本發(fā)明屬于BRCA1基因突變體檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及通用型BRCA1基因多重PCR建庫試劑盒。
背景技術(shù)：
乳腺癌是世界女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性癌癥發(fā)病總數(shù)的23％，占女性癌癥死亡人數(shù)的14％。乳腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是患者重要的致死原因，轉(zhuǎn)移后中位生存時(shí)間不足2年。在我國，近年來乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。從90年代以來，中國的乳腺癌發(fā)病率增長速度是全球的兩倍多，城市地區(qū)尤為顯著。以北京和上海為例，乳腺癌已經(jīng)連續(xù)20年位于女性惡性腫瘤第一位，現(xiàn)在年發(fā)病率已達(dá)到40/10萬以上，并且每年仍以2-3％的速度上升，有逐步接近歐美發(fā)達(dá)國家水平的趨勢(shì)。另外，與歐美發(fā)達(dá)國家女性相比，中國乳腺癌患者絕經(jīng)前患者占一半以上(歐美不足30％)，并且發(fā)病年齡高峰較西方女性早5到10年。由于這個(gè)年齡段的女性是家庭和社會(huì)的中堅(jiān)力量，進(jìn)一步突顯了乳腺癌對(duì)我國社會(huì)和家庭帶來的巨大危害。同時(shí)，上海是中國人口最多的城市，也是乳腺癌發(fā)病率最高的城市之一，海市乳腺癌發(fā)病趨勢(shì)代表了未來20年中國城市化進(jìn)程中的疾病趨勢(shì)。
乳腺癌的致病原因至今沒有完全了解。乳腺癌家族史、乳腺良性疾病史、較晚的月經(jīng)初潮年齡、較高的精神壓力、較高的身體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，BMI)及腫瘤家族史等被認(rèn)為是罹患乳腺癌的重要誘因。乳腺癌的病因從遺傳角度而言也有了較多的突破，BRCA1，BRCA2，TP53，PTEN，STK11/LKB1，CDH1，CHEK2，ATM，MLH1，MSH2等一系列乳腺癌易感基因的突變也被證明與乳腺癌相關(guān)?，F(xiàn)有研究已經(jīng)明確證實(shí)BRCA1和BRCA2基因的胚系突變與遺傳性乳腺癌的發(fā)生與密切相關(guān)。遺傳性乳腺癌約占所有乳腺癌5％-10％左右，其發(fā)病年齡相對(duì)年輕；30歲以下的年輕乳腺癌患者中約25-35％有乳腺癌易感基因的突變。更重要的是，攜帶BRCA1/2基因突變的婦女，其一生中患乳腺癌、卵巢癌累計(jì)危險(xiǎn)隨年齡增長而增高，BRCA1/2突變攜帶者到80歲時(shí)發(fā)生乳腺癌的預(yù)測(cè)累積風(fēng)險(xiǎn)均超過80％；而普通人群一生患乳腺癌危險(xiǎn)度為14％左右，亦即BRCA1/2基因的突變讓婦女罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)升高了5倍以上。
BRCA1/2的功能研究提示其屬于抑癌基因，在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要作用。在外界因素的干擾下，抑癌基因發(fā)生突變后，細(xì)胞的生長失去正常調(diào)控從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。BRCA1/2基因的任何有害突變都可導(dǎo)致較高的乳腺癌和卵巢癌終身風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還會(huì)增加一系列其他腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。BRCA1/2突變基因攜帶者終身罹患乳腺癌的累積風(fēng)險(xiǎn)為80％。由此可見，對(duì)乳腺癌高危人群進(jìn)行BRCA1/2基因突變檢測(cè)，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)遺傳性乳腺癌，尤其是對(duì)于惡性程度高、預(yù)后相對(duì)差的三陰性乳腺癌具有重要意義。通過了解合適患者的BRCA1/2狀態(tài)有助于評(píng)估其癌癥的終身風(fēng)險(xiǎn)，并采取可成功降低患病風(fēng)險(xiǎn)的伴隨措施，比如建議大多數(shù)攜帶者接受乳腺癌和卵巢癌預(yù)防性手術(shù)和增加乳腺定期檢查次數(shù)。
BRCA1/2基因突變檢測(cè)另一個(gè)重要的應(yīng)用在于為乳腺癌患者使用新一代PARP抑制劑類抗腫瘤新藥提供療效預(yù)測(cè)。BRCA1/2基因突變顯著增加了婦女罹患乳腺癌和卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)，原因是這些突變會(huì)致使某些蛋白無效，無法修復(fù)造成額外致癌突變的DNA損壞。但是兩種基因的瑕疵使腫瘤細(xì)胞容易遭受PARP抑制劑的攻擊，因?yàn)镻ARP抑制劑能夠進(jìn)一步破壞腫瘤細(xì)胞DNA的修復(fù)機(jī)制。這種組合效果使腫瘤細(xì)胞不能修復(fù)對(duì)DNA的破壞，然后腫瘤細(xì)胞就會(huì)死掉，這種觀念被稱為“合成致死”。研究發(fā)現(xiàn)新型PARP抑制劑——奧拉帕尼對(duì)于攜帶有BRCA1/2突變的乳腺癌和卵巢癌的腫瘤患者有效。因此，了解BRCA的突變狀態(tài)對(duì)于乳腺癌治療方面的作用也日趨重要，因?yàn)樗軌蛑笇?dǎo)PARP抑制劑類藥物的應(yīng)用，利用BRCA1/2基因檢測(cè)來確定哪些乳腺癌患者會(huì)受益于奧拉帕尼，進(jìn)一步加速乳腺癌診治方式的革新，所以對(duì)于BRCA1/2基因突變的檢測(cè)具有廣泛及深遠(yuǎn)臨床應(yīng)用和市場(chǎng)開發(fā)前景。
目前，針對(duì)突變基因檢測(cè)方法主要分為兩大方向：其一是對(duì)全基因序列的檢測(cè)，其二是對(duì)已知的突變位點(diǎn)檢測(cè)。因?yàn)锽RCA1和BRCA2是兩個(gè)功能復(fù)雜的大基因，需要進(jìn)行整個(gè)基因的掃描才能確定是否存在基因突變，鑒于二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，有望成為BRCA1/2基因突變的有效檢測(cè)手段。1994年，美國率先在一些人群中開展基因篩檢，經(jīng)歷了10多年的發(fā)展，截至2005年底，包括乳腺癌基因突變的篩查，美國已有500多萬人接受了基因檢測(cè)。從總體上看，美國乳腺癌的發(fā)病率下降了70％；在美國，已經(jīng)有超過10萬名婦女接受了乳癌易感基因BRCA1和BRCA2的檢測(cè)。而在加拿大針對(duì)乳腺癌的基因檢測(cè)已成為常規(guī)檢測(cè)手段，而全部費(fèi)用由國家支付。因?yàn)榻?jīng)過衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)家測(cè)算發(fā)現(xiàn)，在早期對(duì)包括乳腺癌在內(nèi)的一些癌癥性疾病進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)和預(yù)防，遠(yuǎn)比發(fā)病后以及病情晚期治療更能減少衛(wèi)生財(cái)政的支出。
然而，在我國BRCA1/2基因突變篩查仍然是盲點(diǎn)。我國目前臨床上仍普遍采用體檢、鉬靶和B超等傳統(tǒng)手段來診斷、評(píng)價(jià)乳腺癌，這些方法存在明顯的局限性。首先，多數(shù)病人在診斷確立時(shí)已經(jīng)跨越了腫瘤的早期階段，而對(duì)于基因突變的篩查，根據(jù)其結(jié)果通過遺傳咨詢可以判斷預(yù)估患者罹患乳腺癌的危險(xiǎn)度，在乳腺癌發(fā)生前行預(yù)防性的治療，從而做到“治未病”。其次，乳腺癌病情發(fā)生發(fā)展復(fù)雜多變，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)癌癥的診治必須以每個(gè)患者的信息為基礎(chǔ)決定治療方案，從基因組的差異來對(duì)每個(gè)患者行個(gè)體化治療。安吉麗娜·朱莉和姚貝娜兩位明星，由于采取的措施不同，她們的命運(yùn)各不相同。由此可以看出，開始階段對(duì)乳腺致癌基因BRCA1/2進(jìn)行的基因檢測(cè)可以導(dǎo)致完全不同的生存預(yù)后。復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的全國多中心研究結(jié)果顯示，漢族遺傳性乳腺癌人群中BRCA1/2突變率為9.5％，這意味著對(duì)于中國遺傳性乳腺癌患者中，每10個(gè)人就至少有1個(gè)人攜帶BRCA1/2基因的突變。為此，2014年NCCN指南提出，發(fā)生在45歲以下的乳腺癌患者、60歲以下的三陰性乳腺癌患者，乃至有癌癥高危家族史的乳腺癌患者和健康人等，都有進(jìn)行乳腺癌基因突變篩查的指證。但是，目前國內(nèi)關(guān)于BRCA1/2突變的大規(guī)模篩查的方法和評(píng)估體系尚未建立，在基因分子檢測(cè)迅猛發(fā)展的今天，亟需建立穩(wěn)定的檢測(cè)技術(shù)和規(guī)范的篩查流程，并客觀科學(xué)地評(píng)估基因的遺傳變異的作用,通過個(gè)體的遺傳易感檢測(cè),來評(píng)估女性罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn),建立乳腺癌分子預(yù)警系統(tǒng)；同時(shí)，BRCA1/2突變檢測(cè)系統(tǒng)還可為PARP抑制劑類抗腫瘤新藥在乳腺癌上的應(yīng)用提供可靠的療效預(yù)測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明第一方面提供一種引物產(chǎn)品，該產(chǎn)品含有SEQ ID NO:1－84所示的引物序列。
在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述引物分為獨(dú)立包裝的兩組，其中，一組引物含SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81和82；另一組引物含SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83和84。
本發(fā)明第二方面提供一種多核苷酸序列產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含84種多核苷酸序列，其中，每一種多核苷酸序列含懸掛接頭序列和特異性引物序列，每一種多核苷酸序列所含的所述特異性引物序列各自獨(dú)立選自SEQ ID NO:1－84。
在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1－84所示的引物中，奇數(shù)編號(hào)的引物為正向引物，偶數(shù)編號(hào)的引物為反向引物，其中，在正向引物的5’端還連接有SEQ ID NO:85所示的懸掛接頭序列，在反向引物的5’端還連接有SEQ ID NO:86所示的懸掛接頭序列。
本發(fā)明第三方面提供一種BRCA1基因多重PCR建庫或BRCA1基因突變篩查試劑盒，所述試劑盒含有本文所述的引物產(chǎn)品。
在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒含有兩個(gè)獨(dú)立包裝的容器，其中一個(gè)容器含有SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81和82的混合物，另一個(gè)容器含有SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83和84的混合物。
在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還含有PCR擴(kuò)增所需的其它試劑，例如酶試劑。
在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述SEQ ID NO:1－84所示的序列中，奇數(shù)編號(hào)的引物為正向引物，偶數(shù)編號(hào)的引物為反向引物，其中，在正向引物的5’端還連接有SEQ ID NO:85所示的序列，在反向引物的5’端還連接有SEQ ID NO:86所示的序列。
在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述酶是來自Kapa Biosystems的KAPA2G Robust hotstart ready mix。
本發(fā)明第四方面提供本發(fā)明所述引物產(chǎn)品或多核苷酸序列產(chǎn)品在BRCA1基因多重PCR建庫或BRCA1基因突變篩查中的應(yīng)用。
本發(fā)明第五方面提供本發(fā)明所述引物產(chǎn)品或多核苷酸序列產(chǎn)品在制備BRCA1基因多重PCR建庫或BRCA1基因突變篩查試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明第六方面提供一種BRCA1基因多重PCR建庫或BRCA1基因突變篩查方法，所述方法包括以下步驟：
(1)使用本發(fā)明的多核苷酸序列產(chǎn)品擴(kuò)增樣品中的基因組DNA；
(2)給步驟(1)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物添加標(biāo)記的測(cè)序接頭；和
(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物測(cè)序。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及BRCA1基因突變的篩查。具體而言，本發(fā)明涉及使用SEQ ID NO:1－84所示的特異性引物序列篩查BRCA1基因中的突變。
通常，將所示84條序列分成兩組，分別與樣品混合后進(jìn)行PCR。分組的原則是組內(nèi)的引物擴(kuò)增區(qū)域沒有交叉重疊即可。在某些實(shí)施方案中，將所述84條引物分成以下兩組：SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81和82；和SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83和84。
本文中，奇數(shù)編號(hào)的序列為正向引物序列，偶數(shù)編號(hào)的序列為反向引物序列。通常，可根據(jù)后續(xù)的添加測(cè)序接頭所使用的標(biāo)記的接頭引物序列(Index Adapter Primer)中的引物序列，在每一條正向引物和每一條反向引物的5’端各添加一條懸掛接頭序列(overhang adapter sequence)?！皯覓旖宇^序列”為本領(lǐng)域周知，通常與標(biāo)記的接頭引物序列中的引物互補(bǔ)，用以經(jīng)由PCR而將測(cè)序接頭序列和樣品特異性的標(biāo)記連接到先前使用該特異性引物或者獲得的產(chǎn)物上。例如，作為示范性的例子，本發(fā)明根據(jù)Illumina官方公布的信息，分別在每一條正向引物的5’端連上SEQ ID NO:85所示的序列，在每一條反向引物的5’端連上SEQ ID NO:86所示的序列。
因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種多核苷酸序列產(chǎn)品。該多核苷酸序列產(chǎn)品含有84種多核苷酸序列，其中每一種多核苷酸序列含有懸掛接頭序列和本發(fā)明SEQ ID NO:1－84中的任意一條特異性引物，或由懸掛接頭序列和本發(fā)明SEQ ID NO:1－84中的任意一條特異性引物組成。如前所述，該多核苷酸序列產(chǎn)品中的70種多核苷酸序列可分成兩組。分組的原則是組內(nèi)的引物擴(kuò)增區(qū)域沒有交叉重疊即可。例如，在某些實(shí)施方案中，基于以下序列將所述84條多核苷酸序列分成兩組：SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81和82；和SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83和84。
本發(fā)明的引物產(chǎn)品或多核苷酸序列產(chǎn)品可以是例如組合物的形式。組合物中還可含有合適的溶劑，例如水。組合物還可以是凍干的形式。本發(fā)明的引物產(chǎn)品或多核苷酸序列產(chǎn)品可提供于試劑盒中，用于BRCA1基因多重PCR建庫或BRCA1基因突變篩查。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒可含有兩個(gè)獨(dú)立包裝的容器，其中一個(gè)容器含有SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81和82的混合物，或前文所述的相應(yīng)的含懸掛接頭序列的多核苷酸序列的混合物；另一個(gè)容器含有SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83和84的混合物，或前文所述的相應(yīng)的含懸掛接頭序列的多核苷酸序列的混合物。試劑盒還可含有PCR擴(kuò)增所需的其它試劑，例如酶試劑；以及任選的指導(dǎo)技術(shù)人員使用該試劑盒進(jìn)行PCR及測(cè)序的說明書。例如，在某些實(shí)施方案中，試劑盒中的酶可以是來自Kapa Biosystems的KAPA2G Robust hotstart ready mix。
因此，本發(fā)明也提供SEQ ID NO:1－84所示的引物，或前文所述的相應(yīng)的含懸掛接頭序列的多核苷酸序列在BRCA1基因多重PCR建庫或BRCA1基因突變篩查中的應(yīng)用，或在制備BRCA1基因多重PCR建庫或BRCA1基因突變篩查試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種BRCA1基因多重PCR建庫或BRCA1基因突變篩查方法，所述方法包括以下步驟：
(1)使用本發(fā)明的多核苷酸序列產(chǎn)品擴(kuò)增樣品中的基因組DNA；
(2)給步驟(1)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物添加標(biāo)記的測(cè)序接頭；和
(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物測(cè)序。
本文所使用的標(biāo)記的測(cè)序接頭可以是本領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)記的測(cè)序接頭。該標(biāo)記的測(cè)序接頭的結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域周知，例如通常包括測(cè)序接頭和樣品特異的標(biāo)記。通常，在擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端分別添加標(biāo)記的測(cè)序接頭。因此，在添加測(cè)序接頭后所得的產(chǎn)物中，其5’端和3’端分別是相應(yīng)的測(cè)序接頭序列。上述方法中，步驟(1)到(3)可采用本領(lǐng)域周知的技術(shù)手段實(shí)施，除了使用本發(fā)明的引物或多核苷酸序列進(jìn)行步驟(1)的擴(kuò)增。
采用本發(fā)明的引物、試劑盒和方法，可利用多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因全部外顯子區(qū)域的捕獲。相對(duì)于探針捕獲方法，極大簡化了實(shí)驗(yàn)流程，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，減少了實(shí)驗(yàn)的試劑和人工成本。另外，接頭序列的添加，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣本的平行上樣。
本發(fā)明中，術(shù)語“含有”或“包括”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”或“包括”中。
如無具體說明，本發(fā)明的各種原料均可以通過市售得到；或根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備得到。除非另有定義或說明，本文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。
本發(fā)明的其他方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照國家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。若沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，則按照通用的國際標(biāo)準(zhǔn)、常規(guī)條件、或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
實(shí)施例1：引物設(shè)計(jì)及制備
引物由Ion Ampl iSeqTM Designer軟件設(shè)計(jì)。然后在各正向引物的5’端添加序列TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:85)；在各反向引物的5’端添加序列GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:86)。
引物由上海茂槿生物技術(shù)有限公司合成。合成后引物分裝成2組，分別為組1和組2，各組引物及其描述如下表1和2所示：
表1
表2
實(shí)施例2：基因組定量
來自血液、組織和唾液等樣本DNA均可用于擴(kuò)增。本實(shí)施例使用來自手術(shù)切除的乳腺腫瘤組織DNA，共12份樣品，分別命名為BC1A01到BC1A12。每份樣品25mg組織，采用Blood&Tissue試劑盒(Qiagen)處理，抽提DNA，Nanodrop質(zhì)控。參考Qubit說明書，對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量，將DNA的濃度控制在20-50ng/μl的范圍內(nèi)。定量后DNA濃度若高于50ng/μl，則利用TE緩沖液稀釋至50ng/μl。
實(shí)施例3：PCR擴(kuò)增
采用以下PCR反應(yīng)體系及PCR程序?qū)?shí)施例2獲得的每份基因組DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，其中，每份基因組DNA樣品平行進(jìn)行兩個(gè)PCR，一個(gè)PCR采用實(shí)施例1組1引物，另一個(gè)PCR采用實(shí)施例組2引物：
(1)PCR反應(yīng)體系，25μl，其中：
酶為KAPA2G Robust hotstart ready mix(Kapa Biosystems)。
(2)PCR程序如下：
采用上述PCR方法擴(kuò)增得到兩組PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例4：PCR產(chǎn)物純化
采用以下步驟純化實(shí)施例3獲得的兩組PCR產(chǎn)物：
1.將實(shí)施例3獲得的PCR反應(yīng)液(25ul)中加入9μl磁珠(AMPure XP Beads)，移液器吹打10-15次，轉(zhuǎn)移至純化板，室溫靜置5min；
2.純化板置于磁力架，5min至溶液澄清；
3.取上清至新的純化版，加入17.5μl磁珠，吹打10-15次，室溫靜置5min；
4.純化板置于磁力架，5min至溶液澄清，去除上清；
5.加入100μl 70％乙醇洗滌；
6.純化板置于磁力架，2min至溶液澄清，去除上清；
7.室溫放置，至乙醇揮發(fā)干凈；
8.加入20μl洗脫緩沖液，充分懸浮磁珠，室溫靜置2min以洗脫DNA。置磁力架，靜置5min，取上清于新的96孔板。
實(shí)施例5：添加被標(biāo)記的測(cè)序接頭
依照Nextera Index Kit說明，添加被標(biāo)記的測(cè)序接頭。具體的PCR反應(yīng)如下：
1、PCR為20μl反應(yīng)體系，其中
酶為KAPA2G Robust hotstart ready mix(Kapa Biosystems)。
2、PCR程序：
實(shí)施例6：純化
第一步純化：
1.將實(shí)施例5的PCR反應(yīng)液(20ul)中加入14μl磁珠(AMPure XP Beads)，吹打10-15次，轉(zhuǎn)移至純化板，室溫靜置5min；
2.純化板置于磁力架，5min至溶液澄清，去除上清；
3.加入100μl 70％乙醇洗滌；
4.純化板置于磁力架，2min至溶液澄清，去除上清；
5.室溫放置，至乙醇揮發(fā)干凈；
6.加入20μl洗脫緩沖液，充分懸浮磁珠，室溫靜置2min以洗脫DNA。置磁力架，靜置5min，取上清于新的純化板；
第二步純化：
1.第一步純化產(chǎn)物中加入14μl磁珠(AMPure XP Beads)，吹打10-15次，室溫靜置5min；
2.純化板置于磁力架，5min至溶液澄清，去除上清；
3.加入100μl 70％乙醇洗滌；
4.純化板置于磁力架，2min至溶液澄清，去除上清；
5.室溫放置，至乙醇揮發(fā)干凈；
6.加入20μl洗脫緩沖液，充分懸浮磁珠，室溫靜置2min以洗脫DNA。置磁力架，靜置5min，取上清于新的96孔板。
實(shí)施例7：
參考Qubit說明書，對(duì)實(shí)施例6的純化產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。定量后的PCR文庫等摩爾混合后稀釋至2nM。文庫采用NaOH變性，標(biāo)化至8-12pM，在Miseq測(cè)序試劑盒v2中上樣600μl，機(jī)器運(yùn)行。
獲得fastq格式的原始測(cè)序數(shù)據(jù)后，使用常規(guī)方法進(jìn)行二代測(cè)序的數(shù)據(jù)分析。簡單地說，首先是BWA軟件將序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，確定序列在基因組位置，然后利用Samtools等軟件將序列排列，最后GATK尋找樣本測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組差異，獲得多態(tài)及突變位點(diǎn)，并將這些位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋。
結(jié)果如下表3、4、5和6所示。
表3：覆蓋倍數(shù)
表4：覆蓋倍數(shù)
表5：突變結(jié)果(插入缺失型)
Freq：2個(gè)等位基因的測(cè)序深度；DP：總測(cè)序深度；數(shù)據(jù)庫無rs號(hào)，則以“.”表示。
表6：突變結(jié)果(單堿基多態(tài)及突變)
Freq：2個(gè)等位基因的測(cè)序深度；DP：總測(cè)序深度。
樣品BC1A07、BC1A08、BC1A09和BC1A10未檢測(cè)到單堿基多態(tài)及突變。
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