本發(fā)明涉及染色體缺失檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種Y染色體微缺失檢測試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

據(jù)估計不育癥困擾著世界上超過10％的育齡夫婦,其中男性因素占了一半。引起男性不育的病因有很多,包括感染、生殖器官畸形、免疫功能異常、精索靜脈曲張、勃起機能障礙、藥物損傷以及染色體異常等。男性不育常伴隨著精子數(shù)量減少,國內(nèi)學(xué)者已對其進(jìn)行了大量相關(guān)研究。Y染色體長臂無精子癥因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失是導(dǎo)致男性生精障礙主要的遺傳學(xué)因素之一。研究表明,亞洲地區(qū)男性不育患者中AZF微缺失的發(fā)生率在2％～19.4％之間,與研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)、序列標(biāo)簽位點(Sequence Tag Site，STS)的選擇、人群分布及遺傳背景有關(guān)。AZF區(qū)微缺失的患者極少有自然生育能力,但近年來睪丸取精(Testicular sperm extraction,TESE)和卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技術(shù)的發(fā)展,給無精子癥、少精子癥患者能夠生育帶來了希望,但也增加了將微缺失傳遞給下一代的風(fēng)險。因此,對男性不育患者盡早進(jìn)行Y染色體微缺失篩查有著重要意義,不僅可以明確患者真正病因,避免不必要的檢查及無效的治療,還可預(yù)知或者防止遺傳缺陷的傳遞。Y染色體微缺失一般在染色體核型分析時不易發(fā)現(xiàn)，目前主要通過AZF區(qū)域的序列標(biāo)簽位點來診斷，根據(jù)歐洲男科協(xié)會建議的六個STS位點進(jìn)行Y染色體微缺失的分析，即AZFa亞區(qū)sY84和sY86位點，Y染色體AZFb亞區(qū)sY127和sY134位點，Y染色體AZFc亞區(qū)sY254和sY255位點，對上述位點的分析，Y染色體微缺失的檢測準(zhǔn)確率可以達(dá)到95％。

目前應(yīng)用于檢測Y染色體微缺失的技術(shù)主要為通過PCR方法對Y染色體AZF區(qū)域的序列標(biāo)簽位點進(jìn)行特異性擴增，再用電泳或Southern blot雜交等方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，這兩種檢測方法雖技術(shù)成熟，但同時也都存在缺陷，電泳檢測的方法準(zhǔn)確率不高、靈敏度低，Southern blot雜交方法耗時耗力、成本較高且操作繁瑣。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種Y染色體微缺失檢測試劑盒及方法。

本發(fā)明根據(jù)歐洲男科協(xié)會建議的六個STS位點和SRY及ZFY內(nèi)參基因設(shè)計特異性引物和探針，通過Taqman熒光PCR法對其進(jìn)行多重檢測，可以快速、準(zhǔn)確地檢測Y染色體微缺失。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提供一種用于Y染色體微缺失檢測的引物和探針，所述引物和探針包括8組，可同時擴增檢測Y染色體微缺失的六個STS位點和SRY及ZFY內(nèi)參基因,所述引物探針組合包括用于檢測SY84位點的引物探針組合、用于檢測SY86位點的引物探針組合、用于檢測SY127位點的引物探針組合、用于檢測SY134位點的引物探針組合、用于檢測SY254位點的引物探針組合、用于檢測SY255位點的引物探針組合、用于檢測SRY內(nèi)參基因的引物探針組合以及用于檢測ZFY內(nèi)參基因的引物探針組合，其中：

用于檢測SY84位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:1，下游引物為SEQ ID NO:2，特異性熒光探針為SEQ ID NO:3；

用于檢測SY86位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:4，下游引物為SEQ ID NO:5，特異性熒光探針為SEQ ID NO:6；

用于檢測SY127位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:7，下游引物為SEQ ID NO:8，特異性熒光探針為SEQ ID NO:9；

用于檢測SY134位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:10，下游引物為SEQ ID NO:11，特異性熒光探針為SEQ ID NO:12；

用于檢測SY254位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:13，下游引物為SEQ ID NO:14，特異性熒光探針為SEQ ID NO:15；

用于檢測SY255位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:16，下游引物為SEQ ID NO:17，特異性熒光探針為SEQ ID NO:18；

用于檢測SRY基因的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:19，下游引物為SEQ ID NO:20，特異性熒光探針為SEQ ID NO:21；

用于檢測ZFY基因的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:22，下游引物為SEQ ID NO:23，特異性熒光探針為SEQ ID NO:24。

所述的該試劑盒中反應(yīng)液分為反應(yīng)液I和反應(yīng)液II，其中反應(yīng)液I中含有檢測SY84位點、SY127位點、SY255位點、SRY和ZFY基因的引物探針組合，其中反應(yīng)液II中含有SY86位點、SY134位點、SY254位點、SRY和ZFY基因的引物探針組合。

所述的PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II中SRY和ZFY基因的引物探針組合用于質(zhì)控。

所述的PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II中用于檢測SY84位點、SY86位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY基因的引物濃度均為200nM，探針濃度均為100nM，用于檢測SY127位點、SY134位點的引物濃度均為200nM，探針濃度均為300nM。

所述的PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II中還包含有MgCL₂、Taq酶、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、UDG酶、10×PCR Buffer。

所述的MgCL₂反應(yīng)終濃度為4.5mM。

所述的Taq酶反應(yīng)終濃度為5U。

所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反應(yīng)終濃度為0.5mM。

所述的UDG酶反應(yīng)終濃度為0.3U。

所述的10×PCR Buffer反應(yīng)終濃度為1×PCR Buffer。

進(jìn)一步的本發(fā)明采用Taqman熒光探針PCR技術(shù)對Y染色體微缺失進(jìn)行五重?zé)晒鈾z測。

本發(fā)明的有益效果是：本試劑盒和方法采用實時熒光定量PCR結(jié)合Taqman探針對Y染色體微缺失SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點進(jìn)行多重?zé)晒鈾z測，內(nèi)參基因SRY和ZFY基因檢測的加入可有效控制本發(fā)明試劑盒和方法對Y染色體微缺失檢測結(jié)果的有效性，該方法操作簡單、檢測通量高、快速、靈敏度高且特異性強，可有效縮短檢測周期和成本。

附圖說明

圖1為PCR反應(yīng)液I中SY84、SY127、SY255位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖2為PCR反應(yīng)液II中SY86、SY134、SY254位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖3為PCR反應(yīng)液I中SY127、SY255位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖4為PCR反應(yīng)液II中SY134、SY254位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖5為PCR反應(yīng)液I中SY84、SY255位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖6為PCR反應(yīng)液II中SY86、SY254位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖7為PCR反應(yīng)液I中SY84、SY127位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖8為PCR反應(yīng)液II中SY86、SY134位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線。

具體實施方式

本發(fā)明采用五重?zé)晒釶CR方法分兩管對Y染色體微缺失進(jìn)行檢測，檢測位點包括SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點，其中PCR反應(yīng)液I檢測位點為SY84位點、SY127位點、SY255位點和SRY以及ZFY內(nèi)參基因，其中PCR反應(yīng)液II檢測位點為SY86位點、SY134位點、SY254位點、SRY和ZFY內(nèi)參基因，陽性對照采用正常已育男性DNA樣本，陰性對照采用女性DNA樣本，空白對照采用滅菌水以防止體系被污染。

用于檢測SY84位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:1，下游引物為SEQ ID NO:2，特異性熒光探針為SEQ ID NO:3；

用于檢測SY86位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:4，下游引物為SEQ ID NO:5，特異性熒光探針為SEQ ID NO:6；

用于檢測SY127位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:7，下游引物為SEQ ID NO:8，特異性熒光探針為SEQ ID NO:9；

用于檢測SY134位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:10，下游引物為SEQ ID NO:11，特異性熒光探針為SEQ ID NO:12；

用于檢測SY254位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:13，下游引物為SEQ ID NO:14，特異性熒光探針為SEQ ID NO:15；

用于檢測SY255位點的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:16，下游引物為SEQ ID NO:17，特異性熒光探針為SEQ ID NO:18；

用于檢測SRY基因的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:19，下游引物為SEQ ID NO:20，特異性熒光探針為SEQ ID NO:21；

用于檢測ZFY基因的引物探針組合中上游引物為SEQ ID NO:22，下游引物為SEQ ID NO:23，特異性熒光探針為SEQ ID NO:24。

所述的SY84位點、SY86位點引物探針組合用于檢測Y染色體AZFa區(qū)域是否存在缺失情況。

所述的SY127位點、SY134位點引物探針組合用于檢測Y染色體AZFb區(qū)域是否存在缺失情況。

所述的SY254位點、SY255位點引物探針組合用于檢測Y染色體AZFc區(qū)域是否存在缺失情況。

所述的SRY和ZFY基因的引物探針組合用于質(zhì)控，檢測反應(yīng)體系即過程是否正常及檢測結(jié)果可使用性。

所述的PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II中用于檢測SY84位點、SY86位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY基因的引物濃度均為200nM，探針濃度均為100nM，用于檢測SY127位點、SY134位點的引物濃度均為200nM，探針濃度均為300nM。

所述的PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II中還包含有MgCL₂、Taq酶、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、UDG酶、10×PCR Buffer。

所述的MgCL₂反應(yīng)終濃度為4.5mM。

所述的Taq酶反應(yīng)終濃度為5U。

所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反應(yīng)終濃度為0.5mM。

所述的UDG酶反應(yīng)終濃度為0.3U。

所述的10×PCR Buffer反應(yīng)終濃度為1×PCR Buffer。

本發(fā)明所述的Y染色體微缺失檢測包括以下步驟：

1.基因組DNA的提?。嚎赏ㄟ^柱式提取方法或Chelex法對EDTA抗凝全血或口腔拭子等來源的樣本進(jìn)行DNA提取。

2.熒光PCR擴增檢測：所述的多重?zé)晒釶CR擴增檢測包括本發(fā)明的PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II同時對待檢樣本DNA和陽性對照、陰性對照以及空白對照進(jìn)行擴增檢測。

3.PCR擴增檢測反應(yīng)條件：37℃5min；95℃5min；95℃15S，60℃60S,40cycles。

4.結(jié)果分析：根據(jù)擴增曲線的有無判斷對應(yīng)的SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點有無缺失。

實施例1

1.組DNA的提取：常規(guī)柱式提取方法或Chelex法提取200μl抗凝全血DNA作為模板。

2.熒光PCR擴增檢測：以PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II同時對樣本DNA和陽性對照、陰性對照以及空白對照進(jìn)行擴增檢測，其中PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II中用于檢測SY84位點、SY86位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY基因的引物濃度均為200nM，探針濃度均為100nM，用于檢測SY127位點、SY134位點的引物濃度均為200nM，探針濃度均為300nM。MgCL₂反應(yīng)終濃度為4.5mM,Taq酶反應(yīng)終濃度為5U,dUTP、dATP、dCTP、dGTP反應(yīng)終濃度為0.5mM,UDG酶反應(yīng)終濃度為0.3U,10×PCR Buffer反應(yīng)終濃度為1×PCR Buffer，樣本基因組DNA、陽性對照、陰性對照、空白對照均加入5μl，加去離子水補足體積至50μl。引物探針信息如下：

SY84上游引物為5’-AGGCAGACACTAAAGAAAGGGTCCCA-3’(SEQ ID NO:1)

SY84下游引物為5’-AAAGAGAAGGGTCCTGAAAGCA-3’(SEQ ID NO:2)

SY84探針為5’-JOE-AGGCAAGCCCTTGAGCAAATTCCCT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:3)

SY86上游引物為5’-GTGACACACAGACTATGCTTC-3’(SEQ ID NO:4)

SY86下游引物為5’-ACACACAGAGGGACAACCCT-3’(SEQ ID NO:5)

SY86探針為5’-JOE-TACAAAGAAATCCCAAAGACTGGGCCCCT-BHQ1-3’(SEQ ID NO:6)

SY127上游引物為5’-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3’(SEQ ID NO:7)

SY127下游引物為5’-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3’(SEQ ID NO:8)

SY127探針為5’-TAMRA-CAGCTTGTTTCCTTATATGGGTGAGCCAGAT-BHQ2-3’(SEQ ID NO:9)

SY134上游引物為5’-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3’(SEQ ID NO:10)

SY134下游引物為5’-CATCATGCTATGCACTTCAGAAACT-3’(SEQ ID NO:11)

SY134探針為5’-TAMRA-AACATCTGGAACATTCTACTTGAAGCGTTCTGT-BHQ2-3’(SEQ ID NO:12)

SY254上游引物為5’-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3’(SEQ ID NO:13)

SY254下游引物為5’-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3’(SEQ ID NO:14)

SY254探針為5’-FAM-TCATGAACAATGGGATGTGGGCCCTGT-3’(SEQ ID NO:15)

SY255上游引物為5’-TGCTGAGTTACAGGATTCGGC-3’(SEQ ID NO:16)

SY255下游引物為5’-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3’(SEQ ID NO:17)

SY255探針為5’-FAM-CGCAGACGTTCTGAAACTGTGGTGGAGGA-3’(SEQ ID NO:18)

SRY基因上游引物為5’-CCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGTA-3’(SEQ ID NO:19)

SRY基因下游引物為5’-ATTCTGGGATTCTCTAGAGCCATCT-3’(SEQ ID NO:20)

SRY基因探針為5’-ROX-AACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA-3’SEQ(ID NO:21)

ZFY基因上游引物為5’-AAGTTTACATAACCACCTGGAGAGC-3’(SEQ ID NO:22)

ZFY基因下游引物為5’-CCACACTCCACACAAATATGAGGAA-3’(SEQ ID NO:23)

ZFY基因探針為5’-CY5-CGCCACCTCTTGGCAGTCCACAGCAA-3’(SEQ ID NO:24)

PCR擴增檢測反應(yīng)條件：37℃5min；95℃5min；95℃15S，60℃60S,40cycles。

3.結(jié)果分析：

(1)檢測結(jié)果可用條件：PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II中待檢樣本和陽性對照內(nèi)參基因SRY和ZFY均可檢測出熒光信號，曲線拐點清楚，陽性對照SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點均可檢測出熒光信號，曲線拐點清楚,陰性對照只有ZFY檢測出熒光信號，空白對照無擴增曲線，所有擴增檢測曲線Ct值應(yīng)處于17至32之間為正常，否則實驗失敗。

(2)對不同檢測通道設(shè)置不同顏色，并根據(jù)不同通道擴增檢測結(jié)果判定相應(yīng)位點是否存在缺失情況。

圖1-2為正常男性樣本檢測結(jié)果，其中SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY內(nèi)參基因均有擴增曲線，陰性對照和空白對照無擴增曲線，陽性對照各檢測通道均有擴增曲線，表明該樣本檢測成功，檢測過程無污染，該樣本無Y染色體微缺失。

圖3-4為一不育男性樣本，其中SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY內(nèi)參基因均有擴增曲線，陰性對照和空白對照無擴增曲線，陽性對照各檢測通道均有擴增曲線，表明該樣本檢測成功，檢測過程無污染，該樣本Y染色體存在SY84位點、SY86位點微缺失，其中圖3顯示SY84位點缺失,圖4顯示SY86位點缺失。

圖5-6為一不育男性樣本，其中SY84位點、SY86位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY內(nèi)參基因均有擴增曲線，陰性對照和空白對照無擴增曲線，陽性對照各檢測通道均有擴增曲線，表明該樣本檢測成功，檢測過程無污染，該樣本Y染色體存在SY127位點、SY134位點微缺失，其中圖5顯示SY127位點缺失，圖6顯示SY134位點缺失。

圖7-8為一不育男性樣本，其中SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SRY和ZFY內(nèi)參基因均有擴增曲線，陰性對照和空白對照無擴增曲線，陽性對照各檢測通道均有擴增曲線，表明該樣本檢測成功，檢測過程無污染，該樣本Y染色體存在SY254位點、SY255位點微缺失，其中圖7顯示SY254位點缺失，圖8顯示SY255位點缺失。

本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合Taqman探針的多重?zé)晒釶CR方法對Y染色體微缺失進(jìn)行檢測的試劑盒和方法。實時熒光PCR通過對模板的擴增并對每一擴增循環(huán)產(chǎn)生的熒光信號進(jìn)行收集，從而實現(xiàn)對起始模板的定量及定性分析。本發(fā)明通過兩組反應(yīng)液即PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II對SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點進(jìn)行定性檢測，PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液II均同時檢測SRY和ZFY內(nèi)參基因作為質(zhì)控，以正常男性樣本作為陽性對照，以女性樣本作為陰性對照，滅菌水作為空白對照以檢測體系是否污染現(xiàn)象。

在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。