本發(fā)明涉及一種抗菌肽，該肽為人工設(shè)計(jì)合成的含30個(gè)氨基酸殘基的直鏈肽。

背景技術(shù)：

抗菌肽是一類有生物學(xué)活性的小分子多肽，通常是由12～60個(gè)氨基酸組成。富含賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸，并且通常含有高于30％的疏水性氨基酸。抗菌肽大多為兩親性且?guī)в幸欢康恼姾?，為?yáng)離子多肽。

自1928年Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，人們逐漸進(jìn)入控制和治療細(xì)菌感染性疾病的時(shí)代。然而大量廣譜抗生素的使用加速了致病菌的進(jìn)化，使得近些年大量耐藥細(xì)菌及多重耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)。目前，所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的耐藥性致病株系，致病菌的抗藥性問(wèn)題已經(jīng)日益嚴(yán)重地威脅著人們的健康?？咕囊?yàn)榭咕钚愿?，抗菌譜廣，種類多，可供選擇的范圍廣，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，而被認(rèn)為將會(huì)在醫(yī)藥工業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景。但是抗菌肽也存在一些缺點(diǎn)，主要是有些抗菌肽的溶血活性太高。還有些臨床應(yīng)用問(wèn)題，如抗菌肽的成本高、體內(nèi)有限穩(wěn)定性、微生物耐受性(膜變異)、異質(zhì)性、未知毒理和藥代動(dòng)力學(xué)等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新型的抗菌肽，它的溶血活性小，不易引起副作用。

本發(fā)明的抗菌肽序列為：

KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLF

本發(fā)明所涉及的多肽用固相合成法制備，技術(shù)成熟，產(chǎn)物質(zhì)量容易控制，能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的多肽能抑制或殺滅。

毒副作用試驗(yàn)表明本發(fā)明的多肽對(duì)綿羊紅細(xì)胞未觀測(cè)到溶血活性，說(shuō)明其溶血活性低，副作用小。

本發(fā)明的多肽也可以和藥學(xué)上可接受的鹽結(jié)合，同樣具有其藥效。這些鹽包括(但不局限于)與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽。其他鹽包括與如下無(wú)機(jī)酸形成的鹽：如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及與有機(jī)酸形成的鹽，而有機(jī)酸則指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和馬來(lái)酸。藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選鈉鹽。

本發(fā)明公開(kāi)了一種抗菌肽制成的制劑，其中含有該多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的載體。

上述多肽可以制成注射劑、片劑、注射用無(wú)菌粉末、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N劑型。上述各種劑型均可以根據(jù)藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備?？梢酝ㄟ^(guò)注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入肌肉、內(nèi)皮、皮下、靜脈、粘膜組織，或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入肌體。

一般地，本發(fā)明的使用劑量在0.001～10克/天，也可以根據(jù)疾病的情況偏離這個(gè)劑量范圍。

下面是本發(fā)明的多肽的部分藥效學(xué)試驗(yàn)及結(jié)果，所用多肽是根據(jù)以下序列，委托上海昕浩生物有限公司合成，采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相化學(xué)合成方法，即由去保護(hù)和激活交聯(lián)兩個(gè)反應(yīng)反復(fù)循環(huán)而最終將制備肽合成。使用C18制備柱，采用高效液相色譜(HPLC)法純化多肽，純度達(dá)到95％以上，并通過(guò)質(zhì)譜(MS)進(jìn)行多肽鑒定。

Peptide 1序列為(本專利保護(hù)序列)：

KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLF

Peptide 2序列為

KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLFWATGGNAGWNK

Peptide 3序列為

KYYGNGVHCGKHSCTVDILGKIWEGIKSLF-NH2

一、微量肉湯法測(cè)定MIC：

1.挑選單個(gè)菌落到10ml液體培養(yǎng)液試管中，置37℃，200轉(zhuǎn)，搖床培養(yǎng)，讓菌液生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600值約為0.5)。培養(yǎng)時(shí)間為：金黃色葡萄球菌(5-6小時(shí))、枯草芽孢桿菌(10-12小時(shí))、單核增生李斯特氏菌(10-12小時(shí))。

2.將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單核增生李斯特氏菌的種子液用培養(yǎng)基分別稀釋到OD600值為0.08-0.1之間的菌懸液。

3.在96孔板的第一個(gè)孔加入180μl稀釋的菌懸液，2-11個(gè)孔加入100μl稀釋的菌液，12孔加入無(wú)菌LB培養(yǎng)基或PYG培養(yǎng)基作為對(duì)照。

4.在第一個(gè)孔加入20μl藥物母液，混勻，取100μl至第二個(gè)孔，依次稀釋，使多肽母液一次倍比稀釋為256、128、64、32、16、8、4μg/ml。每株菌做3行平行。用頭孢呋辛代替多肽母液，作為陽(yáng)性對(duì)照；用培養(yǎng)基代替多肽母液，作為陰性對(duì)照。

5.置于37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD595值，觀察菌體生長(zhǎng)情況。

6.以不生長(zhǎng)細(xì)菌的最小藥物濃度作為MIC值。

抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表1～表3所示，+號(hào)表示孔內(nèi)有菌生長(zhǎng)，一號(hào)表示孔內(nèi)沒(méi)有菌生長(zhǎng)。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出Peptide 1對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、李斯特氏菌都有一定的抑菌效果，MIC在32～64μg/ml；Peptide 2對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有弱的抑制效果，MIC在64～256μg/ml，但對(duì)李斯特氏菌沒(méi)有抑制效果；Peptide 3對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、李斯特氏菌的抑菌效果相對(duì)較高，MIC在16μg/ml；

表1 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

表2 對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果

表3 對(duì)李斯特氏菌的抑菌效果

二、溶血毒性試驗(yàn)

1、紅細(xì)胞懸液的制備：取脫纖維的綿羊血紅細(xì)胞10ml，加入離心管中，加入10ml生理鹽水洗滌后離心，離心力設(shè)定為3000g，離心3min，取出后棄上清，留底部細(xì)胞，反復(fù)洗滌直到上清液不顯紅色之后棄去上清液，吸取2ml下層沉淀物，加入生理鹽水稀釋至100ml，配成2％的紅細(xì)胞懸浮。

2、藥液準(zhǔn)備：稱樣配置濃度為2560μg/ml的多肽母液500ml，依次稀釋，最后獲得濃度分別為256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml的多肽溶液。另準(zhǔn)備3個(gè)EP管，一個(gè)加600μl生理鹽水作底色管，一個(gè)加300μl蒸餾水做陽(yáng)性對(duì)照管，另一個(gè)加300μl生理鹽水作陰性對(duì)照管。

3、將各EP管放到37℃恒溫鍋中孵育30min后，取不同濃度的多肽藥液300μl分別和300μl紅細(xì)胞懸液混勻，陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管也分別加入300μl紅細(xì)胞懸液混勻。放到37℃恒溫鍋中孵育1小時(shí)。

4、取出EP管，用6000rpm轉(zhuǎn)速離心5min，離心完成后肉眼觀察上清，取上清液100μl加入96孔板中，至酶標(biāo)儀570nm測(cè)OD值。獨(dú)立三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

5、計(jì)算溶血度。溶血度計(jì)算公式：樣品吸光度＝式樣管吸光度-底色管吸光度；溶血度＝(樣品吸光度-陰性對(duì)照吸光度)/(陽(yáng)性對(duì)照吸光度-陰性對(duì)照吸光度)×100％

6、溶血度大于5％的濃度標(biāo)注為溶血

溶血毒性試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，一號(hào)表示未觀測(cè)到溶血，+表示觀測(cè)到溶血。Peptide 1在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)不會(huì)引起綿羊紅細(xì)胞溶血，Peptide 2在128μg/ml濃度下會(huì)引起溶血，溶血度為7.86％，Peptide 3在32μg/ml濃度下有毒性，溶血度為23.82％；

表4 多肽對(duì)綿羊血的溶血毒性結(jié)果

上述試驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明，雖然Peptide 3抑菌活性較高，但是它的毒副作用較大，在32μg/ml濃度下有就能引起綿羊紅細(xì)胞溶血，不能作為抑菌藥物口服或注射。而Peptide 1不會(huì)引起紅細(xì)胞溶血，對(duì)金黃色葡萄球菌等又有較好的抑菌效果，作為本專利保護(hù)的多肽。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

含抗菌肽抑菌溶液的制備

根據(jù)Peptide 1所示序列，委托上海昕浩生物有限公司合成多肽，稱取64mg多肽，溶于500ml去離子水中，加入100ml甘油，20ml無(wú)水乙醇，攪拌均勻后，補(bǔ)充去離子水到1000ml。該抑菌溶液可以用于手部、面部的清潔，加入的甘油還可以起到保濕防凍的作用。

實(shí)施例2

含抗菌肽的漱口水制備

稱取32mg多肽，溶于500ml去離子水中，加入10g木糖醇，1滴丁香精油，20ml無(wú)水乙醇，10ml甘油，攪拌均勻后，補(bǔ)充去離子水到1000ml。該漱口水具有丁香的清香，其中含有的抗菌肽可以有效抑制口腔中的細(xì)菌，維持口氣的清新。

實(shí)施例3

含抗菌肽的藥物組合物的制備(膠囊)

按照100個(gè)膠囊的用量，稱取以上各輔料分別研細(xì)過(guò)篩后混合均勻，然后用等量遞加法加入抗菌肽Peptide 1，充分研磨，使其分散均勻，再過(guò)80目篩，然后灌制成膠囊。