本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與植物碳酸鹽脅迫耐性相關(guān)蛋白GsJ11及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

土壤鹽堿化嚴(yán)重影響了陸地生態(tài)并嚴(yán)重制約了全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，現(xiàn)已成為世界性的環(huán)境問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國鹽堿化土地面積達(dá)9913萬hm²，約為世界鹽堿化土地的10％。我國東北地區(qū)是世界三大鹽堿土分布區(qū)之一，占地達(dá)7.66×10⁶hm，且鹽堿土面積以每年1.4％的速度增加。東北地區(qū)鹽堿土中的主要鹽分是堿性鹽(NaHCO₃和Na₂CO₃)，相比于中性鹽(NaCl和Na₂SO₄)所造成的滲透脅迫和離子脅迫外，堿性鹽還包含CO₃^2-及HCO₃^-產(chǎn)生的高pH傷害，危害更復(fù)雜、更具生態(tài)破壞力。因此，開展作物抗鹽堿、耐鹽堿性研究，提高作物的耐鹽堿性，是農(nóng)業(yè)進(jìn)一步增產(chǎn)增收的重要基礎(chǔ)，對(duì)開發(fā)和利用大面積鹽堿化土地具有重要意義。

DnaJ/Hsp40(熱激蛋白40)是一類輔助伴侶分子，含有一個(gè)高度保守的約70個(gè)氨基酸左右的J結(jié)構(gòu)域，可通過該結(jié)構(gòu)域結(jié)合并調(diào)節(jié)Hsp70蛋白，共同組成Hsp70分子伴侶機(jī)器，促進(jìn)蛋白的折疊與解折疊，使蛋白恢復(fù)正確構(gòu)象，幫助植物抵御生物及非生物脅迫。此外，分子伴侶DnaJ對(duì)于蛋白的翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解也具有著重要作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控植物抗逆性。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了與植物抗逆性相關(guān)蛋白，本發(fā)明所提供的與植物抗逆性相關(guān)蛋白的名稱為GsJ11，為如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；

b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

c)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

其中，序列2由158個(gè)氨基酸殘基組成。

為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。

表1、標(biāo)簽的序列

上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與GsJ11蛋白相關(guān)的生物材料。

本發(fā)明提供的與GsJ11蛋白相關(guān)的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：

A1)編碼GsJ11蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；

A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；

A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；

A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；

A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；

A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。

上述相關(guān)生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其編碼序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由477個(gè)核苷酸組成，編碼序列2所示的氨基酸序列。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼GsJ11蛋白的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有編碼GsJ11蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GsJ11蛋白且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

上述生物材料中，A2)所述的含有編碼GsJ11蛋白的核酸分子的表達(dá)盒(GsJ11基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)GsJ11蛋白的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)GsJ11轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止GsJ11轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S：來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶(“LAP”,Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國專利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國專利5，057,422)；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128(CN101063139B(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的啟動(dòng)子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV 35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述GsJ11基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptII基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。

上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。

上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了GsJ11蛋白或上述相關(guān)生物材料的新用途。

本發(fā)明提供了GsJ11蛋白或上述相關(guān)生物材料在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GsJ11蛋白或上述相關(guān)生物材料在培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗碳酸鹽脅迫，所述抗碳酸鹽脅迫具體為抗NaHCO₃脅迫，體現(xiàn)為在NaHCO₃脅迫的條件下：轉(zhuǎn)基因植物的萌發(fā)率高于受體植物、轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)長(zhǎng)于受體植物、轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于受體植物、轉(zhuǎn)基因植物的葉綠素含量高于受體植物及轉(zhuǎn)基因植物的丙二醛含量低于受體植物。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明最后提供了一種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括在受體植物中過表達(dá)GsJ11蛋白，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述受體植物。

上述方法中，所述過表達(dá)的方法為將GsJ11蛋白的編碼基因?qū)胧荏w植物。

上述方法中，所述GsJ11蛋白的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述GsJ11蛋白的編碼基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)通過重組載體pCAMBIA330035Su-GsJ11導(dǎo)入所述受體植物中，所述重組載體pCAMBIA330035Su-GsJ11為在pCAMBIA330035Su載體中插入如序列表中序列1所示的GsJ11基因。pCAMBIA330035Su-GsJ11表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。

上述方法中，所述抗逆性為抗碳酸鹽脅迫，所述抗碳酸鹽脅迫具體為抗NaHCO₃脅迫，體現(xiàn)為在NaHCO₃脅迫的條件下：轉(zhuǎn)基因植物的萌發(fā)率高于受體植物、轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)長(zhǎng)于受體植物及轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于受體植物。

上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、苜蓿或水黃皮；所述十字花科植物可為擬南芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述擬南芥可為擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型col-0)。

上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述GsJ11基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。

擴(kuò)增編碼上述GsJ11蛋白的核酸分子全長(zhǎng)或其片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種與植物碳酸鹽脅迫耐性相關(guān)蛋白GsJ11。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將GsJ11基因超表達(dá)于擬南芥中，可增強(qiáng)擬南芥對(duì)碳酸鹽脅迫的耐性，說明該蛋白可以為培育具有碳酸鹽脅迫耐性的轉(zhuǎn)基因植物的研究奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為GsJ11基因在野生大豆中的組織定位分析。

圖2為GsJ11基因在碳酸鹽脅迫下的表達(dá)模式分析。

圖3為轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥及擬南芥突變體純合株系atj11的PCR鑒定。圖3a為T₁代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥的PCR鑒定結(jié)果，其中，M為DL 2K Marker，+為陽性對(duì)照，-為陰性對(duì)照，WT為野生型擬南芥樣本，1-10為T₁代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥樣本；圖3b和圖3c為擬南芥突變體純合株系atj11的三引物法PCR鑒定結(jié)果，其中，M為DL 2K Marker，WT為野生型擬南芥樣本，-為陰性對(duì)照，1-12為擬南芥突變體純合株系atj11樣本。

圖4為轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥及擬南芥突變體純合株系atj11的RT-PCR鑒定。圖4a為轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥的RT-PCR鑒定結(jié)果；圖4b為擬南芥突變體純合株系atj11的RT-PCR鑒定結(jié)果。

圖5為轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥萌發(fā)期的耐碳酸鹽脅迫分析。其中，圖5a為不同濃度的碳酸鹽脅迫處理后的T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11的萌發(fā)期表型；圖5b為不同濃度的碳酸鹽脅迫處理后的T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11的萌發(fā)率測(cè)定，其中，縱坐標(biāo)代表萌發(fā)率，橫坐標(biāo)代表NaHCO₃處理天數(shù)。

圖6為轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥幼苗期的耐碳酸鹽脅迫分析。圖6a為不同濃度的碳酸鹽脅迫處理后的T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11的幼苗期表型；圖6b為不同濃度的碳酸鹽脅迫處理后的野生型擬南芥與擬南芥突變體純合株系atj11的根長(zhǎng)測(cè)定，其中，縱坐標(biāo)代表根長(zhǎng)，橫坐標(biāo)代表NaHCO₃濃度；圖6c為不同濃度的碳酸鹽脅迫處理后的T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)與野生型擬南芥的根長(zhǎng)測(cè)定，其中，縱坐標(biāo)代表根長(zhǎng)，橫坐標(biāo)代表NaHCO₃濃度。

圖7為轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥成苗期的耐碳酸鹽脅迫分析。其中，圖7a為150mM的NaHCO₃脅迫處理前后的T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11的成苗期表型；圖7b為150mM的NaHCO₃脅迫處理后的T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11的葉綠素含量測(cè)定，其中，縱坐標(biāo)代表葉綠素含量，橫坐標(biāo)代表對(duì)擬南芥成苗的不同處理；圖7c為150mM的NaHCO₃脅迫處理后的T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11的丙二醛含量測(cè)定，其中，縱坐標(biāo)代表丙二醛含量，橫坐標(biāo)代表對(duì)擬南芥成苗的不同處理。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的野生大豆G07256種子在文獻(xiàn)“Yang Yu,Ailin Liu,Xiangbo Duan,Sunting Wang,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu,Dan Zhu,Chao Chen,Lei Cao,Jialei Xiao,Qiang Li,Zaib_un Nisa,Yanming Zhu,Xiaodong Ding.GsERF6,an ethylene-responsive factor from Glycine soja,mediates the regulation of plant bicarbonate tolerance in Arabidopsis.Planta 10.1007/s00425-016-2532-4”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實(shí)施例中的pCAMBIA330035Su載體在文獻(xiàn)“Xiaoli Sun,Wei Ji,Xiaodong Ding,Xi Bai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,Yanming Zhu.GsVAMP72,a novel Glycine soja R-SNARE protein,is involved in regulating plant salt tolerance and ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199–215”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實(shí)施例中的根癌農(nóng)桿菌GV3101在文獻(xiàn)“Lee CW,et al.Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thal iana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實(shí)施例中的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型col-0)在文獻(xiàn)“Luo X,Sun X,Liu B,et al.Ectopic expression of a WRKY homolog from Glycine soja alters flowering time in Arabidopsis[J].PloS one,2013,8(8):e73295.”中公開過，公眾可以從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

實(shí)施例1、野生大豆中耐碳酸鹽相關(guān)基因GsJ11的獲得

一、GsJ11基因的獲得

1、總RNA的提取

選取飽滿的野生大豆G07256種子，用濃H₂SO₄處理10min，無菌水沖洗3-4次，25℃暗培養(yǎng)2-3d催芽。待芽長(zhǎng)到1-2cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至1/4Hogland營養(yǎng)液中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。取3周齡野生大豆G07256幼苗的根，采用RNAprep pure試劑盒(TIANGEN)提取總RNA。

2、cDNA的獲得

以O(shè)ligodT為引物進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，方法參見Invitrogen公司SuperScript^TM III Reverse Transcriptase說明書，得到野生大豆總cDNA。

3、PCR擴(kuò)增

以野生大豆總cDNA為模板，采用引物GsJ11-FL-F和GsJ11-FL-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下：

GsJ11-FL-F：5'-ATGATTTCTTCCGTGTCC-3'；

GsJ11-FL-R：5'-CTACCAGCACTGATCCGT-3'。

4、GsJ11基因的克隆載體構(gòu)建及測(cè)序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-T載體連接，構(gòu)建pEASY-GsJ11克隆載體。并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增得到的大小為477bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為GsJ11基因，自5’端第1-477位為CDS，GsJ11基因編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)，將序列2所示的氨基酸序列命名為GsJ11蛋白。

二、GsJ11基因在野生大豆中的組織定位分析

1、植物材料的處理

取3周齡的野生大豆幼苗的如下組織：根尖、莖、新葉、老葉、種子、種莢及花，置于-80℃保存。

2、cDNA的獲得

取上述野生大豆不同組織樣品各約100mg，液氮研磨，用RNAprep Plant Kit(TIANGEN,cat no:DP432)試劑盒并參照試劑盒說明書提取RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript^TM III Reverse Transcriptase kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

3、通過Real-time PCR對(duì)GsJ11基因進(jìn)行組織等位檢測(cè)

以上述步驟2獲得的cDNA為模板，采用引物GsJ11-RT-F和GsJ11-RT-R進(jìn)行Real-time PCR，對(duì)GsJ11基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。引物序列如下所示：

GsJ11-RT-F：5’-CGCGTACTCTACTCTTTCTGATCC-3’；

GsJ11-RT-R：5’-AGCACTGATCCGTTTCCCAG-3’。

Real-time PCR采用比較CT法(ΔΔCT)計(jì)算基因表達(dá)量，以野生大豆GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因。目的基因在不同組織中的表達(dá)量差異通過GsJ11基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量相對(duì)于在根尖組織中的表達(dá)量的倍數(shù)來表示。每個(gè)樣品包括3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，如果有一個(gè)數(shù)值的偏差比較大則取兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)T-test進(jìn)行差異顯著性分析。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT處理-ΔCT對(duì)照)}＝2^{-[(CT處理目的基因-CT處理內(nèi)參基因)-(CT對(duì)照目的基因-CT對(duì)照內(nèi)參基因)]}。內(nèi)參基因引物序列如下所示：

GAPDH-RT-F：5’-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3’；

GAPDH-RT-R：5’-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3’。

目的基因的組織定位結(jié)果如圖1所示：GsJ11基因廣泛表達(dá)于野生大豆的各個(gè)組織，且在新葉和花中的表達(dá)量最高。

三、GsJ11基因在碳酸鹽脅迫條件下的表達(dá)模式分析

1、植物材料的處理

取3周齡的野生大豆幼苗，置于50mM NaHCO₃(碳酸鹽脅迫)條件下處理，分別取處理0h、1h、3h、6h和12h的根尖組織，置于-80℃保存。

2、cDNA的獲得

取經(jīng)上述處理不同時(shí)間后的野生大豆根尖組織各約100mg，液氮研磨，用RNAprep Plant Kit(TIANGEN,cat no:DP432)試劑盒并參照試劑盒說明書提取RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript^TM III Reverse Transcriptase kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

3、通過Real-time PCR對(duì)GsJ11基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)

以上述步驟2獲得的cDNA為模板，采用引物GsJ11-RT-F和GsJ11-RT-R進(jìn)行Real-time PCR，對(duì)GsJ11基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。引物序列如下所示：

GsJ11-RT-F：5’-CGCGTACTCTACTCTTTCTGATCC-3’；

GsJ11-RT-R：5’-AGCACTGATCCGTTTCCCAG-3’。

Real-time PCR采用比較CT法(ΔΔCT)計(jì)算基因表達(dá)量，以野生大豆GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，以未經(jīng)處理的樣品作為對(duì)照。目標(biāo)基因表達(dá)差異通過經(jīng)過處理的樣本相對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來表示。每個(gè)樣品包括3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，如果有一個(gè)數(shù)值的偏差比較大則取兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)T-test進(jìn)行差異顯著性分析。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT處理-ΔCT對(duì)照)}＝2^{-[(CT處理目的基因-CT處理內(nèi)參基因)-(CT對(duì)照目的基因-CT對(duì)照內(nèi)參基因)]}。內(nèi)參基因引物序列如下所示：

GAPDH-RT-F：5’-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3’；

GAPDH-RT-R：5’-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3’。

定量Real-time PCR結(jié)果如圖2所示：碳酸鹽脅迫處理后，GsJ11基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，并在碳酸鹽脅迫處理3h后達(dá)到頂峰，表明GsJ11基因的表達(dá)受碳酸鹽脅迫誘導(dǎo)。

實(shí)施例2、轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥植株的獲得及耐鹽堿性分析

一、轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥植株的獲得

1、以pEASY-GsJ11克隆載體為模板，采用基因特異引物GsJ11-U-F和GsJ11-U-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到GsJ11基因全長(zhǎng)CDS區(qū)。引物序列如下(下劃線代表載體構(gòu)建時(shí)所需的接頭序列，其中U為USER酶切位點(diǎn))：

GsJ11-U-F:5’-GGCTTAAUATGATTTCTTCCGTGTCC-3’；

GsJ11-U-R:5’-GGTTTAAUCTACCAGCACTGATCCGT-3’。

2、用限制性內(nèi)切酶PacI和Nt.BbvCI對(duì)pCAMBIA330035Su載體進(jìn)行雙酶切，得到載體酶切產(chǎn)物。將獲得的載體酶切產(chǎn)物、USER酶(NEB,M5505S)和步驟1獲得的GsJ11基因在37℃下孵育20min，利用USER酶對(duì)GsJ11基因片段的尿嘧啶處進(jìn)行切割，形成可與pCAMBIA330035Su載體互補(bǔ)的粘性末端，接著25℃下孵育20min，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(全式金，CD201-01)，得到的重組表達(dá)載體記作pCAMBIA330035Su-GsJ11，并送交測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明：pCAMBIA330035Su-GsJ11為在pCAMBIA330035Su載體中插入如序列表中序列1所示的GsJ11基因后，且保持pCAMBIA330035Su載體的其他序列不變得到的載體。pCAMBIA330035Su-GsJ11表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。

3、采用凍融法，將pCAMBIA330035Su-GsJ11載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101，獲得重組農(nóng)桿菌，并經(jīng)PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)化子(含有序列表中序列1所示的GsJ11轉(zhuǎn)化子)，用于侵染擬南芥植株。

4、轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥的獲得及鑒定

將上述重組農(nóng)桿菌通過Floral-dip法侵染野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)。將T₀代種子表面消毒后，播種于含25mg/L固殺草的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。將T₁代抗性苗移栽至營養(yǎng)缽中培養(yǎng)，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR和RT-PCR鑒定。具體步驟如下：

采用EasyPure Plant Genomic DNA Kit基因組提取試劑盒(全式金，EE111-01)，提取野生型和固殺草抗性植株的基因組DNA，用基因特異引物(GsJ11-FL-S和GsJ11-FL-AS)進(jìn)行PCR鑒定(圖3a)。對(duì)PCR鑒定陽性的植株，提取總RNA，采用半定量RT-PCR，以擬南芥ACTIN2基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)施例1中的Real-time PCR引物(GsJ11-RT-F和GsJ11-RT-R)檢測(cè)GsJ11基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量(圖4a)。ACTIN2基因特異引物序列如下：

ACTIN2-RT-F：5’-TTACCCGATGGGCAAGTC-3’；

ACTIN2-RT-R：5’-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3’。

將RT-PCR陽性的T₁代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥單株收種子，并分別播種于含25mg/L固殺草的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，觀察T₂代分離情況。如此重復(fù)，直至得到T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系。選取T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)和OE3(#3)用于下述耐碳酸鹽分析。

二、擬南芥純合突變體atj11植株的獲得和鑒定

在擬南芥信息資源中心(The Arabidopsis Information Resource center)中購買擬南芥AtJ11基因T-DNA插入的突變體種子atj11(SALK_015630C)。并采用三引物法對(duì)擬南芥突變體atj11植株進(jìn)行PCR，鑒定該突變體株系是否純合。引物序列如下：

atj11-LB：5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’；

atj11-LP：5’-TTATGGCTGCATCCCTAATTG-3’；

atj11-RP：5’-TTCTTCTCCGCCTCTATCTCC-3’。

PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3b和圖3c所示。以atj11-LB和atj11-RP為引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，突變體能擴(kuò)增出T-DNA插入片段，但是野生型植株不能擴(kuò)增出，說明T-DNA已插入到AtJ11基因內(nèi)部；以atj11-LP和atj11-RP為引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，突變體擴(kuò)增不出目的基因產(chǎn)物，但是野生型植株能擴(kuò)增出目的基因產(chǎn)物，說明在該突變體中AtJ11基因已經(jīng)被沉默，且該突變體為純合體。

分別以野生型擬南芥植株和擬南芥純合突變體atj11植株(對(duì)atj11-LP與atj11-RP引物對(duì)PCR結(jié)果陰性且atj11-LB與atj11-RP引物對(duì)PCR結(jié)果為陽性的植株)的cDNA為模板，以atj11-RT-F和atj11-RT-R為引物atj11-RT-F：5’-GAAGATCCATGCCGCTTACTG-3’和atj11-RT-R：5’-CGGAGGAAACACAGAATACCC-3’)進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果也表明擬南芥純合突變體atj11在轉(zhuǎn)錄水平上為純合突變體(圖4b)?？捎糜谙率瞿吞妓猁}分析。

三、轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥耐碳酸鹽分析

1、種子萌發(fā)期耐碳酸鹽表型分析

選取飽滿的野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11和T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的種子，用5％NaClO處理6-8min，滅菌ddH₂O沖洗6次，4℃春化3d，分別播種于正常的1/2MS培養(yǎng)基、含6mM NaHCO₃的1/2MS培養(yǎng)基、含7mM NaHCO₃的1/2MS培養(yǎng)基和8mM NaHCO₃的1/2MS培養(yǎng)基，22℃培養(yǎng)5d，觀察記錄擬南芥種子萌發(fā)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每種處理各株系采用30株植株。

結(jié)果如圖5所示，碳酸鹽脅迫嚴(yán)重抑制了野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11和T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系的種子萌發(fā)，但轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系的種子萌發(fā)速率顯著高于野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11(圖5a和圖5b)。

2、幼苗期耐碳酸鹽表型分析

選取飽滿的野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11和T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的種子，用5％NaClO處理6-8min，滅菌ddH₂O沖洗6次，4℃春化3d，播種于正常的1/2MS培養(yǎng)基，22℃培養(yǎng)11d。待擬南芥長(zhǎng)至六葉期，將幼苗分別移至正常的1/2MS培養(yǎng)基、含6mM NaHCO₃的1/2MS培養(yǎng)基和含7mM NaHCO₃的1/2MS培養(yǎng)基豎直培養(yǎng)7d。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每種處理各株系采用30株植株。

結(jié)果如圖6a至圖6c所示。當(dāng)不存在NaHCO₃脅迫時(shí)，野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11和T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系的根長(zhǎng)無顯著差異；當(dāng)NaHCO₃的濃度為6mM時(shí)，T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的根長(zhǎng)分別為4.48cm、4.51cm和4.35cm；野生型擬南芥的根長(zhǎng)為3.61cm(圖6c)；而在同樣條件下，擬南芥突變體純合株系atj11的根長(zhǎng)為2.03cm；野生型擬南芥的根長(zhǎng)為3.36cm(圖6b)。當(dāng)NaHCO₃的濃度為7mM時(shí)，T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的根長(zhǎng)分別為3.62cm、3.88cm和4.16cm；野生型擬南芥的根長(zhǎng)為2.90cm(圖6c)；而在同樣條件下，擬南芥突變體純合株系atj11的根長(zhǎng)為1.64cm；野生型擬南芥的根長(zhǎng)為2.80cm(圖6b)。從圖中和以上結(jié)果可以看出：碳酸鹽脅迫抑制了野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11和T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的根的伸長(zhǎng)(圖6a)，但T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的根長(zhǎng)要長(zhǎng)于野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11(圖6b和圖6c)。

3、成苗期耐碳酸鹽表型分析

選取飽滿的野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11和T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的種子，春化后播種于營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)土：君子蘭土：蛭石1：1：1)，置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的4周齡擬南芥植株，每3d澆灌1次150mM NaHCO₃(pH 9.0)溶液進(jìn)行鹽堿脅迫處理，觀察脅迫處理后植株表型。

結(jié)果如圖7a所示：碳酸鹽脅迫處理后野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11及T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)都逐漸失綠甚至死亡，但是T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11。

上述結(jié)果表明GsJ11基因超量表達(dá)顯著提高了植物的碳酸鹽脅迫耐性。

4、耐碳酸鹽生理指標(biāo)分析

1)葉綠素含量分析

選取步驟3中用于成苗期表型分析的野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11和T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系，待表型明顯后，取待測(cè)葉片放入EP管，稱重。用組織破碎儀震蕩成粉末，加入1mL預(yù)冷的80％丙酮，混勻，避光抽提15min；10000×g離心8min，取上清200μL并加入400μL的80％丙酮，混勻。用紫外分光光度計(jì)測(cè)在645nm和663nm處的吸光度，用80％丙酮調(diào)零，并計(jì)算葉綠素含量。

結(jié)果如圖7b所示，在碳酸氫鈉脅迫處理下，野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11和T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系的葉綠素含量均有所下降，但轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系的葉綠素含量明顯高于野生型，而野生型擬南芥的葉綠素含量則明顯高于擬南芥突變體純合株系atj11，說明GsJ11基因超量表達(dá)提高了擬南芥的耐碳酸鹽能力。

2)丙二醛含量分析

選取步驟3中用于成苗期表型分析的野生型擬南芥、擬南芥突變體純合株系atj11和T₃代轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系，待表型明顯后，取待測(cè)葉片放入EP管，稱重。用組織破碎儀震蕩成粉末，加1mL 5％的三氯乙酸(TCA)，5000×g離心10min。取上清液400μL，加入400μL 0.5％的硫代巴比妥酸溶液(TBA)，搖勻，沸水浴20min(自管中出現(xiàn)小氣泡時(shí)開始計(jì)時(shí))。將EP管取出，冷卻后，5000×g離心10min。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清液在450nm、532nm和600nm處的吸光度，并計(jì)算丙二醛含量(用等體積5％的三氯乙酸和0.5％的硫代巴比妥酸的混合液調(diào)零)。

結(jié)果如圖7c所示，在碳酸氫鈉脅迫處理下，轉(zhuǎn)GsJ11擬南芥純合體株系的丙二醛含量明顯低于野生型擬南芥和擬南芥突變體純合株系atj11，說明GsJ11基因的超量表達(dá)可以提高擬南芥的耐碳酸鹽能力。

序列表

<110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種與植物碳酸鹽脅迫耐性相關(guān)蛋白GsJ11及其編碼基因與應(yīng)用

<160>2

<210>1

<211>477bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgatttctt ccgtgtcctt tccagcgtct cttcccgccg ttaacttctc cggcaacgcc 60

gtggcttctc cgtcgtgccg cgtcaaatcc aggcctatag ttgccttcgc caccgccacc 120

gccaccgcgg aagctcgctc ttcctggacg gagcaaccga gaccttcgta tctgaactcc 180

tcttgctctt cgctctacga ggttctcggc atccccgccg gcgcctctaa ccaagaaatc 240

aaggcggcgt accggcgact ggccagagtc ttccaccccg acgtggcggc gattgaccgg 300

aaaaactcat ccgccgatga gttcatgaag atccacgctg cgtactctac tctctcggat 360

cccgacaagc gcgccaacta cgatcagagg ctcttccggc gacaacggcc gttgtcgacg 420

gcggcggtgt tctccggtta tacgcgtcgg aactgggaaa cggatcagtg ctggtag 477

<210>2

<211>158

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Ile Ser Ser Val Ser Phe Pro Ala Ser Leu Pro Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Ser Gly Asn Ala Val Ala Ser Pro Ser Cys Arg Val Lys Ser Arg Pro

20 25 30

Ile Val Ala Phe Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Glu Ala Arg Ser Ser

35 40 45

Trp Thr Glu Gln Pro Arg Pro Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Cys Ser Ser

50 55 60

Leu Tyr Glu Val Leu Gly Ile Pro Ala Gly Ala Ser Asn Gln Glu Ile

65 70 75 80

Lys Ala Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Arg Val Phe His Pro Asp Val Ala

85 90 95

Ala Ile Asp Arg Lys Asn Ser Ser Ala Asp Glu Phe Met Lys Ile His

100 105 110

Ala Ala Tyr Ser Thr Leu Ser Asp Pro Asp Lys Arg Ala Asn Tyr Asp

115 120 125

Gln Arg Leu Phe Arg Arg Gln Arg Pro Leu Ser Thr Ala Ala Val Phe

130 135 140

Ser Gly Tyr Thr Arg Arg Asn Trp Glu Thr Asp Gln Cys Trp

145 150 155