本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)SOX4基因靶點(diǎn)的小干擾RNA、短發(fā)卡RNA及重組載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家，2015年國(guó)家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，在全國(guó)腫瘤登記地區(qū)食管癌的發(fā)病率居癌癥發(fā)病順位的第6位（21.6/10萬人），死亡率居第4位。我國(guó)食管癌發(fā)病區(qū)具有明顯的地域特征，主要集中在河南、河北、山西、川北、蘇北以及廣東汕頭和梅縣等地區(qū)。病理分型上以食管鱗狀細(xì)胞癌較食管腺癌更為常見。目前食管癌的治療以手術(shù)和放化療為主，5年存活率低于20%。探尋食管癌發(fā)生過程中的病理特點(diǎn)、信號(hào)通路和關(guān)鍵分子是腫瘤防治和藥物研發(fā)的重要基礎(chǔ)和前提。

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞喪失增殖能力后進(jìn)入一種不可逆的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。細(xì)胞衰老的主要特征包括：（1）細(xì)胞停止分裂，進(jìn)入類似終末分化的狀態(tài)；（2）表達(dá)特異性的衰老相關(guān)半乳糖苷酶；（3）細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集，形成衰老相關(guān)異染色質(zhì)斑，端?？s短，組蛋白H3K9高度甲基化；（4）大量合成一些基質(zhì)重構(gòu)蛋白、趨化因子和炎性因子如PAI1/SERPINE1、MMPs、CXCL1、IL1、IL6、IL8等，也被稱為衰老相關(guān)分泌表型。這些因子不僅是衰老過程的參與者，還能激活免疫應(yīng)答、參與組織形態(tài)重構(gòu)。衰老是機(jī)體抵抗自身細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的一道天然屏障。這是由于腫瘤發(fā)生過程中的一些關(guān)鍵性事件如DNA損傷、癌基因過度活化等均能誘發(fā)細(xì)胞衰老從而抑制腫瘤的發(fā)生。其次，一些衰老抑制因素則能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。例如CD11b+Gr-1+骨髓來源抑制性細(xì)胞能通過分泌IL1R的拮抗分子IL1RA來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的衰老抵抗并促進(jìn)其增殖。此外，多數(shù)化療藥物能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的衰老并導(dǎo)致最終死亡。因此細(xì)胞衰老/抗衰老的失衡不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也有望成為藥物治療的新靶點(diǎn)。

SOX4與SOX11、SOX12同屬于SOX C家族，在胚胎期心肌、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著重要作用。SOX4的表達(dá)上調(diào)在乳腺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌中均有報(bào)道，并且受到EGFR，TGF-β，Wnt/β-catenin等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。SOX4還是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因子，參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。此外，在條件性敲除SOX4的小鼠中出現(xiàn)了多器官的異常衰老。SOX4是否參與食管鱗癌及其它類型腫瘤細(xì)胞的衰老逃逸目前并不清楚。

RNA干擾（RNAi）是利用序列特異性的、與靶基因同源的雙鏈RNA（dsRNA）對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后的信使RNA（mRNA）的分解，從而抑制靶基因表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)。其作用機(jī)制是：dsRNA被Dicer酶識(shí)別，并被切割為小干擾RNA（siRNA）。siRNA與RNA介導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合后，識(shí)別并降解同源的mRNA，特異性抑制目的基因的表達(dá)。由于RNA干擾抑制靶基因表達(dá)具有特異性強(qiáng)、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合特異靶向性的基因治療。

最初RNA干擾采樣體外合成siRNA的方法，但存在轉(zhuǎn)染效率低、轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA不能持久性表達(dá)、對(duì)靶基因表達(dá)的抑制作用短暫等缺點(diǎn)，從而限制了其應(yīng)用。將siRNA合成為短發(fā)卡RNA（shRNA）并由載體導(dǎo)入細(xì)胞，能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄生成shRNA，并進(jìn)一步加工生成靶基因特異性的siRNA，可以發(fā)揮長(zhǎng)期抑制靶基因表達(dá)的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是以SOX4基因?yàn)榘悬c(diǎn)，提供一種特異性抑制SOX4表達(dá)的小干擾RNA。

本發(fā)明的另一目的提供穩(wěn)定表達(dá)小干擾RNA的短發(fā)卡RNA。

本發(fā)明的另一目的提供包含該短發(fā)卡RNA的重組載體。

本發(fā)明的另一目的提供小干擾RNA、短發(fā)卡RNA、重組載體的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的之一，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種針對(duì)SOX4基因靶點(diǎn)的小干擾RNA，所述SOX4基因靶點(diǎn)的序列為：5’-GCGACAAGATCCCTTTCAT-3’。

進(jìn)一步地，所述小干擾RNA包括正義鏈和反義鏈，正義鏈序列為5’-GCGACAAGAUCCCUUUCAU-3’，如SEQ ID NO.1所示；反義鏈序列為5’-AUGAAAGGGAUCUUGUCGC-3’，如SEQ ID NO.2所示。

一種針對(duì)SOX4基因靶點(diǎn)的短發(fā)卡RNA，所述SOX4基因靶點(diǎn)的序列為：5’-GCGACAAGATCCCTTTCAT-3’。

進(jìn)一步地，所述短發(fā)卡RNA包含正義鏈和反義鏈，正義鏈序列為5’-GATCCGCGACAAGATCCCTTTCATTTCAAGAGAATGAAAGGGATCTTGTCGCTGA-3’，如SEQ ID NO.3所示；正義鏈序列為5’-AGCTTCAGCGACAAGATCCCTTTCATTCTCTTGAA

ATGAAAGGGATCTTGTCGCG-3’，如SEQ ID NO.4所示。

上述短發(fā)卡RNA在制備抑制SOX4基因表達(dá)的生物制劑中的應(yīng)用。

一種針對(duì)SOX4基因靶點(diǎn)的重組載體，所述重組載體包含上述的短發(fā)卡RNA。

所述重組載體為質(zhì)粒載體。

進(jìn)一步地，所述重組載體為慢病毒載體或腺病毒載體。

進(jìn)一步地，所述重組載體為在pSilencer 4.1-CMV neo質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入上述短發(fā)卡RNA得到的重組載體。

上述重組載體在制備用于治療食管鱗癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明針對(duì)SOX4設(shè)計(jì)了小干擾RNA序列和短發(fā)卡RNA序列，并構(gòu)建了相應(yīng)的重組載體。本發(fā)明的小分子干擾RNA具有與SOX4的信使RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，能有效降低食管鱗癌細(xì)胞中SOX4基因的表達(dá)水平。本發(fā)明的重組載體能在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到SOX4-shRNA，經(jīng)宿主細(xì)胞加工后可生成小分子干擾RNA，并靶向SOX4的信使RNA，降低SOX4的表達(dá)，導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)，有效抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)化療藥物阿霉素誘導(dǎo)的食管鱗癌細(xì)胞的衰老，具有抗腫瘤應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步研究SOX4在腫瘤細(xì)胞衰老逃逸中的功能及靶向SOX4的藥物研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2采用的pSilencer質(zhì)粒圖譜；

圖2是實(shí)施例3食管鱗癌組織中SOX4的表達(dá)結(jié)果；

圖3為實(shí)施例4食管鱗癌細(xì)胞KYSE410和KYSE510的SOX4表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；

圖4為實(shí)施例5食管鱗癌細(xì)胞KYSE410和KYSE510的增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖5為實(shí)施例6食管鱗癌細(xì)胞KYSE410和KYSE510的衰老實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明：

下述實(shí)施中所用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook, J., Russell, David W., 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor）。所用DNA引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；所用pSilencer載體購(gòu)自invitrogen公司；各種限制性內(nèi)切酶和Taq酶均購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自HyClone公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine購(gòu)自Invitrogen公司；KYSE510和KYSE410細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。如無特別說明，本發(fā)明采用的其它試劑均為市售商品。

實(shí)施例1

首先針對(duì)SOX4基因，根據(jù)領(lǐng)域內(nèi)通常采用的原則設(shè)計(jì)小干擾RNA序列，并合成相應(yīng)的短發(fā)卡RNA序列。

小干擾RNA正義鏈序列為5’-GCGACAAGAUCCCUUUCAU-3’，反義鏈序列為5’-AUGAAAGGGAUCUUGUCGC-3’。

短發(fā)卡RNA正義鏈序列為5’-GATCCGCGACAAGATCCCTTTCATTTCAAGAGAAT

GAAAGGGATCTTGTCGCTGA-3’；

正義鏈序列為5’-AGCTTCAGCGACAAGATCCCTTTCATTCTCTTGAAATGAAAGGGA

TCTTGTCGCG-3’。

靶向SOX4的區(qū)域?yàn)椋?’-GCGACAAGATCCCTTTCAT-3’。

正義鏈中，GCGACAAGATCCCTTTCATTTCAAGAGAATGAAAGGGATCTTGTCGC構(gòu)成轉(zhuǎn)錄后所形成RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，TTCAAGAGA形成環(huán)。

反義鏈中，GCGACAAGATCCCTTTCATTCTCTTGAAATGAAAGGGATCTTGTCGC構(gòu)成轉(zhuǎn)錄后所形成RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，TCTCTTGAA形成環(huán)。

上述DNA序列由商業(yè)化公司合成，退火后成為雙鏈DNA分子，與酶切后的pSilencer載體鏈接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ecoli擴(kuò)增，從而得到大量的靶向SOX4的干擾RNA重組載體。

實(shí)施例2

構(gòu)建靶向SOX4的干擾RNA重組載體

合成DNA序列：正義鏈和反義鏈分別溶于雙蒸水中，濃度為：1mg/mL。各取2μL，加雙蒸水至50μL，混合均勻，95℃水浴鍋中放置5min，自然冷卻至室溫。所得退火雙鏈DNA可存于-20℃冰箱備用。

pSilencer 4.1-CMV neo質(zhì)粒的圖譜如圖1所示，其中HindIII（463）與BamHI（516）之間為干擾RNA的DNA序列插入?yún)^(qū)間。

將pSilencer空載體質(zhì)粒1μg，內(nèi)切酶HindIII、BamHI各1μL（10 units），10X酶切緩沖液2μL及適當(dāng)體積的雙蒸水混合使總體積達(dá)到20μL，37℃反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后加10X DNA上樣緩沖液2μL于1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割5kbp左右DNA條帶所在的膠條并回收DNA測(cè)定濃度。

將上述退火后的雙鏈DNA用雙蒸水稀釋至8ng/μL，取1μL與0.1μg酶切回收后的pSilencer混合，加入10X鏈接緩沖液1μL，T4 DNA連接酶1μL，用雙蒸水補(bǔ)足至總體積10μL，16℃反應(yīng)2h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布于具卡納霉素抗性的瓊脂板中，37℃過夜后挑取單克隆菌落于含卡納霉素抗性LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜。菌液離心收集后抽提質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，將其命名為pSilencer-SOX4-shRNA。

實(shí)施例3

食管鱗癌細(xì)胞中SOX4的表達(dá)

在取自河南省安陽腫瘤醫(yī)院的14例食管鱗癌組織及配對(duì)的癌旁組織中檢測(cè)SOX4的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，在13個(gè)病例中（92%）SOX4在癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織；在9個(gè)病例中（64%）SOX4在癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織2倍以上。

RT-qPCR引物：SOX4的正義鏈為5’-GACCTGCTCGACCTGAAC C -3’，反義鏈為5’-CCGGGCTCGAAG TTAAAATCC-3’；GAPDH的正義鏈為5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，反義鏈為5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，95℃變性20S，60℃退火20S，73℃延伸30S，40個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例4

用pSilencer-SOX4-shRNA降低食管鱗癌細(xì)胞SOX4的表達(dá)

將人食管鱗癌細(xì)胞KYSE410和KYSE510分別按5*10⁶/孔的密度接種于6孔板，過夜后更換新鮮培養(yǎng)基。將2μg的pSilencer-SOX4-shRNA質(zhì)粒或空載體質(zhì)粒分別與4μL lipofectamine混合于200μL的無血清DMEM培養(yǎng)基中，靜置15min，逐滴加入到六孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)48h，取出細(xì)胞吸棄培養(yǎng)基，經(jīng)PBS洗滌一遍后每孔加200μL RIPA裂解液，冰上裂解15min，將裂解產(chǎn)物于4℃12000 G離心10分鐘，取上清，一部分用于測(cè)定蛋白濃度，一部分加蛋白上樣緩沖液沸水中放置5min。取50μg蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，WESTERN BLOT檢測(cè)SOX4蛋白的水平。所用SOX4抗體購(gòu)自proteintech公司。WESTERN BLOT檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組為pSilencer空載體，實(shí)驗(yàn)組為pSilencer-SOX4-shRNA，pSilencer-SOX4-shRNA可顯著降低食管鱗癌KYSE410和KYSE510細(xì)胞中SOX4的表達(dá)。

實(shí)施例5

用pSilencer-SOX4-shRNA抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖

按實(shí)施例4的方法，用pSilencer-SOX4-shRNA和空載體分別轉(zhuǎn)染6孔板中的KYSE410和KYSE510細(xì)胞。于37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)24h后，消化收集細(xì)胞按每孔1000個(gè)細(xì)胞的密度重新接種到六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)10d。吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌一遍，加入1mL濃度為0.1%的結(jié)晶紫染色液，室溫靜置10min，吸棄結(jié)晶紫染色液，PBS洗滌兩遍，拍照記錄各孔中的細(xì)胞密度。細(xì)胞增殖結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組為pSilencer空載體，實(shí)驗(yàn)組為pSilencer-SOX4-shRNA，可見實(shí)驗(yàn)組中的細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于對(duì)照組，pSilencer-SOX4-shRNA可顯著抑制食管鱗癌KYSE410和KYSE510細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例6

用pSilencer-SOX4-shRNA促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的衰老

按實(shí)施例4的方法，用pSilencer-SOX4-shRNA和空載體分別轉(zhuǎn)染6孔板中的KYSE510和KYSE410細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，并加入阿霉素使其終濃度為0.1μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h后吸棄培養(yǎng)基，PBS培養(yǎng)基洗滌一遍，用β-半乳糖苷酶染色試劑盒染色過夜。倒置顯微鏡下拍照記錄，藍(lán)色細(xì)胞為衰老細(xì)胞。衰老結(jié)果如圖5所示，對(duì)照組為pSilencer空載體，實(shí)驗(yàn)組為pSilencer-SOX4-shRNA，箭頭代表SA-β-Gal陽性的衰老細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pSilencer-SOX4-shRNA后能顯著促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的KYSE410和KYSE510細(xì)胞衰老。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

<110> 深圳大學(xué)

<120> 針對(duì)SOX4基因靶點(diǎn)的小干擾RNA、短發(fā)卡RNA及重組載體和應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgacaagau cccuuucau 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

augaaaggga ucuugucgc 19

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatccgcgac aagatccctt tcatttcaag agaatgaaag ggatcttgtc gctga 55

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcttcagcg acaagatccc tttcattctc ttgaaatgaa agggatcttg tcgcg 55