本發(fā)明屬于昆蟲誘殺控制領(lǐng)域，具體涉及臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：白蟻取食木材，是自然界重要的分解者，在世界各地廣泛分布，部分白蟻嚴(yán)重危害木建筑材料、木制家具、農(nóng)林作物等，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，被定為有害白蟻，其中主要在亞熱帶、溫帶地區(qū)分布的臺灣乳白蟻(CoptotermesformosanusShiraki)是危害最嚴(yán)重的地下白蟻之一[RustMK,SuNY.Managingsocialinsectsofurbanimportance[J].Annualreviewofentomology,2012,57:355-375.]。木質(zhì)纖維素是白蟻食物的主要成分，為適應(yīng)纖維素類食物的消化，白蟻進(jìn)化出具有高效降解纖維素的纖維素酶系統(tǒng)，包括內(nèi)切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，EG)、β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase)和外切葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase)。因此，抑制這些纖維素酶類的表達(dá)，通過饑餓使白蟻群體衰竭，是白蟻防治思路之一。目前常用的白蟻防治藥劑或誘餌，以神經(jīng)毒素、呼吸抑制劑或胃毒劑等化學(xué)農(nóng)藥為主，對環(huán)境造成破壞，亟需尋找對環(huán)境友好、針對性強(qiáng)的有效成分進(jìn)行補(bǔ)充或替代，改進(jìn)白蟻防治藥物。研究發(fā)現(xiàn)，一些糖類抑制劑，如gluconolactone、cellobioimidazole、fluoromethylcellobiose等，能抑制白蟻纖維素消化過程，可作為防治藥物的添加成分，但這些藥物不是抑制纖維素酶的活性位點(diǎn)，針對性不強(qiáng)[ZhouX,WheelerMM,OiFM,etal.Inhibitionoftermitecellulasesbycarbohydrate-basedcellulaseinhibitors:evidencefrominvitrobiochemistryandinvivofeedingstudies[J].Pesticidebiochemistryandphysiology,2008,90(1):31-41.]。近年來發(fā)展的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，利用雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)與其序列同源的mRNA分子降解，從而抑制特定基因表達(dá)。通過注射和喂食dsRNA實(shí)驗來研究昆蟲的功能基因，發(fā)現(xiàn)一些基因的沉默對昆蟲的生長發(fā)育有顯著的影響。因此，利用RNAi效應(yīng)來抑制昆蟲中必需基因的功能進(jìn)而導(dǎo)致其死亡，減少害蟲的危害，這在理論上是可行的。而且RNAi針對性強(qiáng)，只對靶標(biāo)生物有殺傷性，對其它生物、生態(tài)環(huán)境影響較少，因而具有極大的發(fā)展空間和市場前景。內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素及其衍生物，隨機(jī)水解糖苷鍵，是纖維素消化的第一步，在降解纖維素過程中起關(guān)鍵作用[楊天賜,莫建初,程家安.白蟻消化纖維素機(jī)理研究進(jìn)展[J].林業(yè)科學(xué),2006,42(1):110-115.]，但內(nèi)切葡聚糖酶基因具有多樣性，如果能針對該家族基因進(jìn)行定向抑制，通過影響白蟻的消化過程，相信能提高防治的效果。臺灣乳白蟻中該家族至少有7種編碼基因序列，但尚未有針對該家族基因進(jìn)行RNAi的抑制藥物。本發(fā)明通過研究臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的RNAi方法和效果，為臺灣乳白蟻的控制提供新途徑，也為RNAi理論和技術(shù)在害蟲控制中提供借鑒，開創(chuàng)害蟲控制的新領(lǐng)域。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明的目的是提供一種能夠殺死白蟻的臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA。為降低臺灣乳白蟻對纖維素的分解能力，替換或減少防治藥劑中的有害成分，為昆蟲防治提供一條新的途徑。本發(fā)明的臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA，其特征在于，其正義鏈的核苷酸序列為SEQIDNO.2所示的序列，其反義鏈的核苷酸序列為SEQIDNO.2所示的序列的反向互補(bǔ)序列。本發(fā)明還提供了含有上述臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。本發(fā)明的第二個目的是提供上述臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA、含有上述臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒在制備防治白蟻藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個目的是提供一種防治白蟻的藥物，其特征在于，含有上述臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA、含有上述臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒作為有效成分。所述的防治白蟻的藥物，其還含有農(nóng)藥，如氟蟲脲。本發(fā)明的dsRNA與氟蟲脲聯(lián)合使用，會對白蟻的存活的影響更大，對酶活的抑制作用更強(qiáng)，從而使得防治效果更佳。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的防治白蟻的藥物中，其臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA的濃度為2μg/cm2，氟蟲脲的濃度為0.1μg/mL。本發(fā)明經(jīng)過無數(shù)次的實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)了對白蟻防治效果非常好的，能抑制臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因家族表達(dá)的dsRNA，采用注射或體外飼喂dsRNA方法，無論是單獨(dú)飼喂dsRNA還是飼喂dsRNA聯(lián)合其它化合物的混合物，均導(dǎo)致灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因表達(dá)量降低，產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶活性受到抑制的效應(yīng)，白蟻死亡率會上升，表明利用RNAi技術(shù)能沉默臺灣乳白蟻體內(nèi)內(nèi)切葡聚糖酶基因的表達(dá)，阻礙纖維素的代謝過程，降低臺灣乳白蟻的存活率，內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA及含有該成分的產(chǎn)品，可用于白蟻防治藥物、抑食劑、消化干擾劑等的研究和應(yīng)用。附圖說明：圖1是PCR電泳圖，其中M表示DNAMarker，dsCfEG表示產(chǎn)物Cfeg，而dsGFP表示產(chǎn)物gfp；圖2是dsRNA注射后臺灣乳白蟻Cfeg基因表達(dá)檢測結(jié)果圖；圖3是dsRNA注射后臺灣乳白蟻EG活性變化圖：圖4是dsRNA喂食后臺灣乳白蟻Cfeg基因表達(dá)檢測結(jié)果圖；圖5是dsRNA喂食后臺灣乳白蟻EG活性變化圖；圖6是各引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，其中1、2、3、4表示引物對1、2、3、4擴(kuò)增的產(chǎn)物，Marker表示DNAMarker。具體實(shí)施方式：以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1：臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶家族基因保守片段的制備1.1提取臺灣乳白蟻總RNA取臺灣乳白蟻工蟻(來自本實(shí)驗飼養(yǎng)的品系)，使用總RNA提取試劑盒(TIANGEN目錄號：DP419)提取總RNA。1.2反轉(zhuǎn)錄得到cDNA使用PrimeScriptIIRTase反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa目錄號：6210A)，將步驟1.1中得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，操作步驟參考試劑盒說明書。1.3PCR擴(kuò)增目的基因片段根據(jù)臺灣乳白蟻7個已知的EG基因序列(GenBank：AB058667、AB058668、AB058670、AB058669、AB058671、EU853671、GU017483)，確定大小為780bp的保守片段(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)，且均為編碼序列。利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：dsCfeg-F：5’-CAAGTGGGTCAGGGAGATG-3’dsCfeg-R：5’-TATGCCTGCTTGCTTGTGA-3’dsCfeg-T7F：5’-taatacgactcactatagggCAAGTGGGTCAGGGAGATG-3’dsCfeg-T7R：5’-taatacgactcactatagggTATGCCTGCTTGCTTGTGA-3’。小寫字體是T7RNA聚合酶啟動子。選擇臺灣乳白蟻體內(nèi)不存在的gfp基因為陰性對照，設(shè)計特異性引物用于dsRNA的合成。gfp基因來自于廣東省生物資源應(yīng)用研究所資源昆蟲與生物工程研究中心的HT115(DE3)菌株，菌株內(nèi)含連有g(shù)fp基因的L4440質(zhì)粒。gfp基因也可以根據(jù)Genbank的公開序列進(jìn)行人工或者通過其他手段合成，這屬于本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。引物如下：dsgfp-F：5’-TTCCATGGCCAACACTTGTC-3’dsgfp-R：5’-TCAAGAAGGACCATGTGGTC-3’dsgfp-T7F：5’-taatacgactcactatagggTTCCATGGCCAACACTTGTC-3’dsgfp-T7R：5’-taatacgactcactatagggTCAAGAAGGACCATGTGGTC-3’小寫字體是T7RNA聚合酶啟動子。PCR反應(yīng)體系(20μL)為：PremixTaq12.5μL，cDNA/GFP質(zhì)粒1μL，F(xiàn)orwardPrimer1μL，ReversePrimer1μL，ddH2O9.5μL。其中引物F與T7R組對(即dsCfeg-F與dsCfeg-T7R組對、dsgfp-F和dsgfp-T7R組對)，引物T7F與R組對(即dsCfeg-R和dsCfeg-T7F組對，dsgfp-R和dsgfp-T7F組對)，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序為：95℃預(yù)變性2min(用于gfp基因dsRNA合成的菌液PCR，預(yù)變性15min)；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃延伸3min。以白蟻的cDNA為模板，得到473bpPCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該473bpPCR產(chǎn)物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，產(chǎn)物命名為：Cfeg。以gfp質(zhì)粒為模板，得到502bpPCR產(chǎn)物，gfp核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，產(chǎn)物命名為：gfp。兩個PCR產(chǎn)物的電泳圖如圖1所示。1.4CfEG基因和GFP的dsRNA的制備分別回收上述1.3得到的兩種PCR產(chǎn)物Cfeg和gfp，測定濃度，作為體外轉(zhuǎn)錄dsRNA的模板。1.4.1轉(zhuǎn)錄合成ssRNAssRNA合成體系為：RioMAXTMExpressT72×Buffer10μL、T7EnzymeMix2μL、模板DNA8μL。其中Cfeg和gfp基因的模板DNA分別使用上述方法合成的產(chǎn)物Cfeg和產(chǎn)物gfp。輕柔混勻后稍離心，37℃空氣浴轉(zhuǎn)錄4h。1.4.2退火合成dsRNA(1)混合轉(zhuǎn)錄合成的互補(bǔ)ssRNA，70℃水浴10min，室溫冷卻20min；(2)在離心管中加入2μL按1：200比例稀釋的RNaseSolution和2μLRQ1RNase-FreeDNase；(3)輕柔混勻后稍離心37℃空氣浴30min。1.4.3dsRNA的純化及濃度測定(1)在離心管中加入4.4μL醋酸鈉(3M，pH5.2)和44μL異丙醇，混勻，冰浴5min進(jìn)行dsRNA的純化；(2)4℃12,000rpm離心10min，吸出上清液；(3)用1mL的75％乙醇，漂洗沉淀1min；(4)4℃12,000rpm離心10min，吸出上清液；(5)室溫放置10min，晾干dsRNA沉淀；(6)用50μLRNaseFreedH2O溶解dsRNA，分別得到dsCfeg(以產(chǎn)物Cfeg作為模板)和dsgfp(以產(chǎn)物gfp作為模板)，測定它們的純度和濃度，-80℃保存待用。將dsCfeg和dsgfp分別測序，結(jié)果如下：dsCfeg為雙鏈RNA，由正義鏈和反義鏈組成，其正義鏈的核苷酸序列為SEQIDNO.2所示的序列，其反義鏈的核苷酸序列為SEQIDNO.2所示的序列的反向互補(bǔ)序列。dsgfp為雙鏈RNA，由正義鏈和反義鏈組成，其正義鏈的核苷酸序列為SEQIDNO.3所示的序列，其反義鏈的核苷酸序列為SEQIDNO.3所示的序列的反向互補(bǔ)序列。實(shí)施例2、dsRNA在抑制白蟻纖維素酶中的應(yīng)用2.1dsRNA注射實(shí)驗(1)將合成的待注射dsRNA溶液(dsCfeg或dsgfp)用RNaseFreedH2O稀釋到指定注射濃度，低溫保存?zhèn)溆谩?2)將待注射的饑餓處理后的白蟻，進(jìn)行CO2麻醉；(3)在體視顯微鏡下分別對白蟻進(jìn)行對照組ddH2O、陰性對照dsgfp(150ng/頭)、處理組dsCfeg1(dsCfEG150ng/頭)、dsCfeg2(dsCfEG75ng/頭)的顯微注射，每組60頭，注射量為50.6nL/頭；(4)將注射后觀察一段時間活性無明顯變化的白蟻置于26℃恒溫培養(yǎng)箱，每天分別添加一次適量滅菌蒸餾水保持濕潤狀態(tài)，觀察取食情況、白蟻活性、記錄并清除死亡白蟻。(5)分別在注射后第24h、48h、72h從4組中各隨機(jī)選取有活性的白蟻，提取總RNA并進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測RNAi后相應(yīng)基因的表達(dá)量，測定內(nèi)切葡聚糖酶(EG)活性。每組設(shè)置3個重復(fù)。(6)dsRNA注射72h后，臺灣乳白蟻的死亡率如表1所示：表1處理組ddH2OdsgfpdsCfeg1dsCfeg2死亡率(％)17.000±1.15516.667±1.20223.667±2.333*22.667±1.453**表示與對照組相比，處理組結(jié)果差異顯著(P<0.05)。結(jié)果顯示，注射72h后，注射dsCfEG1及dsCfEG2組白蟻的死亡率顯著高于注射dsgfp陰性對照組與ddH2O對照組(P<0.05)。(7)dsRNA注射后臺灣乳白蟻Cfeg基因表達(dá)檢測結(jié)果如圖2所示：結(jié)果表明：注射dsgfp與ddH2O均無顯著性差異；注射dsCfeg1和dsCfeg2之后，Cfeg基因mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著性下調(diào)(P<0.05)，其中，注射dsCfeg1(150ng/頭)的mRNA表達(dá)水平下調(diào)效果優(yōu)于注射dsCfeg2(75ng/頭)的抑制效果。(8)dsRNA注射后臺灣乳白蟻EG活性變化如圖3所示：結(jié)果表明注射dsCfeg1以及dsCfeg2后白蟻的EG活性均顯著低于對照組(P<0.05)，dsCfeg注射量為150ng/頭時對臺灣乳白蟻EG活性的抑制效果最好。2.2dsRNA喂食實(shí)驗(1)選取饑餓處理后的白蟻適量，隨機(jī)分為4組；(2)將合成的dsCfeg溶液用RNaseFreedH2O稀釋到指定濃度，分別用ddH2O和三個濃度的dsCfeg溶液均勻潤濕濾紙(60μL/片)，dsRNA濃度依次為0、1、2、5μg/cm2；(3)將4組白蟻置于26℃恒溫培養(yǎng)箱，每天分別添加一次適量滅菌蒸餾水保持濕潤狀態(tài)，觀察取食情況、白蟻活性、記錄并清除死亡白蟻；(4)分別在喂食后第1d、3d、5d、7d從4組中隨機(jī)選取有活性的白蟻，檢測RNAi后相應(yīng)基因的表達(dá)量，測定EG活性。每組設(shè)置3個重復(fù)。(5)dsRNA喂食7d后，臺灣乳白蟻的死亡率如表2所示：表2*表示與對照組相比，結(jié)果差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明喂食7d后，dsCfeg處理組白蟻的死亡率顯著高于對照組(P<0.05)，dsCfeg喂食處理后白蟻的活力低于對照組，其中dsCfeg-2μg/cm2處理組活力最低。(6)dsRNA喂食后臺灣乳白蟻Cfeg基因表達(dá)檢測結(jié)果如圖4所示：結(jié)果表明喂食dsCfeg后Cfeg基因的mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)了顯著性下調(diào)(P<0.05)，其中dsCfeg-2μg/cm2處理組的mRNA表達(dá)水平下調(diào)最明顯。(7)dsRNA喂食后臺灣乳白蟻EG活性變化如圖5所示：結(jié)果表明喂食dsCfeg后EG活性均顯著低于對照組(P<0.05)；其中dsCfeg-2μg/cm2處理組對臺灣乳白蟻EG活性的抑制效果最好。2.3dsRNA對白蟻藥物的增效作用用ddH2O、dsCfeg、氟蟲脲、dsCfeg+氟蟲脲對臺灣乳白蟻進(jìn)行處理，測定白蟻的死亡率、EG活性。具體步驟如下：(1)將100μg/mL的氟蟲脲原液用丙酮稀釋至10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時用丙酮稀釋至指定濃度；(2)用移液器將丙酮和指定濃度氟蟲脲均勻潤濕4cm2濾紙(60μL/片)，稍晾干后避光放置2d使丙酮揮發(fā)，不滴加氟蟲脲的處理選用丙酮預(yù)處理的濾紙；(3)喂食每組白蟻的濾紙分別按下表均勻潤濕(60μL/處理/片)：具體分組如表3所示表37d后死亡率結(jié)果如表4所示：表4可以看出，7天后，3個處理組的白蟻死亡率均顯著高于對照組(P<0.05)，其中dsCfeg+氟蟲脲處理的白蟻死亡率最高。EG活性變化如表5所示：表5可以看出，3個處理組測定的EG活性均顯著低于對照組(P<0.05)，其中dsCfeg+氟蟲脲處理的抑制效果最好。以上實(shí)驗證明，本發(fā)明得到的臺灣乳白蟻內(nèi)切葡聚糖酶基因的dsRNA，采用注射和喂食方式均能降低內(nèi)切葡聚糖酶基因的表達(dá)量，抑制纖維素酶活力，促進(jìn)白蟻的死亡，也能作為有效成分添加到白蟻防治藥物中，起到增加防治效果的作用。實(shí)施例3基于780bp的保守片段(其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)。本發(fā)明還利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增保守片段中的部分序列，其擴(kuò)增引物如表6所示：表6以白蟻的cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系(20μL)為：PremixTaq12.5μL，cDNA1μL，正向引物1μL，反向引物1μL，ddH2O9.5μL。PCR程序為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃延伸3min。電泳結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，引物對2擴(kuò)增效果最好，故選來作為后續(xù)dsRNA合成的引物。當(dāng)前第1頁1 2 3