fā)明的各方面涉及用于這樣的方法的材料和制劑。
背景技術(shù)：
早產(chǎn)是新生兒中發(fā)病和死亡的重要原因。由于迅速的干預(yù)可能是有益的，所以早產(chǎn)的精確確定和檢測對減少死亡率是關(guān)鍵的。精確確定還有助于確定是否有必要使母親就醫(yī)，以允許所述需要的干預(yù)。此外，早產(chǎn)的不準確確定能導(dǎo)致不必要的住院治療，這將引起母親的壓力和不適，以及使用稀有的衛(wèi)生保健資源。
目前早產(chǎn)診斷中所用的標記包括唾液雌三醇，胎兒纖連蛋白，和胰島素樣生長因子蛋白1。唾液雌三醇檢測通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)方式檢測到樣品中雌三醇的升高水平，據(jù)信其為早產(chǎn)的預(yù)示。胎兒纖連蛋白通常從子宮頸采樣檢測到，并且認為這種蛋白的不存在為妊娠繼續(xù)的指示。
然而這些方法被認為是不可靠的，并且是不令人滿意的。例如，美國產(chǎn)科醫(yī)師和婦科醫(yī)師學(xué)院(American College of Obstetricians andGynecologists)并不推薦唾液雌三醇檢測作為用于早產(chǎn)的篩選工具，原因在于其產(chǎn)生高百分率的假陽性結(jié)果，并且可能潛在地給產(chǎn)前保健增加顯著的成本和不必要的干預(yù)。類似地，由于盡管認為陰性結(jié)果對于確定分娩沒有開始是可靠的，但是陽性結(jié)果較不可靠，所以不推薦胎兒纖連蛋白檢測用于常規(guī)篩選。
因此，用于診斷早產(chǎn)的其它方法是期望的。
發(fā)明概述本發(fā)明依賴于識別早產(chǎn)的新標記。按照本發(fā)明的第一方面，提供在哺乳動物中用于診斷早產(chǎn)的方法，其包括檢測受試哺乳動物中內(nèi)源大麻素(endocannabinoid)的水平，并且將檢測到的水平與參考水平相比較，認為受試哺乳動物中上升的水平為早產(chǎn)的征兆。
所述哺乳動物可以為靈長類，并且優(yōu)選地為人類。
所述檢測到的水平優(yōu)選地在妊娠過半時檢測。更加優(yōu)選地，所述水平在妊娠晚期期間，并且便利地在或者臨近產(chǎn)期時進行檢測。人的妊娠晚期可以指第三個三個月或者更晚，優(yōu)選地在第三個三個月階段后(大于35周)；更加優(yōu)選地產(chǎn)期是指大于等于37周。
優(yōu)選地，所述內(nèi)源大麻素為花生四烯酸乙醇酰胺(也已知為廿碳四烯酰乙醇酰胺(arachidonylethanolamide)或AEA)。在本發(fā)明的備選實施方案中，所述內(nèi)源大麻素可以為2-花生四烯酰甘油，或棕櫚酰乙醇酰胺。
所述參考水平可以基于同一受試哺乳動物在妊娠早期檢測到的水平，但是優(yōu)選地基于該種類哺乳動物的典型非產(chǎn)期妊娠水平。所述典型水平可以基于產(chǎn)期中期的水平；例如，當所述方法用于人時，參考水平可以基于第二個或者第三個三個月的水平。
所述方法還可以包括從受試哺乳動物采集用于檢測的樣品的步驟。所述樣品可以取自血液，血漿，唾液，痰液，子宮頸或陰道涂片或拭子。所述檢測可以在體內(nèi)進行，或者優(yōu)選地在體外進行。
內(nèi)源大麻素水平的檢測可以以任何適當?shù)姆绞竭M行；例如，通過HPLC，抗體，受體，結(jié)合分子等方式。在特定實施方案中，檢測可以包括應(yīng)用結(jié)合內(nèi)源大麻素的抗體；這些抗體可以用允許檢測的熒光或者放射性標記進行標記，或者它們本身可以隨后用標記的二級抗體或酶檢測。備選地，所述抗體可以用于將內(nèi)源大麻素從溶液中沉淀出來?？贵w可以在溶液中，或者黏附于固體支持物上?？梢詰?yīng)用受體或者結(jié)合分子來檢測內(nèi)源大麻素；例如，已知受體CB1和CB2與AEA結(jié)合，并且可以用于檢測AEA。
在本發(fā)明的特定實施方案中，可以間接檢測內(nèi)源大麻素水平。例如，據(jù)信酶脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)降解AEA，并且下降的FAAH水平與升高的AEA水平相關(guān)。因此，可以認為FAAH水平的檢測為AEA水平的指示。
按照本發(fā)明的另一方面，提供在哺乳動物中用于診斷早產(chǎn)的方法，其包括檢測受試哺乳動物中酶脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的水平，并且將檢測到的水平與參考水平相比較，認為受試哺乳動物中下降的水平是早產(chǎn)的征兆。
所檢測的水平優(yōu)選地在妊娠過半時檢測。更加優(yōu)選地，所述水平在妊娠晚期期間，并且便利地在或者接近產(chǎn)期時進行檢測。人類妊娠晚期可以指第三個三個月或者更晚，優(yōu)選地在第三個三個月階段后(大于35周)；更加優(yōu)選地產(chǎn)期是指大于等于37周。
本發(fā)明的各方面還提供內(nèi)源大麻素在哺乳動物中用于診斷早產(chǎn)的方法中的應(yīng)用，所述方法包括檢測受試哺乳動物中內(nèi)源大麻素的水平，并且將檢測到的水平與參考水平相比較，認為受試哺乳動物中上升的水平為早產(chǎn)的征兆。本發(fā)明還涉及內(nèi)源大麻素在診斷方法中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供FAAH在哺乳動物中用于診斷早產(chǎn)的方法中的應(yīng)用，所述方法包括檢測受試哺乳動物中FAAH的水平，并且將檢測到的水平與參考水平相比較，認為受試哺乳動物中下降的水平為早產(chǎn)的征兆。
本發(fā)明還提供用于診斷哺乳動物的早產(chǎn)的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測樣品中內(nèi)源大麻素水平的試劑。所述試劑盒還包括關(guān)于使用所述試劑的使用說明。所述試劑可以包括針對內(nèi)源大麻素的抗體，或者可以包括內(nèi)源大麻素的受體或其它結(jié)合分子。可以將所述抗體或者結(jié)合分子標記，例如用熒光或放射性標記；備選地，所述試劑盒可以包括用于檢測結(jié)合的抗體或者結(jié)合分子的其它試劑。所述試劑盒還包括從受試哺乳動物采集樣品的工具；例如，拭子，注射器等。
本發(fā)明還提供治療哺乳動物早產(chǎn)的方法，所述方法包括降低經(jīng)歷早產(chǎn)的受試哺乳動物中的內(nèi)源大麻素水平。所述內(nèi)源大麻素優(yōu)選為AEA。所述內(nèi)源大麻素水平可以通過施用針對AEA的抗體或者其它結(jié)合分子而降低；或者可以通過施用降解內(nèi)源大麻素的酶，諸如FAAH而降低。備選地，所述內(nèi)源大麻素可以為2-花生四烯酰甘油或棕櫚酰乙醇酰胺。本發(fā)明還提供內(nèi)源大麻素在制備用于治療哺乳動物早產(chǎn)的藥物中的應(yīng)用；和FAAH在制備用于治療哺乳動物早產(chǎn)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供在受試哺乳動物中誘導(dǎo)分娩的方法，所述方法包括在受試哺乳動物中將內(nèi)源大麻素的有效水平(effective level)升高。所述內(nèi)源大麻素優(yōu)選為AEA。所述方法可以包括施用AEA本身的步驟，或者可以包括施用其類似物。備選地，可以降低FAAH水平，或者可以施用AEA的競爭劑以結(jié)合FAAH，由此降低其有效水平。備選地，所述內(nèi)源大麻素為2-花生四烯酰甘油或棕櫚酰乙醇酰胺。
附圖簡述現(xiàn)在將僅通過實例和參考附圖的方式，描述本發(fā)明的這些和其它方面，所述附圖顯示

圖1.在絕經(jīng)后婦女，處于月經(jīng)周期，妊娠，和產(chǎn)期的未分娩和分娩期間的婦女中的血漿AEA水平。
圖2.取樣時血漿花生四烯酸乙醇酰胺(AEA)水平和收縮持續(xù)時間之間的關(guān)系。
圖3.血漿花生四烯酸乙醇酰胺(AEA)水平和從取樣到分娩的間隔之間的關(guān)系。
圖4.取樣時血漿花生四烯酸乙醇酰胺(AEA)水平和子宮頸擴張之間的關(guān)系。
附圖詳述引言內(nèi)在大麻素，內(nèi)源大麻素，是作為大麻素受體的配體的不飽和脂肪酸衍生物1。廿碳四烯酰乙醇酰胺或花生四烯酸乙醇酰胺(AEA)，是從腦組織中分離的首個內(nèi)源大麻素2。應(yīng)答去極化劑，激素和神經(jīng)遞質(zhì)，它從細胞膜磷脂前體酶促釋放3，4。認為AEA水平受下列因素控制其通過花生四烯酸乙醇酰胺轉(zhuǎn)運蛋白的細胞吸收5，6，和其通過膜結(jié)合的脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)7-10以及其它酶11-13的隨后酶促降解作用。AEA通過與血漿膜大麻素受體的相互作用發(fā)揮作用。已經(jīng)報道了兩種亞型的大麻素受體，CB1和CB214-17，其屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族18。它們位于包括生殖道(reproductive tract)在內(nèi)的不同組織類型中。CB1受體被稱為中樞受體，因為其首先位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中19，而CB2受體被稱為外圍受體，因為其首先位于脾臟和其它位點17，20，21。
已經(jīng)發(fā)表了在人和動物模型中關(guān)于在大麻中存在的外生大麻素對于妊娠的副作用的一些流行病學(xué)和觀察研究。這些作用從早期流產(chǎn)(foetalloss)，胎兒生長限制到早產(chǎn)22-26。通過比較，存在相對少的關(guān)于內(nèi)源大麻素在妊娠中的作用的報道。在小鼠中，已經(jīng)提出AEA在子宮植入的局部調(diào)控中起著重要作用27，原因在于AEA表現(xiàn)出胚胎毒性并且抑制胚胎發(fā)育28。在植入位點，組織AEA水平只有在非植入位點的水平的25％29。這被認為是由于FAAH的局部組織水平導(dǎo)致，與非植入位點相比較，所述FAAH在植入位點高水平表達30。由于CB1R在人子宮肌膜中表達，并且通過AEA體外激發(fā)這一受體導(dǎo)致子宮肌帶(myometrial strips)的松弛，所以更近的研究表明內(nèi)源大麻素(例如AEA)在子宮肌膜中進一步的潛在作用31。最近已經(jīng)在人胎盤和肽體膜中鑒別了CB1R和FAAH的免疫反應(yīng)性32，這表明，在妊娠過程中，所述內(nèi)源大麻素系統(tǒng)也可能在這些組織中是重要的。
在人妊娠過程中，可以獲得很少的關(guān)于AEA系統(tǒng)水平的信息。然而，在早期妊娠期間，在外周血單核細胞中，血AEA水平與FAAH水平反相關(guān)33，并且由于與那些妊娠進展超過第一個三個月的婦女相比較，在隨后流產(chǎn)的婦女中，妊娠8周的FAAH水平更低，這表明順利的妊娠進展需要低AEA水平34。與那些經(jīng)歷順利的進行妊娠(ongoing pregnancies)的患者相比較，在經(jīng)過IVF治療和胚胎轉(zhuǎn)移沒能完成進行妊娠的患者中，已經(jīng)表明血漿AEA水平更高，并且這由外周血單核細胞中更低的FAAH水平反映出33。尚未確定這些差異是否受在調(diào)節(jié)植入并且維持早期妊娠的性甾醇中的各種變化的影響或者取決于這些變化。然而，在AEA水平和妊娠確立之間以及任何其它作用中的關(guān)系是不清楚的，原因在于超過第一個三個月或者確實在月經(jīng)周期期間，不報道AEA水平。在過去，這樣的研究受到方法學(xué)難度的妨礙，但是用于AEA檢測的工具和技術(shù)已經(jīng)得到了改進并且繼續(xù)改進35。
首先，我們的目標是改進并且驗證所建立的檢測人血漿中AEA的方法，然后首次應(yīng)用這種方法來確定在月經(jīng)周期和正常妊娠中的AEA血漿水平。
受試者和方法受試者所有的受試者給出簽署的參與本研究的知情同意書，其由當?shù)氐难芯康赖挛瘑T會(research ethics committee)核準。為了確定妊娠期間AEA水平變化的目的，我們交叉研究了5組婦女第一個，第二個和第三個三個月，產(chǎn)期未分娩和產(chǎn)期分娩。所述第一個三個月定義為月經(jīng)后6-11周，第二個為月經(jīng)后15-27周，和第三個為月經(jīng)后28-35周。產(chǎn)期定義為月經(jīng)后完整的37-42周。
對于妊娠婦女的包括標準為從在月經(jīng)后6-8周進行的第一個三個月的超聲掃描的準確確定日期的妊娠，簡單的單胎妊娠和沒有共存的母親或者妊娠疾病。沒有人服用任何藥物或者已知已經(jīng)服用了消遣藥物(recreationaldrugs)。只有確定分娩(定義為至少4cm的子宮頸擴張和每隔10分鐘3-4次規(guī)律的子宮收縮)的婦女包含在產(chǎn)期分娩組中。
將非妊娠婦女分成2組絕經(jīng)期前和后。對于絕經(jīng)期前婦女的包含標準包括年齡在22-40歲，身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)＜27kg/m2，在至少3個月內(nèi)沒有進行任何激素避孕或治療，沒有服用任何藥物或經(jīng)受任何內(nèi)科疾病的折磨?；趶幕颊邎蟾娴淖詈笤陆?jīng)期日期評估的月經(jīng)周期(卵泡第2-7天和黃體第20-25天)，在2個亞組中收集樣品。對于絕經(jīng)期后婦女的包含標準包括在絕經(jīng)后最少2年，BMI＜27kg/m2，年齡在55-60歲之間，在之前的3個月沒有進行激素替代療法并且沒有服用任何藥物(例如，糖皮質(zhì)激素，抗高血壓藥，止痛劑，消遣藥物)或經(jīng)受任何內(nèi)科疾病的折磨。
N-花生四烯酸乙醇酰胺(AEA)測定基于早先報道的同位素稀釋方法36，通過高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)測量血漿AEA。在冰上在EDTA管中收集血樣(4ml)，并且添加到含有2ml的Krebs-Tris-EDTA緩沖液的聚丙烯管中。將樣品在22℃以1200×g離心30min，以將血漿與細胞分離?；厥蘸螅瑢ρ獫{摻加25.1pmol氘標記的AEA(d8-AEA，Cayman chemicals，Ann Arbor，USA)，以評估脂質(zhì)萃取步驟的效率。通過添加冰冷的丙酮沉淀蛋白，接著在22℃以1000×g離心10min。然后，通過添加甲醇∶氯仿(1∶2)(1∶1 vol∶vol)在上層清液進行脂質(zhì)萃取。回收氯仿層，并且在甲醇∶氯仿(3∶1)重構(gòu)前將所述樣品在氮氣氣流下干燥。將再生樣品的一式兩份的注射劑(10μl)用于HPLC-MS分析。
HPLC-MS系統(tǒng)由Waters 1525二元液相色譜泵和配有100μl注射環(huán)的Waters 717+自動進樣器組成。HPLC與Quattro Ultima triple quadnipole質(zhì)譜儀通過Z-噴霧離子源接口，并且通過MassLynx NT軟件v3.5(Waters MSTechnology，Manchester，UK)控制。反相色譜分離在Hypersil ODS C18柱(4.6×100mm，3μm微粒大?。籔henomenex，Macclesfield，UK)上進行。應(yīng)用柱溫控制器(Jones Chromatography，Hengoed，UK)將柱溫維持在30℃，并且所述樣品在冷凍注射系統(tǒng)中維持在4℃。流動相由水(A)和甲醇(B)組成，其應(yīng)用甲醇的逐步遞增以0.5ml/min運送，如此25％A，75％B，2min；15％A，85％B，3min；5％A，95％B，20min；100％B，5min；然后通過改變緩沖條件至25％A，75％B，20分鐘，進行柱再平衡步驟。在這些條件下，對于AEA和AEA-d8的保留時間分別為17.12和16.98分鐘。
應(yīng)用氮氣作為霧化氣體，以正模式進行電霧化離子化。毛細管電壓設(shè)為3.5kV，錐形電壓(cone voltage)50V，源溫度120℃，和去溶劑化溫度350℃。通過應(yīng)用灌輸泵以1ng/μl的灌輸標準，確定用于AEA-d0和AEA-d8分析的質(zhì)譜參數(shù)。在所選擇的離子記錄模式中，應(yīng)用所述分子離子的鈉加合物[M+Na+；m/z＝370.3(d0)和378.3(d8)]進行量化。所述測量表示為在AEA-d0曲線下的面積在AEA-d8曲線下的面積的峰值面積比例，并且從相對于注射到HPLC的已知的AEA-d0量(Cayman chemicals，AnnArbor，USA)的峰值面積比例的曲線上，直接對用等量的AEA-d8摻加的血漿樣品中AEA的量進行量化。標準曲線線性達到2pmol AEA-d0，具有注射到柱上的0.03125pmol AEA-d0的檢測下限。對于檢測范圍(0.03-2.1pmol/柱)，內(nèi)和交互檢測變異系數(shù)分別為6％和9％。
將所有的血樣在收集的2小時內(nèi)處理。在這段時間內(nèi)沒能處理所述樣品導(dǎo)致AEA的降解(數(shù)據(jù)沒顯示)。
統(tǒng)計學(xué)分析具有α＝0.05和β＝0.8的所發(fā)表的AEA數(shù)據(jù)33的冪分析(poweranalysis)表明，每個研究組需要的能夠允許觀察到血漿AEA濃度顯著變化的最小受試者數(shù)目為6。因此，我們確保每個樣品組包括至少6名受試者(表I)。數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標準誤差(SEM)或者標準偏差(SD)，其中適合每個測試組和組間比較的情形應(yīng)用不成雙的Student t-檢驗和用不等價標準偏差的Welch’s校正完成，并且認為p＜0.05是統(tǒng)計學(xué)顯著的。
結(jié)果受試者研究120名妊娠，月經(jīng)期和絕經(jīng)后的婦女。在第一個，第二個和第三個三個月每組10名，在產(chǎn)期和未分娩為22名，以及在產(chǎn)期和分娩組中為25名。表I顯示這些婦女的詳細情況。在育齡婦女的年齡平均值±SD中不存在顯著差異，但是絕經(jīng)后婦女的平均值±SD顯著地大于非妊娠月經(jīng)期組的值(57±2.0比較(cf.)32.7±6.1；P＜0.05)。產(chǎn)期未分娩和分娩婦女的妊娠年齡平均值±SD是相似的(39.3±1.3比較39.6±1.3；P＞0.05)。
表I.研究組的分布，年齡和妊娠年齡(數(shù)據(jù)表示為平均值，圓括號里為范圍)。
在產(chǎn)期分娩組的25名婦女中，17名自然的陰道分娩，3名產(chǎn)鉗分娩，和5名手術(shù)分娩(2名真空抽提和3名緊急剖腹產(chǎn))。在取樣時子宮頸擴張的平均值±SD為6.04±2.2cm(4-10cm范圍)，而在血樣收集前子宮收縮的平均持續(xù)時間為5.1±2.2小時(1.2-12小時范圍)。在取樣和分娩之間的時間間隔平均值±SD為5.3±4.3小時(0.5-11.8小時范圍)。在取樣前13名婦女在分娩中具有硬膜外止痛法，以及其余的(12名)在分娩中只有一氧化二氮和氧氣組合，該組合在分娩中也稱為“氣體和空氣(gasand air)”。
N-花生四烯酸乙醇酰胺(AEA)水平在妊娠期間，不包括分娩婦女的AEA水平從第一個三個月的0.89±0.14nM下降到第二個三個月的0.44±0.12nM和第三個三個月的0.44±0.11nM(P＝0.04)，并且此后在產(chǎn)期未分娩組中上升到0.68±0.09nM(P＝0.03)。然而，在產(chǎn)期分娩婦女的所述水平中存在非常顯著的變化，其中它們比產(chǎn)期未分娩婦女的值上升了3.7倍，并且比第三個三個月的值上升6倍，達到2.5±0.22nM。產(chǎn)期分娩和第一個三個月，第二個三個月和第三個三個月以及未分娩水平之間的差異都是統(tǒng)計學(xué)顯著的(P＜0.0001)。
在月經(jīng)期婦女中，卵泡期AEA水平(1.68±0.16nM)顯著高于黃體期的AEA水平(0.87±0.19nM)；(P＜0.0053)。在絕經(jīng)后婦女中的水平(0.67±0.01nM)顯著低于在卵泡期的水平(P＝0.0002)，但是并不顯著低于在黃體期的水平。
當將在月經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女中的AEA水平與處于妊娠期間的AEA水平相比較時，出現(xiàn)了顯著的模式。這些模式在圖1中顯示。絕經(jīng)后(0.67±0.01nM)和黃體期水平(0.77±0.19nM)與在第一個三個月的水平相似，高于第二個三個月和第三個三個月和未分娩產(chǎn)期水平(但是非統(tǒng)計學(xué)上地，P＞0.05)，但是顯著低于產(chǎn)期分娩組的水平(P＜0.0002)。卵泡期水平顯著高于(P＜0.001)妊娠期間的水平，但是顯著低于(P＜0.005)分娩組的水平。
圖2顯示血漿AEA水平和直到取樣時的收縮持續(xù)時間之間的關(guān)系。在AEA水平和這種持續(xù)時間之間存在直接的線性關(guān)系(r2＝0.2193，p＜0.0182)?；诜置涞耐暾掷m(xù)時間，將分娩婦女進一步分成3組(組I＝0-5小時，組II＝5.1-10小時和組III＝10.1-15小時)。在所述3組中，AEA水平平均值±SEM分別為2.1±1.04nM，2.58±0.95和3.8±1.15nM。盡管對于AEA值存在隨著分娩時間增加而增加的趨勢，這并沒有獲得統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＞0.05)。圖3顯示取樣時AEA水平和從取樣到分娩的時間之間的逆相關(guān)關(guān)系。圖4顯示取樣時子宮頸擴張和血漿AEA水平之間的關(guān)系；(r2＝0.092，P＝0.1)。血漿AEA，與取樣和分娩之間的時間間隔之間的關(guān)系在圖4中顯示(r2＝2.113，P＝0.02)。
在取樣前具有硬膜外止痛法的13名婦女中的水平(2.24±0.32)，與在取樣前并且持續(xù)她們剩余的分娩只有entonox‘氣體和空氣’的12名中的水平(2.78±0.30)相似。這些婦女沒有一人接受麻醉劑。
討論我們的結(jié)果證明，在妊娠和分娩期間AEA水平的顯著變化。血漿AEA水平從第一個三個月下降到第二個和第三個三個月，在第二個和第三個三個月之間沒有變化。在臨床上明顯的分娩開始發(fā)作前的產(chǎn)期所述水平上升，并且在分娩期間進一步上升到代表從第三個三個月的水平增加6倍。
Macarrone及同事的研究33證明，在IVF妊娠中，低血漿AEA水平與超過妊娠的第一個三個月發(fā)展的妊娠相關(guān)，這表明順利發(fā)育的孕體(conceptus)抑制血漿AEA的系統(tǒng)水平。正常的胎兒發(fā)育和妊娠維持可能需要這種抑制，這得到高AEA水平與流產(chǎn)具有相關(guān)性的支持33。還已知在小鼠中內(nèi)源大麻素具有對順利妊娠的副作用(Yang等，1996；Schmid等.1997，Paria等.1999，Macarrone等2000)。已經(jīng)證明，在胚泡時期和在胚泡孵化時，所述高水平妨礙2-細胞小鼠胚胎的發(fā)育(Yang等，1996)，一種機制，其可能與早期發(fā)生的妊娠失敗和生長限制相關(guān)。對于具有低水平AEA的環(huán)境的需求得到外源大麻素的作用的支持，所述外源大麻素在內(nèi)源大麻素受體上作用，并且與流產(chǎn)，胎兒生長限制和早產(chǎn)相關(guān)22-26。
令人驚訝地，在我們的研究中，在第一個三個月檢測到的水平，其與在順利的IVF妊娠中報道的那些水平相似(Macarrone等2000)，與在月經(jīng)周期的黃體期的那些水平相似。這暗示，所提議支持早期妊娠需要的低的AEA水平已經(jīng)在黃體期確定，其使得成功植入，并且所述成功的妊娠代表這些被抑制的水平的成功維持。在絕經(jīng)后婦女的低水平和在卵泡期的高水平，表明甾醇激素主要調(diào)控AEA水平，隨著雌二醇增加，所述水平和孕酮抑制它們。孕酮的作用可能導(dǎo)致通過外周血單核細胞調(diào)控外周AEA的降解，原因在于這些細胞中的FAAH水平，參與AEA降解的主要酶，受到孕酮的調(diào)控37，38。由于據(jù)報道雌二醇增加AEA從這些細胞到循環(huán)的釋放，所以由雌二醇誘導(dǎo)的高AEA水平可能受到其對內(nèi)皮細胞作用的調(diào)節(jié)39。
然而，這些考慮不能說明在臨床上明顯分娩開始發(fā)作之前的產(chǎn)期和緊接著在分娩期間的AEA水平的顯著增加，此時在系統(tǒng)甾醇激素水平上沒有變化。由于在AEA濃度和在分娩期間使用的硬膜外止痛法之間沒有相關(guān)性，所以AEA濃度的增加不可能歸因于疼痛。除非AEA的產(chǎn)生專一地由分娩激發(fā)，否則甾醇激素控制其產(chǎn)生和降解的早先的考慮將可以解釋，如對于子宮提議的那樣(ref)，是否在外周血單核細胞中發(fā)生‘功能性孕酮退隱(functional progesterone withdrawal)’，以致由孕酮誘導(dǎo)的FAAH不能允許AEA水平上升。
這些觀察回避了AEA在生產(chǎn)和分娩中可能的功能的問題實質(zhì)。分娩與在所有生殖組織中作用的前列腺素的局部增加的產(chǎn)生相關(guān)44，并且由于AEA作為花生四烯酸的儲存庫，AEA水平的上升將會提供巨大的用于產(chǎn)生前列腺素的前體儲存庫。早產(chǎn)過程中是否發(fā)生同等的AEA上升尚等待進一步的研究。大麻素受體，CB1和CB2，存在于子宮中(REF)，并且這些受體的體外刺激導(dǎo)致子宮肌帶的松弛(REF)，假定在該研究中AEA的上升與分娩相關(guān)，其看起來是荒謬的。然而，可能地，如果大麻素受體在子宮內(nèi)差異表達，那么在分娩過程中，AEA作用可能與更低的子宮部位內(nèi)的子宮肌膜細胞的松弛相關(guān)。這種解釋可以得到我們的觀察的支持，即，在先于臨床上明顯子宮收縮和分娩發(fā)作前的產(chǎn)期，以及當更低的子宮部位和子宮頸擴張發(fā)生時期間，AEA水平上升。
總之，這些觀察強調(diào)了內(nèi)源大麻素在人妊娠維持和分娩中的潛在作用。
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權(quán)利要求
1.一種用于診斷哺乳動物早產(chǎn)的方法，其包括檢測受試哺乳動物中內(nèi)源大麻素的水平，并且將檢測到的水平與參考水平相比較，認為在所述受試哺乳動物中上升的水平為早產(chǎn)的征兆。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物為人類。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述內(nèi)源大麻素是選自由2-花生四烯酰甘油，棕櫚酰乙醇酰胺和花生四烯酸乙醇酰胺組成的組。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述內(nèi)源大麻素為花生四烯酸乙醇酰胺(AEA)。
5.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述參考水平是基于對于所述種類的哺乳動物的典型的非產(chǎn)期妊娠水平。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述參考水平是基于產(chǎn)期中期水平。
7.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其還包括從受試哺乳動物中采集用于檢測的樣品的步驟。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述樣品是從血漿采集的。
9.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述檢測是在體外進行的。
10.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述檢測是借助內(nèi)源大麻素的抗體進行的。
11.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述檢測步驟包括檢測受試哺乳動物中脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)水平。
12.一種用于診斷哺乳動物早產(chǎn)的方法，其包括檢測受試哺乳動物中酶脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的水平，并且將檢測到的水平與參考水平相比較，認為受試哺乳動物中下降的水平是早產(chǎn)的征兆。
13.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述檢測到的水平是在妊娠晚期期間檢測的。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述檢測到的水平是在或者臨近產(chǎn)期時檢測的。
15.前述權(quán)利要求中任一項的方法，當在人身上進行時，其中所述檢測到的水平是在第三個三個月或者更晚時檢測的。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述檢測到的水平時在35周或者更晚時檢測的。
17.內(nèi)源大麻素在用于診斷哺乳動物早產(chǎn)的方法中的應(yīng)用，所述方法包括檢測受試哺乳動物中內(nèi)源大麻素的水平，并且將檢測到的水平與參考水平相比較，認為受試哺乳動物中上升的水平為早產(chǎn)的征兆。
18.一種用于診斷哺乳動物的早產(chǎn)的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測樣品中內(nèi)源大麻素的水平的試劑。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其還包括關(guān)于所述試劑的使用的使用說明。
20.權(quán)利要求18或19的試劑盒，其中所述試劑包括針對所述內(nèi)源大麻素的抗體。
21.權(quán)利要求18-20中任一項的試劑盒，其還包括從受試哺乳動物中采集樣品的工具。
22.一種治療哺乳動物早產(chǎn)的方法，所述方法包括降低經(jīng)歷早產(chǎn)的受試哺乳動物中的內(nèi)源大麻素的水平。
23.內(nèi)源大麻素在制備用于治療哺乳動物早產(chǎn)的藥物中的應(yīng)用。
24.一種誘導(dǎo)受試哺乳動物分娩的方法，所述方法包括在受試哺乳動物中升高內(nèi)源大麻素的有效水平。
全文摘要
本發(fā)明描述一種在哺乳動物中用于診斷早產(chǎn)的方法，其包括測量受試者中內(nèi)源大麻素，諸如花生四烯酸乙醇酰胺的水平。升高的水平為早產(chǎn)的征兆。所述測量典型地在妊娠晚期，諸如人類的第三個三個月進行。在特定的實施方案中，內(nèi)源大麻素水平可以間接測定，例如通過測量脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)水平來測定。
文檔編號G01N33/94GK1977169SQ200580014584
公開日2007年6月6日 申請日期2005年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月8日
發(fā)明者J·科涅 申請人:萊斯特大學(xué)