本發(fā)明涉及動(dòng)物育種檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測(cè)公雞慢羽突變基因型的方法。

背景技術(shù)：

由于慢羽等位基因(K)控制的慢羽表型對(duì)快羽等位基因(k)控制的快羽表型為顯性，因此僅僅通過(guò)表型無(wú)法判定慢羽表型公雞個(gè)體的慢羽等位基因(K)的基因型。申請(qǐng)?zhí)枮?00910062895.0的專利公開了一種雞快慢羽分子鑒定方法；申請(qǐng)?zhí)枮?01310502809.X的專利公開了一種雞快慢羽基因型的鑒別方法和及雛雞雌雄鑒別方法；申請(qǐng)?zhí)枮?01510680524.4的專利公開了一種雞快慢羽表型的分子鑒定引物及鑒定方法，然而這些分子檢測(cè)方法也僅僅停留在分辨公雞是否為慢羽，無(wú)法判定其公雞個(gè)體的慢羽等位基因(K)的基因型。申請(qǐng)?zhí)?01310435980.3的專利公開了一種雞慢羽純系的快速選育方法，該方法判定慢羽突變的基因型依然只能通過(guò)測(cè)交的方法，不僅過(guò)程繁雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且容易出錯(cuò)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種檢測(cè)公雞慢羽突變基因型的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種檢測(cè)公雞慢羽突變基因型的方法，具體包括如下步驟：

S1.抽取被檢測(cè)個(gè)體的血樣DNA，并且將之稀釋至40～100nmol/μL；

S2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：熒光定量PCR儀的型號(hào)為美國(guó)Bio-rad CFX96；熒光定量試劑為Bio-rad SYBR Green熒光定量PCR Mix；熒光定量引物序列如SEQ ID NO:1～4所示；

S3.計(jì)算被檢個(gè)體的△Ct值，根據(jù)△Ct判定個(gè)體的基因型，當(dāng)ΔCt>1.5時(shí)為雜合子，0.3<ΔCt<1.3為純合子，1.5≥ΔCt≥1.3時(shí)淘汰。

(Elferink MG et al.，BMC Genomics.2008，9(391)基于慢羽突變特點(diǎn)，公開了一種根據(jù)純合子和雜合子之間的拷貝數(shù)差異來(lái)鑒定慢羽公雞的慢羽突變等位基因的基因型的方法。本發(fā)明申請(qǐng)人依據(jù)其提供的方法對(duì)已知慢羽基因型的個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用不同型號(hào)和品牌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀以及不同品牌的熒光定量試劑時(shí)，其結(jié)果并不一致，不能夠準(zhǔn)確鑒定慢羽基因型。這點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和以往本領(lǐng)域技術(shù)人員的認(rèn)識(shí)不太一樣。通常建立一種基礎(chǔ)方法之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員都會(huì)認(rèn)為儀器型號(hào)、試劑類型不會(huì)對(duì)方法的普遍適用性造成根本性影響，但是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，利用不同型號(hào)和品牌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀以及不同品牌的熒光定量試劑時(shí)，其結(jié)果并不一致，而且，還發(fā)現(xiàn)儀器型號(hào)、試劑類型、樣品DNA濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響作用不是獨(dú)立的，這三種因素之間相輔相成，綜合起作用。因此，發(fā)明人綜合儀器型號(hào)、試劑類型、樣品DNA濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的綜合影響因素，建立了一套準(zhǔn)確率100％的檢測(cè)方法。慢羽表型是由于Z染色體上部分片段重復(fù)導(dǎo)致的，在重復(fù)片段結(jié)合位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物BreakF和BreakR(產(chǎn)物為說(shuō)明書附圖1中的灰色線段)以及重復(fù)片段外側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物(產(chǎn)物為說(shuō)明書附圖1中的黑色線段)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，計(jì)算Break和Control之間的△Ct值。當(dāng)被檢個(gè)體為雜合子時(shí)理論的△Ct＝Ct(Break)-Ct(Control)＝1，當(dāng)被檢個(gè)體為純合子時(shí)△Ct＝Ct(Break)-Ct(Control)＝0。

作為優(yōu)選實(shí)施方式，步驟S2所述熒光定量PCR擴(kuò)增體系如下：PCR MIX：10μL、雙蒸水:7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；擴(kuò)增程序如下：94℃變性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s 32次循環(huán)32次；72℃延伸10min。

更優(yōu)選地，S1中取被檢測(cè)個(gè)體的血樣DNA，并且將之稀釋至80nmol/μL。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)周期短，速度快，從拿到待檢個(gè)體血樣到?jīng)Q定被檢個(gè)體的選淘只需要2天時(shí)間，每人每天至少可以完成144個(gè)體的檢測(cè)；(2)準(zhǔn)確率100％，由于該方法是檢測(cè)與慢羽表型相關(guān)的致因突變的基因型，因此該方法可以做到100％的準(zhǔn)確；(3)環(huán)節(jié)少，不易出錯(cuò)，與測(cè)交等不同，整個(gè)過(guò)程只涉及采樣和基因型分型兩個(gè)步驟，因此不易出錯(cuò)。

附圖說(shuō)明

圖1為檢測(cè)原理示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例1 不同濃度的DNA對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

本實(shí)施例所用動(dòng)物材料為35只已知為慢羽純合子的公雞個(gè)體，35只已知為慢羽雜合子的公雞個(gè)體。

一種檢測(cè)公雞慢羽突變基因型的方法，包括如下步驟：

S1.DNA抽提：采用一次性注射器從雞翅下靜脈中抽取約1mL血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約200μL的2％無(wú)菌EDTA抗凝劑的1.5mL離心管中，輕輕搖勻，記錄翅號(hào)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因組DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奧斯泊F等，1998)：

(1)取全血30μL置于1.5mL離心管，分別加入470μL1×SET緩沖液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均勻后放于55℃水浴過(guò)夜；

(2)取出樣本于1.5mL離心管，加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(3)取上清，再次加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(4)取上清，加入500μL氯仿-異戊醇(23：1)輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(5)取上清，加入1mL冰無(wú)水乙醇(-20℃)，來(lái)回?fù)u擺以沉淀DNA，10,000rpm離心10min后倒出乙醇；

(6)用1mL 75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱內(nèi)烘干；

(7)待DNA完全干燥后加入300μL滅菌后的雙蒸水溶解，50℃水浴鍋中過(guò)

夜以溶解DNA；

(8)存放于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(9)測(cè)定被檢個(gè)體的DNA濃度，每個(gè)樣本抽取50μL并且將之稀釋至80ng/μL。

S2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將上述未稀釋和稀釋至80ng/uL的DNA樣本分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以檢測(cè)DNA濃度對(duì)于基因型判定的準(zhǔn)確性。利用Bio-rad CFX96進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，定量試劑采用Bio-rad SYBR Green熒光定量PCR Mix。擴(kuò)增體系為：PCR MIX：10μL、雙蒸水：7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5s，94℃變性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s，循環(huán)32次；72℃延伸10min。

S3.計(jì)算被檢個(gè)體的△Ct值：分別計(jì)算不同濃度下不同基因型個(gè)體對(duì)應(yīng)的△Ct值，結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表1。由結(jié)果可以看出，DNA濃度統(tǒng)一為80ng/μL的情況下純合子對(duì)應(yīng)的△Ct值范圍為0.33～1.3，雜合子對(duì)應(yīng)1.5～3.04，兩種基因型對(duì)應(yīng)的△Ct值范圍無(wú)交集；當(dāng)被檢個(gè)體DNA未進(jìn)行稀釋統(tǒng)一濃度的情況下，純合子對(duì)應(yīng)的△Ct值范圍為0.45～1.56，雜合子對(duì)應(yīng)1.52～2.99，在其交集范圍(1.52～1.56)有1個(gè)慢羽純合子和4個(gè)雜合子。從上述結(jié)果來(lái)看，在統(tǒng)一為80ng/μL的濃度的情況下，能得到的結(jié)果準(zhǔn)確率為100％，而不統(tǒng)一濃度的情況下7.14％(5/70)的個(gè)體尚不能判定準(zhǔn)確結(jié)果。

表1不同濃度下慢羽純合子和慢羽雜合子△Ct值統(tǒng)計(jì)

同時(shí)，發(fā)明按照上述方法將DNA濃度分別統(tǒng)一為40ng/μL、100ng/μL、30ng/μL或140ng/μL，分別對(duì)35只已知為慢羽純合子的公雞個(gè)體，35只已知為慢羽雜合子的公雞個(gè)體進(jìn)行△Ct值統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA濃度分別統(tǒng)一為30ng/μL或140ng/μL時(shí)，純合子對(duì)應(yīng)的△Ct值范圍和雜合子對(duì)應(yīng)的△Ct值范圍存在交叉現(xiàn)象，不能100％準(zhǔn)確判斷純合子和雜合子。

實(shí)施例2 兩種不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

本實(shí)施例所用動(dòng)物材料為35只已知為慢羽純合子的公雞個(gè)體，35只已知為慢羽雜合子的公雞個(gè)體；熒光定量PCR儀型號(hào)為ABI 7300與Bio-rad CFX96。

一種檢測(cè)公雞慢羽突變基因型的方法，包括如下步驟：

S1.DNA抽提：采用一次性注射器從雞翅下靜脈中抽取約1mL血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約200μL的2％無(wú)菌EDTA抗凝劑的1.5mL離心管中，輕輕搖勻，記錄翅號(hào)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因組DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奧斯泊F等，1998)：

(1)取全血30μL置于1.5mL離心管，分別加入470μL1×SET緩沖液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均勻后放于55℃水浴過(guò)夜；

(2)取出樣本于1.5mL離心管，加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(3)取上清，再次加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(4)取上清，加入500μL氯仿-異戊醇(23：1)輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(5)取上清，加入1mL冰無(wú)水乙醇(-20℃)，來(lái)回?fù)u擺以沉淀DNA，10,000rpm離心10min后倒出乙醇；

(6)用1mL75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱內(nèi)烘干；

(7)待DNA完全干燥后加入300μL滅菌后的雙蒸水溶解，50℃水浴鍋中過(guò)夜以溶解DNA；

(8)存放于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(9)測(cè)定被檢個(gè)體的濃度，并且將之稀釋至80ng/μL。

S2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Bio-rad SYBR Green熒光定量PCR Mix。擴(kuò)增體系為：PCR MIX：10μL、雙蒸水:7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5s，94℃變性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s，循環(huán)32次；72℃延伸10min。

S3.計(jì)算被檢個(gè)體的△Ct值：分別計(jì)算不同實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)應(yīng)的△Ct值，結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2。由結(jié)果可以看出，Bio-rad CFX96對(duì)應(yīng)的純合子△Ct值范圍為0.33～1.3，雜合子對(duì)應(yīng)1.5～3.04，兩種基因型對(duì)應(yīng)的△Ct值范圍無(wú)交集；用ABI 7300檢測(cè)純合子△Ct值為0.3～1.61，雜合子對(duì)應(yīng)的△Ct值范圍為1.44～3，在其交集范圍(1.44～1.61)有5個(gè)慢羽純合子和6個(gè)雜合子。從上述結(jié)果來(lái)看，應(yīng)用Bio-rad CFX96能得到的結(jié)果準(zhǔn)確率為100％，而ABI7300則有15.7％(11/70)的個(gè)體尚不能判定準(zhǔn)確結(jié)果。

表2不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)應(yīng)的△Ct值

實(shí)施例3 不同實(shí)時(shí)熒光定量試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

本實(shí)施例所用動(dòng)物材料為35只已知為慢羽純合子的公雞個(gè)體，35只已知為慢羽雜合子的公雞個(gè)體；熒光定量PCR儀型號(hào)為Bio-rad CFX96。

一種檢測(cè)公雞慢羽突變基因型的方法，具體步驟同實(shí)施例1，唯一不同的所使用的熒光定量試劑分別為Bio-rad SYBR Green熒光定量PCR Mix或KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix的試劑根本擴(kuò)增不出來(lái)結(jié)果。

實(shí)施例4 確認(rèn)△Ct(Ct_(Break)-Ct_(Control))值的范圍

本實(shí)施例所用動(dòng)物材料為35只已知為慢羽純合子的公雞個(gè)體，35只已知為慢羽雜合子的公雞個(gè)體。

一種檢測(cè)公雞慢羽突變基因型的方法，包括如下步驟：

S1.DNA抽提：采用一次性注射器從雞翅下靜脈中抽取約1mL血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約200μL的2％無(wú)菌EDTA抗凝劑的1.5mL離心管中，輕輕搖勻，記錄翅號(hào)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因組DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奧斯泊F等，1998)：

(1)取全血30μL置于1.5mL離心管，分別加入470μL1×SET緩沖液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均勻后放于55℃水浴過(guò)夜；

(2)取出樣本于1.5mL離心管，加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(3)取上清，再次加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(4)取上清，加入500μL氯仿-異戊醇(23：1)輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(5)取上清，加入1mL冰無(wú)水乙醇(-20℃)，來(lái)回?fù)u擺以沉淀DNA，10,000rpm離心10min后倒出乙醇；

(6)用1mL75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱內(nèi)烘干；

(7)待DNA完全干燥后加入300μL滅菌后的雙蒸水溶解，50℃水浴鍋中過(guò)夜以溶解DNA；

(8)存放于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(9)測(cè)定被檢個(gè)體的濃度，并且將之稀釋至80ng/μL。

S2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：利用Bio-rad CFX96進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，定量試劑采用Bio-rad SYBR Green熒光定量PCR Mix。擴(kuò)增體系為：PCR MIX：10μL、雙蒸水:7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5s，94℃變性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s，循環(huán)32次；72℃延伸10min。

S3.計(jì)算被檢個(gè)體△Ct值，確認(rèn)慢羽純合子與雜合子個(gè)體的△Ct值的范圍(見表3)。由表3中的數(shù)據(jù)可以看出純合子個(gè)體的△Ct值范圍為0.33～1.30，最大值為1.30；雜合子個(gè)體△Ct值范圍為1.50～3.04，最小值為1.50。據(jù)此我們將判定慢羽基因型的范圍標(biāo)準(zhǔn)制定如下：△Ct≥1.50時(shí)為雜合子，△Ct≤1.30為純合子，1.50＞△Ct＞1.30時(shí)不做鑒定并且將之淘汰。

表3 35只已知為慢羽純合子的公雞個(gè)體和35只已知為慢羽雜合子的公雞個(gè)體的△Ct

注：表格中以斜體標(biāo)示的為純合和雜合子對(duì)應(yīng)的△Ct值的最大值和最小值。

實(shí)施例5 從被檢個(gè)體中挑出慢羽雜合子

本實(shí)施例所用材料為已知基因型的慢羽個(gè)體，其中有雜合子和純合子。

一種檢測(cè)公雞慢羽突變基因型的方法，包括如下步驟：

S1.DNA抽提：采用一次性注射器從雞翅下靜脈中抽取約1mL血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約200μL的2％無(wú)菌EDTA抗凝劑的1.5mL離心管中，輕輕搖勻，記錄翅號(hào)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因組DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奧斯泊F等，1998)：

(1)取全血30μL置于1.5mL離心管，分別加入470μL1×SET緩沖液、12.5μL20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均勻后放于55℃水浴過(guò)夜；

(2)取出樣本于1.5mL離心管，加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(3)取上清，再次加入500μL飽和苯酚，輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(4)取上清，加入500μL氯仿-異戊醇(23：1)輕搖20min，10,000rpm離心10min；

(5)取上清，加入1mL冰無(wú)水乙醇(-20℃)，來(lái)回?fù)u擺以沉淀DNA，10,000rpm離心10min后倒出乙醇；

(6)用1mL75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱內(nèi)烘干；

(7)待DNA完全干燥后加入300μL滅菌后的雙蒸水溶解，50℃水浴鍋中過(guò)夜以溶解DNA；

(8)存放于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(9)測(cè)定被檢個(gè)體的濃度，并且將之稀釋至80ng/μL。

S2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：利用Bio-rad CFX96進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，定量試劑采用Bio-rad SYBR Green熒光定量PCR Mix。PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：PCR MIX：10μL、雙蒸水:7.6μL、DNA模板：2μL、上游引物：0.2μL、下游引物：0.2μL；擴(kuò)增程PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：94℃變性5s，94℃變性5s；94℃、5s，58℃、5s，72℃、5s，循環(huán)32次；72℃延伸10min。

S3.計(jì)算被檢個(gè)體△Ct值，判定個(gè)體的基因型。根據(jù)△Ct值的范圍，將被檢個(gè)體分型，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示79個(gè)體中有76個(gè)被準(zhǔn)確判型，在給出判型結(jié)果的76個(gè)體中準(zhǔn)確率達(dá)到了100％；另外3個(gè)體不能夠判型。從該實(shí)施例的結(jié)果來(lái)看，該方法可以快速準(zhǔn)確的鑒定慢羽純合子公雞，為慢羽純系的快速建立提供技術(shù)支持。

表4分子方法對(duì)已知基因型慢羽個(gè)體進(jìn)行基因型鑒定的結(jié)果

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種檢測(cè)公雞慢羽突變基因型的方法

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> ControlF

<400> 1

acgctggctt tcccaacag 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> ControlR

<400> 2

agactgccac ataccagaag ca 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> BreakF

<400> 3

acaagtgtca gactagggct agca 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> BreakR

<400> 4

tgaaaccatc cctggagaga tg 22