專利名稱：檢測(cè)染色體病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過定量比較表明未知樣品中可能丟失或明顯突變的整條染色體和/或染色體中某區(qū)段的拷貝數(shù)，并將這些結(jié)果與正常樣品作比較來檢測(cè)非整倍性和突變，特別是微小缺失。更具體地說，本發(fā)明涉及胎兒染色體病，例如非整倍性，包括三體性21(唐氏綜合征)、三體性13、三體性18，和男女性染色體異常，和微小缺失綜合征，包括貓叫綜合征、威廉斯綜合征(Williams-Beuren syndrome)和迪喬治綜合征與其它類似疾病的產(chǎn)前檢測(cè)。
背景技術(shù)：
非整倍性是染色體突變的一種常見形式，其中細(xì)胞中各染色體數(shù)目比正常細(xì)胞中的數(shù)目增加或減少?；パa(bǔ)的二倍體(diploid complement)中缺少一條染色體稱為單體性，而存在額外的一條染色體稱為三體性。三體性21是存在一條額外的染色體21，它是非整倍性最常見的形式，導(dǎo)致唐氏綜合征，一種潛在的嚴(yán)重智力遲滯的先天性疾病。
當(dāng)存在適應(yīng)癥時(shí)，聯(lián)用核型與羊水或絨毛膜絨毛樣品作產(chǎn)前染色體病診斷已成為全世界高度發(fā)達(dá)國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)方法。核型是能特征鑒定互補(bǔ)染色體狀態(tài)指征的集合；包括染色體總數(shù)、各型染色體的拷貝數(shù)和染色體形態(tài)。一般通過染色中期(或凝聚的)染色體來測(cè)定核型。因?yàn)橹敝两鼇矸至验g期染色體因其分散狀態(tài)和對(duì)染色技術(shù)不靈敏而無法目測(cè)，所以常用中期染色體。中期染色體可采用多種細(xì)胞學(xué)技術(shù)染色，染色后顯示為縱向區(qū)段，通常稱為條帶。各染色體的帶型是獨(dú)特的，從而可明確鑒定含有任何異常的染色體。然而，這種分析需要培養(yǎng)細(xì)胞并制備高質(zhì)量的中期染色體，可能要花1-3周。
有人試圖不經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞來分析染色體，美國(guó)專利號(hào)5,447,841描述了一種這樣的方法。利用與存在于未培養(yǎng)的間期羊水細(xì)胞上的染色體特異性DNA靶(序列)的熒光原位雜交(FISH)獲得了快速的部分核型分析。在該方法中，熒光標(biāo)記的探針與結(jié)合在固體支持物上的染色體的互補(bǔ)位點(diǎn)雜交。該方法克服了常規(guī)細(xì)胞學(xué)染色方法因缺乏足夠特異性的染色體染色所致的限制；提供了含有標(biāo)記核酸片段的異質(zhì)性混合物的試劑，該試劑可與特定染色體、染色體的特定亞組或特定染色體的特定亞區(qū)的DNA雜交。雖然FISH方法開創(chuàng)了能快速且高靈敏度地檢測(cè)中期和間期細(xì)胞染色體病的可能性，但它還是有一些缺點(diǎn)1)許多微小缺失相關(guān)的染色體病因缺乏信號(hào)靈敏度而仍需要中期染色體和2)許多可同時(shí)診斷的染色體受限于熒光顯微鏡濾片分辨率。此外，進(jìn)行FISH方法需要高度熟練的技術(shù)人員和昂貴的儀器與試劑。
通過共同擴(kuò)增第二種無關(guān)模板的PCR來定量測(cè)定cDNA種類的方法已有描述，參見Rappolee，D.A.等，Science，241708-712，(1988)。該方法極其依賴某些變量，包括循環(huán)次數(shù)和各種起始mRNA的用量。即使充分控制這些變量，也不可能精確地使無關(guān)對(duì)照模板的擴(kuò)增速率與未知模板相同。兩種模板擴(kuò)增速率中微小的差異在PCR期間被放大，從而非?？赡芨吖阑虻凸浪玫淖罱K試驗(yàn)中存在的未知模板的含量。
Amhelm，Norman等，在“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”，Chemical & EngineeringNews，36-47，(1990年10月1日)中報(bào)導(dǎo)說PCR已用于遺傳疾病的產(chǎn)前診斷來分析胎兒DNA以確定其是否含有可導(dǎo)致該疾病的突變形式的基因。PCR擴(kuò)增后，利用標(biāo)記探針測(cè)試PCR樣品中是否存在導(dǎo)致疾病的等位基因。其報(bào)導(dǎo)說可在一份樣品中測(cè)定是否存在幾種不同的導(dǎo)致(疾病)的基因。該報(bào)道還表明在利用斑點(diǎn)印跡方式發(fā)現(xiàn)病原的檢測(cè)方法中，PCR檢測(cè)方法已利用了基于酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)和熒光物質(zhì)的報(bào)導(dǎo)物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣在尼龍膜上，然后使攜帶點(diǎn)樣斑的該膜與能和感興趣PCR產(chǎn)物特異性退火的單鏈DNA探針接觸，所述探針經(jīng)放射性標(biāo)記或用可被熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)檢測(cè)的分子來標(biāo)記。該方法的局限是一次(只能)篩檢一種分析物。所描述的另一種方法是通過PCR在不干擾引物與靶(分子)退火或被聚合酶延伸的能力的核苷酸側(cè)鏈中加入一標(biāo)記來標(biāo)記病原特異性產(chǎn)物本身。(該方法)提到了可通過一短的接頭臂將引物的5端或引物序列內(nèi)的堿基之一與熒光染料，例如熒光素或維生素(生物素)連接而監(jiān)測(cè)。然后提出合適的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物制備后，可用連接于固體支持物的非標(biāo)記病原特異性探針“捕獲”來檢測(cè)該產(chǎn)物。由Cetus Corporation開發(fā)的該備選方法稱為反向斑點(diǎn)印跡法。將所有過量的標(biāo)記引物等洗去后，通過與細(xì)菌蛋白質(zhì)鏈霉親和素結(jié)合，然后用酶處理來檢測(cè)是否存在分析物。所提出的另一種捕獲(方法)是用熒光染料標(biāo)記一種引物，用生物素標(biāo)記另一種引物，然后用鏈霉親和素捕獲雙鏈產(chǎn)物并檢測(cè)熒光。(該文獻(xiàn))提到此捕獲方法可利用不同的具體病原引物組(其中一種引物被標(biāo)記)來同時(shí)檢測(cè)不同的診斷性序列。(該文獻(xiàn))提出使總的PCR產(chǎn)物與具有不同區(qū)域的合適尼龍膜支持物雜交，其中每個(gè)區(qū)域含有對(duì)一種病原的PCR產(chǎn)物特異性捕獲探針。雜交后用嚴(yán)謹(jǐn)條件洗滌支持物，如果標(biāo)記物是生物素，可依次加入鏈霉親和素-酶復(fù)合物與合適的酶底物在該特定區(qū)域中產(chǎn)生顏色而表明是否存在一種病原體。(該文獻(xiàn))提出此方法優(yōu)于包括多步操作的原始斑點(diǎn)印跡法，因?yàn)楹笳咝枰诓煌碾s交實(shí)驗(yàn)中用各種標(biāo)記的病原特異性探針來測(cè)試未標(biāo)記的不同PCR產(chǎn)物的等份試樣。
授予Bunn等的美國(guó)專利號(hào)5,213,961公開了采用競(jìng)爭(zhēng)性方法的定量PCR法，其中討論了影響DNA擴(kuò)增的參數(shù)和區(qū)分模板(測(cè)試和對(duì)照)比值與拷貝數(shù)差異的機(jī)制。(該文獻(xiàn))提出此方法可用于檢測(cè)體細(xì)胞突變。Bunn等闡述了主要由DNA引物和它們各自的引物結(jié)合位點(diǎn)性質(zhì)所致的各種參數(shù)對(duì)擴(kuò)增方法的影響；然而，該系統(tǒng)的局限在于利用了與靶(分子)足夠接近的標(biāo)準(zhǔn)品從而使PCR以相同速率共同擴(kuò)增靶(分子)和樣品。此外，標(biāo)準(zhǔn)品必須不同于靶(分子)而可在以后通過酶促作用改變其長(zhǎng)度，進(jìn)而通過電泳分離并定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和靶(分子)。
PCT公布的申請(qǐng)WO 94/03638公開了利用存在于染色體DNA中的短串聯(lián)重復(fù)性DNA序列和用于擴(kuò)增該短串聯(lián)重復(fù)性序列的PCR方法來檢測(cè)非整倍性的其它方法。
授予Han的美國(guó)專利5,888,740在PCR反應(yīng)期間利用經(jīng)工程改造作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的DNA模板來定量測(cè)定基因組DNA的水平。設(shè)計(jì)的這些對(duì)照DNA模板具有與測(cè)試樣品DNA模板相同的PCR反應(yīng)引物序列。擴(kuò)增的目標(biāo)是以相同的速率進(jìn)行，從而可控制擴(kuò)增速率。然而，該方法每種染色體需要特定的內(nèi)部對(duì)照，因而是復(fù)雜。此外，各染色體的PCR反應(yīng)必須在微滴定板的不同孔中或其它容器中進(jìn)行。
授予Carey的美國(guó)專利號(hào)6,551,783說明了一種基于在同時(shí)PCR試驗(yàn)中定量測(cè)定兩種靶基因表達(dá)的方法，該試驗(yàn)所用的系統(tǒng)中熒光標(biāo)記或報(bào)導(dǎo)探針從被擴(kuò)增的DNA鏈上取代，其方式是熒光探針離開了鄰近的猝滅染料。通過利用兩種不同的熒光探針，可同時(shí)進(jìn)行兩種基因的多重PCR。一種靶基因是普遍表達(dá)的標(biāo)記基因，例如GAPDH或DAD-1。所述方法局限在于一次(只能進(jìn)行)一種未知靶(基因)的測(cè)定。
WO 94/23023所述的另一方法根據(jù)對(duì)某靶基因、看家基因和它們的含有突變(例如，點(diǎn)突變、插入或缺失)的競(jìng)爭(zhēng)性模板進(jìn)行多重PCR來定量測(cè)定該靶基因。此方法復(fù)雜且費(fèi)事，在最后的分析中還要利用凝膠電泳。
就同時(shí)篩檢多種疾病而言，上述篩檢染色體疾病的方法無一令人完全滿意，因此仍要找尋易于使用且能快速提供結(jié)果的綜合性篩檢方法。
發(fā)明概述本發(fā)明聯(lián)用了基因組DNA的多重PCR與能和PCR產(chǎn)物雜交的可定量微陣列平臺(tái)，通過提供以下優(yōu)點(diǎn)克服了目前方法的缺點(diǎn)1)可同時(shí)覆蓋非整倍性和突變，特別是微小缺失的綜合性篩檢；2)24-48小時(shí)內(nèi)快速出結(jié)果；和3)便于使用。采用規(guī)則(rule-based)的診斷算法來解釋微陣列的圖像模式提高了定量測(cè)定結(jié)果的精確性。本發(fā)明提供能快速、精確、簡(jiǎn)便和廉價(jià)地檢測(cè)染色體病的試劑盒與方法，這些試劑盒與方法可用于同時(shí)檢測(cè)非整倍性(包括三體性21、三體性13、三體性18和性染色體，例如X染色體異常)和微小缺失，包括威廉斯綜合征、貓叫綜合征、迪喬治綜合征、普-韋綜合征和安格曼綜合征(Angelman syndrome)(二者涉及染色體15的部分缺失)、卡爾曼綜合征和類固醇硫酸酯酶綜合征。
更具體地說，本發(fā)明提供利用PCR、與染色體特異性探針的雜交(反應(yīng))和診斷(方法)來產(chǎn)前檢測(cè)唐氏綜合征與其它非整倍性和染色體病的試劑盒與方法。通過利用規(guī)則算法改進(jìn)了診斷結(jié)果。
在一具體方面，本發(fā)明提供在一次試驗(yàn)中檢測(cè)多種染色體病任一種的方法，所述方法包括以下步驟(a)在容器中混合以下組分來制備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合物(i)真核基因組DNA；(ii)多對(duì)正向和反向DNA引物寡核苷酸，其中所述每對(duì)的一條引物與該真核DNA的第一DNA鏈靶區(qū)段的3序列互補(bǔ)，另一條引物與該靶區(qū)段第二鏈的3序列互補(bǔ)，真核該DNA區(qū)段的長(zhǎng)度約為50和約300個(gè)堿基對(duì)之間，所述每對(duì)引物的一條在其5末端連接有可檢測(cè)標(biāo)記，多對(duì)引物各自靶向于所選擇的感興趣不同染色體的某區(qū)段，該區(qū)段是潛在染色體病的指標(biāo)，和一對(duì)靶向于對(duì)照基因的區(qū)段；和(iii)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的PCR緩沖液和酶；(b)進(jìn)行約5到約60輪溫度循環(huán)PCR以產(chǎn)生擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；(c)純化步驟(b)的所述產(chǎn)物，獲得含有可檢測(cè)標(biāo)記的單鏈DNA；(d)使微陣列與步驟(c)的產(chǎn)物接觸，所述微陣列具有多個(gè)斑點(diǎn)，各斑點(diǎn)含有DNA寡核苷酸探針，該探針的核苷酸序列與所述各靶區(qū)段的所述鏈之一的核苷酸序列互補(bǔ)；(e)使所述DNA寡核苷酸探針與所述PCR-擴(kuò)增的含標(biāo)記單鏈產(chǎn)物雜交；(f)通過拍攝該微陣列圖像來檢測(cè)是否存在能與該微陣列雜交的PCR-擴(kuò)增產(chǎn)物及其相對(duì)含量；和(g)通過將所述微陣列上所選擇染色體的所述各靶區(qū)段相關(guān)斑點(diǎn)的圖像與所述對(duì)照基因相關(guān)斑點(diǎn)的圖像作比較，然后與已知的正?；蚪MDNA的類似測(cè)試所得結(jié)果作比較，來診斷是否存在與一種或多種所選擇的不同染色體有關(guān)的染色體病。
在另一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)染色體病的試劑盒，該試劑盒包括檢測(cè)染色體疾病的試劑盒，所述試劑盒裝有(a)在擴(kuò)增哺乳動(dòng)物基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中用作引物的多對(duì)DNA寡核苷酸，其中每對(duì)寡核苷酸的一條引物與哺乳動(dòng)物基因組DNA靶區(qū)段第一鏈的3核苷酸序列互補(bǔ)，每對(duì)寡核苷酸的另一條引物與該靶DNA區(qū)段第二鏈的3寡核苷酸序列互補(bǔ)，每對(duì)所述引物的一條5端共價(jià)連接有可檢測(cè)標(biāo)記；所述多對(duì)DNA引物靶向所選的感興趣的不同染色體的擴(kuò)增區(qū)段，該區(qū)段是潛在染色體病的指標(biāo)，和所述一對(duì)靶向?qū)φ栈驍U(kuò)增區(qū)段的引物；(b)進(jìn)行(i)PCR，(ii)DNA-DNA雜交和洗滌，和(iii)比色法定量測(cè)定所需的緩沖液和酶；(c)至少一個(gè)具有多個(gè)斑點(diǎn)的微陣列，至少一個(gè)所述斑點(diǎn)連接有與各靶基因組DNA區(qū)段的攜帶標(biāo)記的擴(kuò)增鏈相互補(bǔ)的DNA序列；和(d)利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和微陣列上各斑點(diǎn)之間雜交反應(yīng)產(chǎn)生的圖像強(qiáng)度來診斷染色體病的裝置，所述裝置利用了正?；蚪MDNA類似檢測(cè)產(chǎn)生的圖像。
在還有一具體方面，本發(fā)明提供在一次試驗(yàn)中檢測(cè)多種染色體病中任一種的方法，該方法包括以下步驟(a)在容器中混合以下組分來制備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合物(i)真核基因組DNA；(ii)多對(duì)正向和反向DNA引物寡核苷酸，所述每對(duì)的一條引物與第一真核DNA鏈靶區(qū)段3序列互補(bǔ)，另一條引物與該靶區(qū)段第二鏈的3序列互補(bǔ)，真核DNA該區(qū)段長(zhǎng)約100和約250個(gè)堿基對(duì)之間，其中每對(duì)引物的一條5末端連接有可檢測(cè)的顏色標(biāo)記，多對(duì)引物靶向于所選的感興趣的不同染色體的區(qū)段，這些區(qū)段是潛在染色體病的指標(biāo)，和一對(duì)靶向于對(duì)照基因的某區(qū)段；和(iii)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的PCR緩沖液和酶；(b)進(jìn)行約5到約60輪溫度循環(huán)PCR以產(chǎn)生擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；(c)純化步驟(b)的所述產(chǎn)物，通過消化擴(kuò)增的雙鏈PCR-產(chǎn)物的一條鏈獲得具有可檢測(cè)顏色標(biāo)記的單鏈DNA；(d)使微陣列與步驟(c)的產(chǎn)物接觸，所述微陣列具有多個(gè)斑點(diǎn)，各斑點(diǎn)含有DNA寡核苷酸探針，該探針的核苷酸序列與所述靶區(qū)段的所述鏈之一的核苷酸序列互補(bǔ)；(e)使所述DNA寡核苷酸探針與所述PCR-擴(kuò)增的含標(biāo)記單鏈產(chǎn)物雜交；(f)通過拍攝該微陣列比色圖像來檢測(cè)是否存在能與該微陣列雜交的PCR-擴(kuò)增產(chǎn)物及其相對(duì)含量；和(g)首先通過將所述微陣列上感興趣的各所述染色體的相關(guān)斑點(diǎn)圖像與所述對(duì)照基因相關(guān)斑點(diǎn)的圖像作比較得到I-比值；然后每種I比值與已知的正?；蚪MDNA的類似測(cè)試結(jié)果所得的N比值作比較來診斷是否存在能與一種或多種感興趣的所述不同染色體有關(guān)的染色體病。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述總體如上所述，本發(fā)明有助于檢測(cè)染色體非整倍性異常，包括三體性21、18、13和性染色體異常，有時(shí)稱為基因劑量異?；蚧?。同時(shí)，可通過選擇受影響基因區(qū)域(即，缺失區(qū))內(nèi)的靶序列或包含受影響基因區(qū)域的靶序列并比較表明可能發(fā)生這種缺失的區(qū)域與內(nèi)部對(duì)照和正常DNA的基因劑量來檢測(cè)染色體突變，特別是形成某基因序列一部分缺失，導(dǎo)致稱為微小缺失綜合征的各種疾病之一的那些突變。這種染色體微小缺失綜合征的一些例子和所靶向的缺失區(qū)域包括普-韋綜合征和安格曼綜合征(Angelman syndrome)(缺失位點(diǎn)15q11-q13)、威廉斯綜合征(缺失位點(diǎn)7q11.23)、貓叫綜合征(缺失位點(diǎn)5p)、卡爾曼綜合征(缺失位點(diǎn)Xp22.3)、迪喬治綜合征(缺失位點(diǎn)22q 11.2)、杜興/貝克爾(Becker)綜合征(缺失位點(diǎn)Xp21)和類固醇硫酸酯酶缺陷(缺失位點(diǎn)Xp22)。最好與同性別對(duì)象的正常DNA進(jìn)行某些比較。
提供以下術(shù)語和首字母縮寫的定義以更好地理解下文詳述。
染色體病包括染色體中的或染色體數(shù)目的所有異常。例如，這包括檢測(cè)染色體21的三體性、X-和Y-染色體異常與檢測(cè)突變，例如各基因中的缺失、插入和/或改變。
本申請(qǐng)使用的雜交指在DNA的互補(bǔ)鏈之間形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，其中兩條鏈之一優(yōu)選固定在固體表面或基質(zhì)上。
本文所用的退火指在雜交條件下使單鏈或熱變性雙螺旋核酸分析物與寡核苷酸探針或引物在緩慢降低的溫度下或單一溫度下培育，使探針或引物與該核酸分析物內(nèi)的其互補(bǔ)序列結(jié)合。
分析物或核酸分析物用于描述DNA樣品中作為分析對(duì)象的化合物。
標(biāo)記或可檢測(cè)標(biāo)記(或“標(biāo)簽”)指可連接于核酸序列，從而能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和/或定量測(cè)定的取代基團(tuán)。例子包括放射性同位素標(biāo)記，例如32P、33P和35S；顯色指示劑，如熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或有色化合物；配體，如生物素；和可用質(zhì)譜或其它光譜性能區(qū)分的化學(xué)基團(tuán)。合適標(biāo)記的更具體例子包括黃嘌呤染料、羅丹明染料、萘胺、苯并二唑、芪、芘、吖啶、花青3和花青5。雖然也可利用化學(xué)反應(yīng)、酶促反應(yīng)，或使標(biāo)記與中間體配體雜交或退火來間接加入，優(yōu)選將作為引物一部分的標(biāo)記物直接摻入而引入核酸分析物中。
探針指用作經(jīng)雜交反應(yīng)而與核酸分析物中其互補(bǔ)序列相結(jié)合的試劑的核酸序列。本文所用捕獲探針指一端結(jié)合到固體表面(即，被束縛的)而能在雜交反應(yīng)中將含互補(bǔ)序列的核酸或寡核苷酸捕獲在該固體表面的探針。
序列指在含有DNA的A、G、C、T殘基的核酸內(nèi)，以特定順序和鏈長(zhǎng)連接在一起的堿基串。
互補(bǔ)或互補(bǔ)序列指能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下形成雙鏈(雙螺旋)結(jié)構(gòu)的兩條序列。
靶、靶序列、靶鏈或靶核酸本文用于指存在的檢測(cè)目標(biāo)(例如通過與特異性DNA探針雜交)的核酸序列。有時(shí)術(shù)語“靶向”以廣義使用，指選擇某染色體的特定核酸區(qū)段。
“被束縛的”或“表面束縛的”在本文用于指通過表面官能團(tuán)和DNA探針一端的官能團(tuán)之間形成的共價(jià)鍵或其它強(qiáng)鍵而在一端結(jié)合于某表面的寡核苷酸DNA探針。
“固相雜交”指參與形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條“反應(yīng)鏈”中的一條被束縛于或者固定在固體支持物上的雜交反應(yīng)。
“側(cè)翼”或“邊界”用于指接近、毗連和/或包括某染色體的DNA靶區(qū)段二末端的核酸區(qū)段。
“寡核苷酸“指可化學(xué)合成的短DNA鏈，其長(zhǎng)度一般最多約100個(gè)核苷酸。
“基因“指一個(gè)遺傳功能單位，包括編碼蛋白質(zhì)的序列、間插在基因中的內(nèi)含(非編碼)序列和調(diào)節(jié)基因功能的其它序列。
“微陣列”或“DNA芯片”指能同時(shí)分析雜交反應(yīng)的多重性，在某表面上或固定在某表面的微點(diǎn)上形成的表面束縛的DNA探針的兩維或三維(3D)陣列，一般采取小型化形式，所含的各DNA探針陣列的中心間隔小于1毫米。
“引物”指具有游離3’-OH末端的寡核苷酸，其與“模板鏈”堿基配對(duì)，從而可用聚合酶延伸。例如在PCR反應(yīng)中，與DNA模板退火的寡核苷酸引物可用作DNA聚合酶的底物(連同脫氧核苷5’-三磷酸)，從而導(dǎo)致“引物延伸”。
“引物對(duì)”指能與核酸靶區(qū)段的相反鏈相結(jié)合的兩條引物。
“PCR片段”指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成的長(zhǎng)度確定(受模板上引發(fā)位點(diǎn)之間的間距所限定)的DNA片段。
“變性”或“變性的”指雙螺旋核酸分子的兩條鏈在該雙螺旋不穩(wěn)定的條件(最常見的是升溫(“熱變性”))下分離(解離)。
“5’-端/末端”指核酸鏈的末端，該末端含有的核苷酸在其脫氧核糖上為非酯化碳-5。
“3’-端/末端”指核酸鏈的末端，該末端含有的核苷酸在其脫氧核糖上具有非酯化碳-3。
PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
SSC-檸檬酸鈉鹽水，含有150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉的溶液。
申請(qǐng)人的診斷方法利用PCR先擴(kuò)增相對(duì)于總DNA而言以低豐度存在的特異性DNA序列。當(dāng)特異性DNA序列存在于起始DNA中時(shí)，采用PCR可將其擴(kuò)增10萬倍以上從而有助于檢測(cè)。
美國(guó)專利號(hào)4,683,202；4,683,195；4,800,159和4,965,188提供了現(xiàn)已熟知的本發(fā)明所用PCR方法的細(xì)節(jié)，其內(nèi)容納入本文作為參考。通過利用與感興趣特定區(qū)域側(cè)翼序列互補(bǔ)的寡核苷酸引物以相反和重疊方向進(jìn)行引物指導(dǎo)的DNA合成，PCR可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)將DNA序列擴(kuò)增幾個(gè)數(shù)量級(jí)。利用對(duì)這種側(cè)翼序列的了解可設(shè)計(jì)出用作引物的兩條合成的單鏈寡核苷酸，其長(zhǎng)度一般約20個(gè)核苷酸。選擇的二引物各自的序列應(yīng)與所選擇的各側(cè)翼序列堿基對(duì)互補(bǔ)。PCR首先使雙鏈靶DNA變性，然后使引物(每條鏈一條引物)與靶分析物側(cè)翼的序列退火。每條引物與一條側(cè)翼序列形成雙螺旋從而使引物的3羥基末端面向靶分析物序列。加入DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸導(dǎo)致形成始于引物并沿靶序列延伸的新DNA鏈，從而制備了該靶(序列)的一份拷貝。這些步驟，即DNA變性、引物退火和DNA聚合酶延伸代表了一輪PCR；每一步驟都在合適的溫度下進(jìn)行。延伸產(chǎn)物一般延伸和并包含了與位于該靶序列另一端引物互補(bǔ)的序列。因此，每條新的延伸產(chǎn)物在變性后可用作下一輪的模板。
通過采用重復(fù)多輪的高溫模板變性、寡核苷酸引物再退火和聚合酶介導(dǎo)的延伸，可忠實(shí)地將DNA序列擴(kuò)增幾十萬倍。PCR一般需要了解模板或待擴(kuò)增區(qū)段的5和3二末端的序列，從而為各模板設(shè)計(jì)兩條不同的引物，一條有義鏈的正向引物和一條反義鏈的反向引物。
本發(fā)明的PCR方法利用多對(duì)包含不同寡核苷酸的引物，這些寡核苷酸的作用是作為感興趣的所需DNA區(qū)段的DNA合成起始點(diǎn)。各引物與待擴(kuò)增雙螺旋區(qū)段的兩個(gè)3邊緣之一互補(bǔ)；它們常稱為正向和反向引物。正向引物的方向?yàn)榛虻?區(qū)域到3區(qū)域(即，它們與非編碼鏈或反義鏈互補(bǔ))，反向引物的方向?yàn)榛虻?區(qū)域到5區(qū)域(即，它們與編碼或有義鏈互補(bǔ))。引物在誘導(dǎo)引物延伸的條件下與其它PCR試劑，即四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸(或其類似物)、合適的合成酶與合適的緩沖液(“緩沖液”包含實(shí)現(xiàn)所需pH和離子強(qiáng)度的物質(zhì)等)聯(lián)用，并維持于合適的溫度。在聚合酶是Taq聚合酶或等效酶的PCR方法中，緩沖液可含有1.5-2mM鎂鹽，優(yōu)選MgCl2，15-200CM各種核苷三磷酸，1CM各引物，和(例如)50mM KCl，10mM Tris緩沖液，pH 8.4和100Cg/ml明膠。進(jìn)行PCR擴(kuò)增的這種試劑盒可從許多供應(yīng)商處購(gòu)得。
利用引物序列設(shè)計(jì)和優(yōu)化專業(yè)目前可得到的序列信息和已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)不難設(shè)計(jì)出用于檢測(cè)人染色體病的合適寡核苷酸引物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成寡核苷酸，例如通過利用自動(dòng)化DNA合成儀，如購(gòu)自Biosearch(Novato，Calif.)；Applied Biosystems(Foster City，Calif.)和其它公司。本文所用引物應(yīng)足夠長(zhǎng)從而可與一條鏈上毗鄰于某染色體DNA區(qū)段的所選擇側(cè)翼位點(diǎn)特異性雜交，所述區(qū)段是特別感興趣的疾病的指標(biāo)。這種DNA區(qū)段的長(zhǎng)度最少可包含14、15、16、17、18或19個(gè)堿基對(duì)；然而，它們通常包含20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)以上的核苷酸。待擴(kuò)增的DNA區(qū)段往往長(zhǎng)100和250個(gè)核苷酸堿基對(duì)(bp)之間；然而，也可能需要擴(kuò)增50和300bp之間的區(qū)段，例如當(dāng)分析非整倍性時(shí)。探針和引物的長(zhǎng)度可短至14、15、16、17、18或19個(gè)核苷酸，但它們通常至少含有20、30、40或50個(gè)以上的核苷酸。
各引物應(yīng)足夠長(zhǎng)從而在有合適的聚合酶和其它試劑，例如上述試劑存在時(shí)能啟動(dòng)或引發(fā)延伸DNA產(chǎn)物的合成。合適的引物長(zhǎng)度如熟知的那樣取決于許多因素；一般在實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)，所用的引物通常含有約15-40個(gè)核苷酸殘基。較短的引物分子通常需要較低的反應(yīng)溫度來形成并維持支持鏈延伸反應(yīng)的引物-模板復(fù)合物。
所用的引物需要與含有所選序列的待擴(kuò)增核酸基本上互補(bǔ)，即引物必須能與含有所選序列(或其互補(bǔ)序列)的核酸結(jié)合，即雜交。雖然引物序列無需全部與模板精確互補(bǔ)；例如，非互補(bǔ)核苷酸片段或其它部分可與引物的5端相連。然而，引物序列的剩余部分優(yōu)選與所選核酸序列互補(bǔ)，這是通常使用的。
總體上，通過PCR方法可擴(kuò)增任何特定的核酸序列，只要足夠詳細(xì)地知道該序列兩端足夠多的堿基從而可制備能與所需序列(位于該核酸序列的所需相對(duì)位置)的不同鏈雜交的兩條寡核苷酸引物。結(jié)果，將從一條引物合成的延伸產(chǎn)物與其模板(互補(bǔ)的)分離后，它可用作模板在下一輪中將另一引物延伸為長(zhǎng)度確定的核酸。
在本發(fā)明一優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物成對(duì)使用。引物之一，即正向引物與靶DNA區(qū)段反義鏈3端的序列互補(bǔ)；該序列接近、毗鄰和/或包含該靶區(qū)段的反義鏈3端。另一引物，即反向引物與靶DNA區(qū)段的有義或編碼鏈3端的序列互補(bǔ)；該序列包含、毗鄰和/或接近該靶區(qū)段的有義鏈3端。
引物的長(zhǎng)度優(yōu)選在約15和約40個(gè)核苷酸之間，更優(yōu)選在約18和約35個(gè)核苷酸之間。連接于或固定在微陣列斑點(diǎn)上的探針的長(zhǎng)度優(yōu)選在約25和約60個(gè)核苷酸之間，更優(yōu)選在約35和約50核苷酸之間。捕獲標(biāo)記產(chǎn)物的探針序列應(yīng)含有足夠的核苷酸，從而可在中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。如上所述，雖然探針可以2D陣列連接在平面基板的表面，但優(yōu)選3D陣列。
可利用許多供應(yīng)商的商品化DNA純化試劑盒來適當(dāng)?shù)丶兓薉NA，例如胎兒DNA，往往是得自羊水或可能得自母親血液的產(chǎn)前DNA?？捎脽晒庥?jì)和PicoGreen染料作為染色試劑來評(píng)估真核基因組DNA的濃度。或者，可通過標(biāo)準(zhǔn)DNA提取技術(shù)從胎兒細(xì)胞提取DNA，這些細(xì)胞可通過合適的方法，例如羊膜穿刺獲得。適當(dāng)稀釋后，將純化的胎兒DNA一等份加入PCR反應(yīng)試管。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所加入的反應(yīng)組分包括濃度合適的酶與含有維持所需pH和離子強(qiáng)度的物質(zhì)的緩沖液，與其它反應(yīng)條件加上合適量的脫氧核糖核苷三磷酸。
所選擇的一套引物應(yīng)對(duì)能表明感興趣疾病的特定染色體的部分或區(qū)段具有特異性。例如，可能需要定量比較存在的所有染色體的拷貝數(shù)?；蛘?，可能需要與正常染色體相比較來確定某染色體是否有小部分丟失。為實(shí)現(xiàn)此目的，適當(dāng)選擇的引物應(yīng)側(cè)接作為所分析疾病指標(biāo)的靶區(qū)域。此外，整套引物可包括設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增對(duì)照基因的一對(duì)(引物)。對(duì)照基因是存在于人真核DNA中，優(yōu)選是普遍表達(dá)的并存在于用于診斷某疾病的靶區(qū)段的染色體以外的染色體中的基因。一種優(yōu)選的基因是在染色體12上發(fā)現(xiàn)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPD)。
對(duì)照基因的合適正向和反向引物與探針以及可用于診斷5種示例性的非整倍性染色體病的引物對(duì)的例子見下文。
就GAPD而言，引物可以是以下寡核苷酸序列SEQ ID NO1和2。相應(yīng)的探針序列包括SEQ.ID NO19的序列。
就女性中與X染色體數(shù)量異常相關(guān)的特納(Turner)或三X(Triple X)疾病而言或就男性具有一條以上X染色體的克蘭費(fèi)爾特綜合征而言，可利用正向和反向引物對(duì)來制備包含Xp22區(qū)域的158bp PCR片段。這些引物可具有SEQ IDNO3和4的序列。相應(yīng)的探針可包含SEQ.ID NO20的序列。
為區(qū)分男性和女性并診斷克蘭費(fèi)爾特綜合征的一些罕見病例，利用如SEQID NO5和6所示的引物對(duì)來制備與Y-染色體上SRY基因相關(guān)的148bp PCR片段。相應(yīng)的探針可包含SEQ.ID NO21的序列。
為診斷三體13綜合征，即三體性13，設(shè)計(jì)了如SEQ ID NO7和8所示的引物對(duì)來制備與ATP7B基因相關(guān)的127bp PCR片段。相應(yīng)的探針可包含SEQ ID NO22序列。
為診斷愛德華綜合征，即三體性18，設(shè)計(jì)了如SEQ ID NO9和10所示的引物對(duì)來制備與WDR7基因相關(guān)的154bp PCR片段。相應(yīng)的探針可包含SEQID NO23序列。
為診斷唐氏綜合征或三體性21，設(shè)計(jì)了如SEQ ID NO11和12所示的引物對(duì)來制備與SOD1基因相關(guān)的124bp PCR片段。相應(yīng)的探針可包含SEQ IDNO24序列。
下文是設(shè)計(jì)用于分析人染色體中微小缺失的某些引物對(duì)的例子。
就貓叫綜合征而言，可采用合適引物對(duì)，如SEQ ID NO13和14所示來制備靶向可能出現(xiàn)染色體5上潛在缺失位點(diǎn)的TAS2R1基因某區(qū)域的167bp PCR片段。相應(yīng)的探針可包含SEQ.ID NO25序列。
就威廉斯綜合征而言，可采用合適引物對(duì)，如SEQ ID NO15和16所示來制備靶向可能出現(xiàn)染色體7上潛在缺失位點(diǎn)的ELN基因某區(qū)域的138bp PCR片段。相應(yīng)的探針可包含SEQ.ID NO26序列。
就迪喬治綜合征而言，可利用合適引物對(duì)，如SEQ ID NO17和18所示來制備靶向可能出現(xiàn)染色體22上潛在缺失位點(diǎn)的DGCR2基因某區(qū)域的145bp PCR片段。相應(yīng)的探針可包含SEQ.ID NO27序列。
雖然認(rèn)為上述幾套正向和反向引物或相應(yīng)的探針用于體現(xiàn)本發(fā)明各種特征的試驗(yàn)令人滿意，但自從最初進(jìn)行的工作以來，已開發(fā)了目前優(yōu)選的三套引物和相應(yīng)的探針來診斷這些異常中的三種疾病，并利用不同的標(biāo)記開發(fā)了一套(引物和探針)來檢測(cè)三體13綜合征(三體性13)，即FGF9基因。當(dāng)只有少量DNA可由于試驗(yàn)時(shí)，優(yōu)選該組引物和探針。這四套引物和探針示于下文并用于檢測(cè)以下四種基因的異常SRY、FGF9、WDR7和SOD1。目前優(yōu)選這四套引物和探針來診斷相應(yīng)的疾病。
就SRY而言引物為SEQ ID NO28和29；探針為SEQ ID NO36。這些引物產(chǎn)生了175bp PCR片段。
就FGF9而言引物為SEQ ID NO30和31；探針為SEQ ID NO37。這些引物產(chǎn)生了139bp PCR片段。
就WDR7而言引物為SEQ ID NO32和33；探針為SEQ ID NO38。這些引物產(chǎn)生了172bp堿基PCR片段。
就SOD1而言引物為SEQ ID NO34和35；探針為SEQ ID NO39。這些引物產(chǎn)生了129bp PCR片段。
已開發(fā)了另一套引物和探針來取代靶向染色體13上ATP7B基因而非靶向FGF9基因的引物和探針。當(dāng)有至少約10ng DNA可用于試驗(yàn)時(shí)，優(yōu)選該套(引物和探針)，其中引物為SEQ ID NO40和41，探針為SEQ ID NO42所示。
為便于該試驗(yàn)，提供了裝有全部所需工具的試劑盒。例如，檢測(cè)多種染色體病的試劑盒應(yīng)包含
(a)在擴(kuò)增哺乳動(dòng)物基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中可用作正向和反向引物的多對(duì)DNA寡核苷酸，設(shè)計(jì)這些引物來擴(kuò)增感興趣的不同哺乳動(dòng)物染色體的靶DNA區(qū)段，此區(qū)段是潛在染色體病的指標(biāo)，和一對(duì)靶向擴(kuò)增對(duì)照基因的引物；每對(duì)引物中的一條具有與其5末端共價(jià)相連的可檢測(cè)標(biāo)記；(b)進(jìn)行(i)PCR，(ii)DNA cDNA雜交和洗滌，和(iii)比色法定量測(cè)定的緩沖液和酶；(c)至少一個(gè)含有多個(gè)斑點(diǎn)的微陣列(優(yōu)選一式兩份微陣列)，其中至少一個(gè)斑點(diǎn)連接有和帶標(biāo)記的各自靶基因組DNA區(qū)段的擴(kuò)增鏈相互補(bǔ)的DNA探針序列；和(d)利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和微陣列上各斑點(diǎn)之間雜交反應(yīng)產(chǎn)生的圖像強(qiáng)度診斷染色體病的裝置，該裝置可利用正?；蚪MDNA相似測(cè)試產(chǎn)生的圖像。
此微陣列具有多個(gè)其上連接有DNA探針的微斑點(diǎn)；這些探針各自與擴(kuò)增DNA的一條標(biāo)記鏈互補(bǔ)。雖然可利用大量已開發(fā)的標(biāo)記了靶DNA的陣列，包括靶DNA的探針直接連接于平面基板或微滴定板孔中的兩維試驗(yàn)陣列，但優(yōu)選三維生物芯片，例如美國(guó)專利號(hào)6,174,683和名為“三維形式生物芯片”(ThreeDimensional Format Biochips)的已公布國(guó)際申請(qǐng)WO 02/059372中所述的芯片。在這種三維試驗(yàn)中，探針不連接于板孔的固體表面或載玻片或其它平板，而是通過與聚合的水凝膠的微斑點(diǎn)相連而存在于三維陣列中。此排列(方式)將探針與固體表面分開，從而為呈遞探針和最終捕獲標(biāo)記的分子提供了更大的表面積。就試驗(yàn)中所用的各種不同的靶子而言，每塊載玻片上或微孔板的每個(gè)孔中優(yōu)選具有多個(gè)這種3D微斑點(diǎn)。
除引物組和微陣列以外，作為試劑盒分類目錄一部分提供的物品是熟知物品，它們商業(yè)可購(gòu)得且通常作為任何PCR試劑盒的一部分而裝入。提供了目前熟知的PCR方法細(xì)節(jié)的上述四份美國(guó)參考文獻(xiàn)詳述了這些物品。如上所述，該試劑盒也裝有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)物質(zhì)以協(xié)助雜交反應(yīng)。將雜交溶液與載玻片或板孔培育后，進(jìn)行洗滌以除去未結(jié)合的標(biāo)記的靶材料，從而可以任何方法觀察得到的載玻片，例如當(dāng)利用熒光染料時(shí)可用熒光檢測(cè)器觀察，或根據(jù)該試劑盒選用的具體標(biāo)記物的性質(zhì)來使用其它合適的檢測(cè)器。該試劑盒中提供了合適的算法，可用之解釋微陣列比色掃描的結(jié)果；開發(fā)的這種算法依據(jù)早先從對(duì)照樣品得到的數(shù)據(jù)。
作為可用于檢測(cè)非整倍性或微小缺失所致多種染色體病的具有本發(fā)明各種特征的試驗(yàn)方法的例子，首先要得到少量真核基因組DNA。所述DNA可得自胎兒來源等；該試驗(yàn)常用于分析得自羊水的基因組DNA。至少約0.1納克的基因組DNA可認(rèn)為足夠；然而，可用多達(dá)10ng(當(dāng)這種用量可得時(shí))?？衫眉兓噭┖校缟虡I(yè)可得的來常規(guī)純化DNA。純化后，可適當(dāng)評(píng)估某濃度和純度，得到純度和濃度的肯定值后，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。
可在體積約50微升的反應(yīng)室中加入商業(yè)可購(gòu)得的PCR系統(tǒng)的諸成分與根據(jù)不同染色體側(cè)翼靶區(qū)域設(shè)計(jì)的一套數(shù)對(duì)引物，所述靶區(qū)域是需要檢測(cè)的潛在疾病的指標(biāo)。這些引物對(duì)當(dāng)然應(yīng)與連接在微陣列的斑點(diǎn)上的探針相一致，所述微陣列作為檢測(cè)試劑盒的一部分提供。例如當(dāng)檢測(cè)微小缺失時(shí)，可將這些探針設(shè)計(jì)為優(yōu)先與發(fā)生潛在缺失的區(qū)域中的正常反義鏈區(qū)段相結(jié)合，從而當(dāng)在該探針處檢測(cè)到強(qiáng)度很低時(shí)表明發(fā)生了這種微小缺失。這種引物對(duì)的數(shù)目可包括，例如甚至100對(duì)以上。然而，作為一個(gè)試劑盒的一部分，更常裝有不同的5-25對(duì)(引物)。除了作為感興趣染色體病的指標(biāo)而選擇多對(duì)引物外，試劑盒也可裝有一對(duì)所選對(duì)照基因的特異性引物。所選擇的每對(duì)引物最好能與染色體上可導(dǎo)致DNA序列擴(kuò)增的位置結(jié)合，所述DNA序列為約50-300堿基對(duì)，更優(yōu)選約100bp-250bp，最優(yōu)選約120bp-200bp。提供了約1cM的各正向和反向引物。當(dāng)然，商品化PCR系統(tǒng)試劑盒中裝有合適量的脫氧核糖核苷底物，合適的酶，例如Taq酶，優(yōu)選能熱啟動(dòng)的聚合酶，和緩沖液。
標(biāo)記每對(duì)引物的一條，用5-磷酸衍生另一條。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，正向引物5磷酸化，反向引物與可檢測(cè)標(biāo)記共價(jià)相連。雖然如上文定義所述有各種可包含的可檢測(cè)標(biāo)記，但優(yōu)選比色標(biāo)記，更優(yōu)選利用熒光標(biāo)記，例如花青。
PCR復(fù)制方法一般進(jìn)行約5到60輪溫度循環(huán)；通常約20-30輪即足以產(chǎn)生有利于進(jìn)行檢測(cè)的所需量的各種擴(kuò)增核酸序列。PCR擴(kuò)增完成后，采用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如柱純化(如，設(shè)計(jì)能保留大小為100個(gè)堿基對(duì)以上的分子)來純化雙鏈產(chǎn)物?？衫蒙唐坊噭┖衼韼椭@種純化。
純化后，利用適合該目的核酸外切酶來消化純化產(chǎn)物的有義鏈；結(jié)果，此步驟得到了PCR擴(kuò)增的單鏈產(chǎn)物。消化后，用雜交緩沖液適當(dāng)稀釋消化的混合物。將得到的溶液加熱至約95℃的溫度5-10分鐘以使核酸外切酶滅活并使單鏈產(chǎn)物變性。將得到的標(biāo)記反義鏈溶解于雜交溶液中，此溶液優(yōu)選分為兩等分從而可平行用于一式兩份的一對(duì)微陣列。將各微陣列于合適的溫度，例如45℃在含有合適緩沖液的此溶液中雜交約10-20小時(shí)，優(yōu)選約14-16小時(shí)。雜交后，用含有合適緩沖液的溶液洗滌各微陣列多次，然后利用激光掃描儀或一些相當(dāng)?shù)膬x器進(jìn)行熒光成像。當(dāng)然，如果使用不同類型的比色標(biāo)記，或者如果使用放射性或其它類型的已知標(biāo)記物，可使用其它合適的掃描儀/檢測(cè)器。
由于優(yōu)選的試驗(yàn)方法消化擴(kuò)增雙鏈PCR產(chǎn)物的有義鏈，所提供的各微陣列具有探針，所述探針是從待檢測(cè)核酸各延伸段有義鏈選出的區(qū)段和所選擇的對(duì)照基因有義鏈的合適區(qū)段。下文給出了與所述引物對(duì)聯(lián)用的相應(yīng)探針的例子。探針的長(zhǎng)度一般為約25-約60個(gè)核苷酸。平行進(jìn)行一式兩份的微試驗(yàn)(microassay)后，記錄各微陣列上探針的熒光強(qiáng)度，然后用規(guī)則算法將這些圖像用于診斷。
首先將記錄值除以內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)強(qiáng)度，例如位于具有探針的斑點(diǎn)處的信號(hào)強(qiáng)度，將各探針的信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化，所述探針可以是染色體12上GAPD基因有義鏈的某區(qū)段。此初步計(jì)算得到了以各探針與所選擇內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品比值形式的數(shù)值，稱為其I-比值。
然后比較一式兩份載玻片各塊上相同探針?biāo)玫降腎-比值。就X和Y染色體而言，如果一式兩份載玻片之間某特定探針的這些比值的差異大于30％，則感到那些數(shù)值可能不可靠，因此不作進(jìn)一步計(jì)算。類似地，如果對(duì)一些其它染色體上靶區(qū)段的某特定探針的I-比值差異大于20％，此特定探針同樣不作進(jìn)一步計(jì)算和分析。(計(jì)算)經(jīng)過這種排除后保留下的那些(比值)的兩個(gè)I因子的平均值，然后使用此數(shù)值。
為提供分析這種未知樣品所得結(jié)果的基礎(chǔ)，首先分析幾組已知正常的DNA，然后用這些結(jié)果來測(cè)定各所選DNA序列的正常比值。例如，運(yùn)行12份正常的男性樣品，然后計(jì)算每份樣品的各探針與對(duì)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品(本文選擇GAPD基因)的比值。然后計(jì)算這12個(gè)比值的平均值得到從正常男性DNA樣品預(yù)計(jì)的“正常比值”(N-比值)。進(jìn)行類似的方法分析12位正常女性的DNA。類似地計(jì)算出這些數(shù)值的平均值，利用這些數(shù)值得到從正常女性DNA預(yù)計(jì)的N-比值。
在下一分析步驟中，將待分析的未知DNA與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品得到的初始比值(I-比值)分別除以相同性別人的各種N-比值，得到的因子稱為轉(zhuǎn)換因子(C-因子)。采用該方法計(jì)算各探針的C-因子。感到各C-因子應(yīng)該在約1.25和0.75之間，超出此范圍的任何C-因子判定為異常并不作隨后的分析。計(jì)算微陣列上各探針的C-因子后，計(jì)算除代表內(nèi)部對(duì)照基因的探針以外的所有這些C-因子的平均值得到平均C-因子(當(dāng)然是在0.75-1.25之間)。一旦建立了一式兩份的一套微陣列的平均C-因子后，將先前得到的各初始平均I-比值除以該平均C-因子從而得到各(探針的)校準(zhǔn)比值(A-比值)。就微陣列的任何具體操作性運(yùn)行而言，發(fā)現(xiàn)這一特別步驟可有效降低因內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品差異可能導(dǎo)致的總體變異；以此方式可將差異的總系數(shù)明顯降低約2-4％。
用平均C-因子來校準(zhǔn)N-比值得到A-比值后，采用另一規(guī)則診斷各探針，所述規(guī)則將偏離正常比值25％醫(yī)師的任何比值視作基因組DNA樣品在該特定靶區(qū)段異常的指標(biāo)。例如，如果表示男性樣品染色體21的探針的信號(hào)與一式兩份微陣列上所用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的I-比值是1.01，計(jì)算出此特定測(cè)試方法的平均C-因子為1.10，則該染色體21探針比值的再校準(zhǔn)計(jì)算為1.01/1.10等于0.92(A-比值)。然后將A-比值(即，0.92)與先前發(fā)現(xiàn)約為0.68的正常男性樣品的染色體21探針信號(hào)的N-比值相比較?？煽闯鲈撝当日１戎导s高35％；因此，該樣品診斷為三體性21。感興趣的是，通?？山邮艿娜w性21的理論值約為1.02，該值合理地接近此分析所得的0.92再校準(zhǔn)比值。
就所選擇的各潛在疾病而言，可以相同方式分析各探針?biāo)玫臄?shù)值，結(jié)果可在一次試驗(yàn)過程中診斷是否存在染色體病。例如，當(dāng)檢測(cè)到三體性疾病時(shí)，各探針的強(qiáng)度基本上較高，當(dāng)在其它突變(處)發(fā)現(xiàn)微小缺失時(shí)，各探針的強(qiáng)度基本上較低。為證實(shí)利用微陣列的此測(cè)試方法，利用上述八種具體染色體病的各自DNA進(jìn)行了測(cè)試，24份已知正常的DNA樣品和48份已知含有特定異常的不同DNA樣品得到的測(cè)試結(jié)果顯示了100％的靈敏度和100％的特異性。雖然目前只檢測(cè)了八種潛在的染色體病，但是明顯不難在一個(gè)微陣列上進(jìn)行這種測(cè)試可包括非整倍性和/或微小缺失的其它疾病，并完全可預(yù)計(jì)能得到類似的檢測(cè)和診斷(結(jié)果)。
給出以下實(shí)施例提供目前已知的本發(fā)明最佳實(shí)施方式，所述方式利用針對(duì)多達(dá)9種不同染色體的探針和多套引物，其中8種引物針對(duì)潛在疾病。然而，應(yīng)該理解給出這些實(shí)施例只是為說明目的，不能認(rèn)為以任何方式限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍當(dāng)然只受本文末尾的權(quán)利要求書所限定。
實(shí)施例1作為用于檢測(cè)與八種不同染色體有關(guān)的非整倍性或微小缺失所致染色體病的試驗(yàn)方法的例子，得到并常規(guī)純化了10ng真核基因組DNA。純化后，利用表1所示配方進(jìn)行多重PCR反應(yīng)表1.PCR諸組分的體積
利用體積約50微升的反應(yīng)室。將引物混合物中的各對(duì)引物(即，SEQ IDNO1到SEQ ID NO18)設(shè)計(jì)為側(cè)接在所選擇用于檢測(cè)各種染色體的靶區(qū)域。
引物混合物的濃度(10×)范圍是1.25cM到2.5cM。市售PCR MasterMix含有合適量的脫氧核糖核苷底物、合適的酶(例如Taq)和緩沖液。正向引物5-磷酸化，反向引物與熒光標(biāo)記物，即花青(Cy-3)共價(jià)相連。利用ABI9700熱循環(huán)儀擴(kuò)增混合物的所有成分。PCR循環(huán)時(shí)間和溫度如下所示95℃、11′，96℃、1′，94℃、30″，55℃、30″和70℃、30″，10輪；94℃、30″，55℃、30″和70℃、30″，13輪；60℃、10′。
PCR擴(kuò)增完成后，利用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化所擴(kuò)增的雙鏈物質(zhì)。在37℃用λ核酸外切酶(1.5cL，5單位/cL，New EnglandBioLabs)消化所純化物質(zhì)的有義鏈30分鐘。
將得到的標(biāo)記的單鏈物質(zhì)溶解于含有3×SSC和0.1％ Triton X-100的雜交溶液中并分為兩等份。使每份樣品與在不連續(xù)位置結(jié)合了9種不同探針(即SEQ ID NO19到SEQ ID NO27)的3D微陣列雜交，45℃溫育14小時(shí)。在37℃用含有1×SSC和0.1％ Triton X-100的洗滌液洗滌15分鐘除去未結(jié)合的靶(分子)。然后室溫用10mM MgCl2和5mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)再洗滌15秒。干燥后，用激光掃描儀(ScanArray Lite，Perkin Elmer)獲得各雜交的3D微陣列(A和B)的熒光圖像。
如下所示，采用規(guī)則算法分析圖像表2.兩個(gè)3D微陣列的熒光信號(hào)強(qiáng)度60的激光能量85的PMT獲得(值)
首先計(jì)算各基因的信號(hào)與GAPD的信號(hào)的比值。結(jié)果見表3。
表3.各信號(hào)與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品GAPD信號(hào)的初始比值(I-比值)
然后計(jì)算各基因(比值)值的平均比值和差異百分比。
表4.兩個(gè)3D微陣列之間的平均比值和差異百分比
在該樣品中，差異百分比沒有一個(gè)顯示高變異。
表5.計(jì)算的轉(zhuǎn)換因子和利用平均C-因子校準(zhǔn)的比值
在此樣品中，除SOD1以外所有基因的A-比值在N-比值的約15％以內(nèi)，這說明該樣品中不存在這些基因所代表的疾病。SOD的A-比值是0.92，比N-比值的0.68高35％。該差異百分比的數(shù)量級(jí)表示樣品來自受三體性21影響的對(duì)象；此外，三體性21的理論值是0.93。由于所測(cè)試的DNA隨后顯示對(duì)象的DNA確實(shí)受到三體性21影響，因此認(rèn)為該測(cè)試證實(shí)了使用此試劑盒的診斷方法。
實(shí)施例2作為另一實(shí)施例，實(shí)施了類似于實(shí)施例1所述的試驗(yàn)方法，其中利用了靶向八種不同染色體的引物和探針。得到10ng真核基因組DNA并常規(guī)純化。純化后，利用與實(shí)施例1相同的配方進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。
利用體積約50微升的反應(yīng)室。使用與實(shí)施例1所用相同引物混合物和設(shè)計(jì)為側(cè)接在待檢測(cè)9種染色體靶區(qū)域的引物對(duì)。
引物混合物的濃度范圍是1.25cM到2.5cM。市售PCR Master Mix含有合適量的脫氧核糖核苷底物、合適的酶(例如Taq)和緩沖液。正向引物5-磷酸化，反向引物與熒光標(biāo)記物，即花青(Cy-3)共價(jià)相連。
如實(shí)施例1所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化(擴(kuò)增產(chǎn)物)和消化純化物質(zhì)的有義鏈。
將得到的標(biāo)記的單鏈物質(zhì)溶解于含有3×SSC和0.1％ Triton X-100的雜交溶液中并分為兩等份。每份樣品通過與實(shí)施例1所述相同的在不連續(xù)位置結(jié)合了9種不同探針的3D微陣列雜交，45cC溫育14小時(shí)。在37cC用含有1×SSC和0.1％ Triton X-100的洗滌液洗滌15分鐘除去未結(jié)合的靶(分子)。干燥后，用激光掃描儀(ScanArray Lite，Perkin Elmer)獲得各雜交的3D微陣列(A和B)的熒光圖像。
如下所示，采用規(guī)則算法分析圖像表6.兩個(gè)3D微陣列的熒光信號(hào)強(qiáng)度70處的激光能量85處的PMT獲得(值)
首先計(jì)算各基因的信號(hào)與GAPD的信號(hào)的比值。結(jié)果見表7。
表7.各信號(hào)與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品GAPD信號(hào)的初始比值(I-比值)
然后計(jì)算各基因(比值)值的平均比值和差異百分比。
表8.兩個(gè)3D微陣列之間的平均比值和差異百分比
在該樣品中，無差異百分比顯示高度可變性。
表9.所計(jì)算的轉(zhuǎn)化因子和利用平均C-因子調(diào)整的比值
在此樣品中，不存在SRY基因顯示該對(duì)象是女性(因?yàn)槿狈-染色體)；除DGCR2以外的所有其余基因的A-比值在N-比值的約12％以內(nèi)，這說明樣品中不存在這些基因所代表的疾病。DGCR2的A-比值是0.22，比N-比值0.32低31％。差異百分比的數(shù)量級(jí)表示樣品是來自受迪喬治綜合征影響的對(duì)象。
隨后鑒定到所測(cè)試的DNA確實(shí)來自受迪喬治綜合征影響的女性對(duì)象的組織；因此認(rèn)為該測(cè)試證實(shí)了使用此試劑盒的診斷方法。
實(shí)施例3為進(jìn)行如以上實(shí)施例1所述的雜交，得到、純化、擴(kuò)增、消化和制備0.3ng與實(shí)施例1所用相同的DNA樣品。然而，在此試驗(yàn)中，只對(duì)基因GAPD、XP22、SRY、FG9、WDR7和SOD1進(jìn)行試驗(yàn)。引物混合物所包含的多套引物是SEQ ID NO1和2；SEQ ID NO3和4；SEQ ID NO28和29；SEQ ID NO30和31；SEQ ID NO32和33；SEQ ID NO34和35。
將得到的含有合適緩沖液的雜交溶液再分為兩等份。每份樣品與在不連續(xù)位置結(jié)合了6種不同探針的3D微陣列雜交；所用的探針是SEQ ID NO19和20與SEQ ID NO36-39。如上所述進(jìn)行培育，以相同方式洗滌除去未結(jié)合的靶(分子)。干燥后，用實(shí)施例1中所用的激光掃描儀掃描各微陣列獲得其熒光圖像。
采用規(guī)則算法以實(shí)施例1所述相同的方式分析結(jié)果。結(jié)果還是四種基因的A-比值在N-比值的15％以內(nèi)；例外的是SOD1的A-比值。結(jié)果，使用0.3ng的基因組DNA樣品測(cè)定再次診斷為一位對(duì)象受三體性21(唐氏綜合征)影響。
雖然利用一些優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，這些方案構(gòu)成了本發(fā)明人目前已知的實(shí)施其發(fā)明的最佳方式，但是應(yīng)該理解本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員明顯可作出各種改變或改進(jìn)而不脫離如本文附加的權(quán)利要求書所述的本發(fā)明范圍。例如，雖然優(yōu)選使用至少含有本文所述全部序列的探針，但如果需要也可使用(含有)所述序列的主要部分的探針。所提及的所有美國(guó)專利和申請(qǐng)與文章的內(nèi)容專門納入本文作為參考。
序列表簡(jiǎn)述SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2是用于擴(kuò)增人GAPD基因的139個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4是用于擴(kuò)增X-染色體的158個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6是用于擴(kuò)增人SRY基因的171個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8是用于擴(kuò)增ATP7B基因的127個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10是用于擴(kuò)增人WDR7基因的151個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12是用于擴(kuò)增SOD1基因的124個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14是用于擴(kuò)增人TAS2R1基因的167個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16是用于擴(kuò)增ELN基因的138個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18是用于擴(kuò)增DGCR2基因的145個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 19到SEQ ID NO 27是5末端設(shè)計(jì)為與微陣列板上的斑點(diǎn)相連，3區(qū)域設(shè)計(jì)為能與一條消化后的各擴(kuò)增PCR產(chǎn)物雜交的探針寡聚物。
SEQ ID NO 28和SEQ ID NO 29是用于擴(kuò)增人SRY基因的175個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 30和SEQ ID NO 31是用于擴(kuò)增FGF9基因的139個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33是用于擴(kuò)增人WDR7基因的172個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 34和SEQ ID NO 35是用于擴(kuò)增SOD基因的129個(gè)堿基對(duì)區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 36到SEQ ID NO 39是5末端設(shè)計(jì)為與微陣列板上的斑點(diǎn)相連，3區(qū)域設(shè)計(jì)為能與一條消化后的各擴(kuò)增PCR產(chǎn)物雜交的探針寡聚物。
SEQ ID NO 40和SEQ ID NO 41是用于擴(kuò)增FGF9基因某區(qū)段的引物。
SEQ ID NO 42是5末端設(shè)計(jì)為與微陣列板上的斑點(diǎn)相連，3區(qū)域設(shè)計(jì)為能與一條消化后的FGF9基因的PCR擴(kuò)增區(qū)段雜交的探針寡聚物。
序列表<110>生物概念股份有限公司(Biocept，Inc.)<120>檢測(cè)染色體病<130>81665/6776<140>10/840,208<141>2004-05-05<160>42<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>19<212>DNA<213>人工<220>
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<223>引物<400>40gattctcatg ggttggccag gata24<210>41<211>24<212>DNA
<213>人工<220>
<223>引物<400>41actccagagc tcaaagtaac ccac24<210>42<211>44<212>DNA<213>人工<220>
<223>探針<400>42acatcttctg tctattgaaa ggcaacttac ggctgggcgt ggtg 4權(quán)利要求
1.一種在一次試驗(yàn)中檢測(cè)多種染色體病中任一種的方法，所述方法包括以下步驟a在容器中混合以下組分來制備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合物(i)真核基因組DNA；(ii)多對(duì)正向和反向DNA引物寡核苷酸，其中所述每對(duì)引物的一條與該真核DNA第一DNA鏈的靶區(qū)段3序列互補(bǔ)，另一條引物與該靶區(qū)段第二鏈的3序列互補(bǔ)，該真核DNA區(qū)段長(zhǎng)約50-300個(gè)堿基對(duì)，其中每對(duì)引物的一條在其5末端連接有可檢測(cè)標(biāo)記，多對(duì)引物各自靶向所選擇的感興趣的不同染色體的區(qū)段，該區(qū)段是潛在染色體病的指標(biāo)，并有一對(duì)引物靶向?qū)φ栈虻膮^(qū)段；和(iii)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的PCR緩沖液和酶；b進(jìn)行有約5-60輪溫度循環(huán)的PCR，產(chǎn)生擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；c純化步驟(b)的所述產(chǎn)物，獲得含有可檢測(cè)標(biāo)記的單鏈DNA；d使微陣列與步驟(c)的產(chǎn)物接觸，所述微陣列具有多個(gè)斑點(diǎn)，各斑點(diǎn)含有的DNA寡核苷酸探針的核苷酸序列與所述各靶區(qū)段的所述鏈之一的核苷酸序列互補(bǔ)；e使所述DNA寡核苷酸探針與所述PCR-擴(kuò)增的含標(biāo)記單鏈產(chǎn)物雜交；f拍攝該微陣列的圖像來檢測(cè)是否存在與該微陣列雜交的PCR-擴(kuò)增產(chǎn)物及其相對(duì)含量；和g將所述微陣列上所選擇染色體的所述各靶區(qū)段相關(guān)斑點(diǎn)的圖像與所述對(duì)照基因相關(guān)斑點(diǎn)的圖像作比較，然后與已知正常的基因組DNA的類似測(cè)定所得結(jié)果相比較，來診斷是否存在與一種或多種所述選擇的不同染色體有關(guān)的染色體病。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述診斷步驟包括在與相同性別正?；蚪MDNA的所述結(jié)果進(jìn)行最后比較之前將規(guī)則算法應(yīng)用于步驟(f)的檢測(cè)結(jié)果。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所選擇的真核基因組DNA的至少兩個(gè)靶區(qū)段與導(dǎo)致選自以下染色體病的染色體DNA的潛在微小缺失相關(guān)威廉斯綜合征，貓叫綜合征，和迪喬治綜合征。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，選擇至少兩個(gè)靶區(qū)段來檢測(cè)選自以下的染色體畸變?nèi)w性13、三體性18、三體性21與X-和Y-染色體異常。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記是可檢測(cè)顏色的標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)顏色的標(biāo)記與反向引物相連，每對(duì)引物的正向引物在其5末端磷酸化。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記是熒光染料。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，首先純化步驟(b)的雙鏈產(chǎn)物，然后用核酸外切酶消化該純化產(chǎn)物的有義鏈得到步驟(c)的帶標(biāo)記的單鏈反義鏈。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述對(duì)照基因是GAPD。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述探針的大小約為25-60個(gè)核苷酸，所述靶區(qū)段長(zhǎng)約100-200個(gè)堿基對(duì)。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，平行使用兩個(gè)微陣列，比較二者的圖像結(jié)果作為雜交和成像步驟有效性的初步核查。
12.一種檢測(cè)染色體病的試劑盒，所述試劑盒包括a在擴(kuò)增哺乳動(dòng)物基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中用作引物的多對(duì)DNA寡核苷酸，其中每對(duì)寡核苷酸的一條引物與哺乳動(dòng)物基因組DNA靶區(qū)段第一鏈的3核苷酸序列互補(bǔ)，每對(duì)寡核苷酸的另一條引物與該靶DNA區(qū)段第二鏈的3寡核苷酸序列互補(bǔ)，每對(duì)所述引物的一條在其5端共價(jià)連接有可檢測(cè)標(biāo)記；b.所述多對(duì)DNA引物靶向擴(kuò)增所選擇的感興趣的不同染色體的區(qū)段，該區(qū)段是潛在染色體病的指標(biāo)，并有一對(duì)所述引物靶向擴(kuò)增對(duì)照基因的區(qū)段；c進(jìn)行(i)PCR，(ii)DNA-DNA雜交和洗滌，和(iii)比色法定量測(cè)定所需的緩沖液和酶；d至少一個(gè)具有多個(gè)斑點(diǎn)的微陣列，至少一個(gè)所述斑點(diǎn)連接有和各靶基因組DNA區(qū)段的攜帶標(biāo)記的擴(kuò)增鏈相互補(bǔ)的DNA序列；和e利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和微陣列上各斑點(diǎn)之間雜交反應(yīng)產(chǎn)生的圖像結(jié)果強(qiáng)度來診斷染色體病的裝置，所述裝置利用正?；蚪MDNA的類似測(cè)試的圖像結(jié)果。
13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，提供一對(duì)一式兩份的微陣列和規(guī)則算法作為所述診斷裝置的一部分來分析所述微陣列的所述強(qiáng)度掃描結(jié)果。
14.如權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其特征在于，至少兩對(duì)所述引物靶向哺乳動(dòng)物基因組DNA的區(qū)段，其中具有可能導(dǎo)致以下染色體病的染色體DNA的微小缺失威廉斯綜合征，貓叫綜合征，和迪喬治綜合征。
15.如權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其特征在于，所述引物對(duì)靶向選擇用于檢測(cè)以下染色體畸變的至少兩個(gè)DNA區(qū)段三體性13、三體性18、三體性21與X-和Y-染色體異常。
16.如權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，每對(duì)所述引物的一條具有熒光染料標(biāo)記，每對(duì)所述引物的另一條其5末端磷酸化。
17.如權(quán)利要求12-16中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述引物的一對(duì)靶向作為對(duì)照基因的GAPD。
18.如權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，探針的大小約為25-60個(gè)核苷酸，靶DNA區(qū)段長(zhǎng)約120-200個(gè)堿基對(duì)。
19.如權(quán)利要求12-18中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述酶包括用于消化PCR-擴(kuò)增產(chǎn)物有義鏈的核酸外切酶。
20.一種在一次試驗(yàn)中檢測(cè)多種染色體病中任一種的方法，該方法包括以下步驟a在容器中混合以下組分來制備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合物(i)真核基因組DNA；(ii)多對(duì)正向和反向DNA引物寡核苷酸，其中所述每對(duì)引物的一條與第一真核DNA鏈靶區(qū)段的3序列互補(bǔ)，另一條引物與該靶區(qū)段第二鏈的3序列互補(bǔ)，真核DNA區(qū)段長(zhǎng)約100-250個(gè)堿基對(duì)，其中所述每對(duì)引物的一條其5端連接有可檢測(cè)顏色的標(biāo)記，多對(duì)引物靶向所選擇的感興趣的不同染色體的區(qū)段，這些區(qū)段是潛在染色體病的指標(biāo)，并有一對(duì)引物靶向?qū)φ栈虻膮^(qū)段；和(iii)進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的PCR緩沖液和酶；b進(jìn)行有約5-60輪溫度循環(huán)的PCR產(chǎn)生擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；c純化步驟(b)的所述產(chǎn)物，通過消化擴(kuò)增的雙鏈PCR-產(chǎn)物的一條鏈獲得具有可檢測(cè)顏色標(biāo)記的單鏈DNA；d使微陣列與步驟(c)的產(chǎn)物接觸，所述微陣列具有多個(gè)斑點(diǎn)，各斑點(diǎn)含有的DNA寡核苷酸探針的核苷酸序列與所述靶區(qū)段的所述鏈之一的核苷酸序列互補(bǔ)；e使所述DNA寡核苷酸探針與所述PCR-擴(kuò)增的含標(biāo)記單鏈產(chǎn)物雜交；f拍攝該微陣列的比色圖像來檢測(cè)是否存在與該微陣列雜交的PCR-擴(kuò)增產(chǎn)物及其相對(duì)含量；和g首先將所述微陣列上感興趣的各所述染色體的相關(guān)斑點(diǎn)的圖像與所述對(duì)照基因相關(guān)斑點(diǎn)的圖像作比較得到I-比值；然后將各I比值與已知正常的基因組DNA的類似測(cè)試所得結(jié)果的N-比值作比較，來診斷是否存在與一種或多種所述感興趣的不同染色體有關(guān)的染色體病。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述I-比值經(jīng)過規(guī)則算法，該算法包括首先使所有I-比值與各自的N-比值相比較得到各C-因子，然后得到平均C-因子，用該平均C-因子來調(diào)整各I-比值，然后用于最終診斷。
全文摘要
在一次試驗(yàn)中檢測(cè)非整倍性或某些突變，特別是微小缺失所致的多種染色體病中的任一種的方法和使用該方法的試劑盒。利用多對(duì)引物寡核苷酸進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴(kuò)增真核基因組DNA，其中每對(duì)的一條引物在其5端連有可檢測(cè)標(biāo)記。多對(duì)引物靶向感興趣的不同染色體的DNA區(qū)段，所述區(qū)段是潛在染色體病的指標(biāo)，和一對(duì)靶向于對(duì)照基因的引物。純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，從中得到具有可檢測(cè)標(biāo)記的單鏈DNA，使之與微陣列上各含DNA寡核苷酸探針的斑點(diǎn)雜交，所述探針的核苷酸序列與各靶區(qū)段一條鏈的核苷酸序列互補(bǔ)。拍攝微陣列各斑點(diǎn)上存在的標(biāo)記的圖像，并通過首先將該圖像結(jié)果與對(duì)照基因特異性斑點(diǎn)的圖像作比較，然后與得自正常DNA的圖像結(jié)果作比較來診斷是否存在一個(gè)或多個(gè)感興趣的靶DNA區(qū)段所表明的染色體病。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1981052SQ200580020530
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月5日
發(fā)明者Z·謝, S·韓, T·瓦達(dá)那斯庫爾 申請(qǐng)人:生物概念股份有限公司