本發(fā)明涉及用于分離和/或純化核酸的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑及其方法。所述裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑及方法尤其適用于分子診斷學(xué)目的。

發(fā)明背景

現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)揭示了從細胞、細胞培養(yǎng)物或病毒培養(yǎng)物分離和/或純化核酸如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的多種方法。

在該方面，手動進行的用于分離核酸的許多“經(jīng)典”方法是一步方法，包括在加入水性緩沖劑和有機萃取劑之后進行萃取。核酸保留在水相中，可在去除包含不良伴隨物質(zhì)的有機相之后分離得到。

這些方法首先使用正常無害的有機萃取劑如氯仿或苯酚，然后水溶性污染物保留在包含核酸的水相中并且需要進一步的純化步驟去除。

因此，本領(lǐng)域的替代方法獲得的重視，該方法基于使核酸選擇性吸附到固體、主要是礦物支持體如二氧化硅上。結(jié)合原則是基于在“離液鹽”和/或醇的影響下，核酸與二氧化硅表面的可逆結(jié)合。在多步方法中，將各種溶液或混合物，通常是裂解、結(jié)合、洗滌和/或洗脫溶液或混合物加入含核酸的樣品中，并且在最后的方法步驟中，將純化的核酸從在結(jié)合步驟中剛剛加入的支持體上洗脫下來。

兩種方法的基本原則基于在第一步中裂解的細胞，尤其是植物、動物、人、細菌和病毒細胞。為此，首先將細胞與破壞細胞的裂解緩沖液一起孵育。

現(xiàn)有技術(shù)揭示了用于裂解生物樣品細胞材料的緩沖劑和方法。已知的裂解緩沖劑常常包含表面活性劑聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(20)。使用該表面活性劑是為了將細胞裂解期間的污染轉(zhuǎn)化為可溶或者穩(wěn)定化狀態(tài)，將它們從核酸中去除。

不幸的是，包含聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(20)的裂解緩沖劑儲存不穩(wěn)定。例如，pH降低。一個具體的缺點在于，如果使用這些裂解緩沖劑，則儲存后分離的核酸的產(chǎn)量降低。另一個缺點在于，包含核酸的洗脫液不透明，表明存在可能干擾分離核酸的進一步應(yīng)用的污染。

因此，本發(fā)明的目的是提供克服至少一種上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點的方法，該方法具有盡可能優(yōu)異或更好的裂解、結(jié)合和/或洗滌性質(zhì)。

如權(quán)利要求1所述的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑實現(xiàn)的本發(fā)明的目的。因此，提供了一種裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑，其包含：

-至少一種離液化合物，

-至少一種緩沖化合物，優(yōu)選選自：三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羥甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1,4-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸鹽緩沖劑，和

-至少一種基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，選自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以試劑的總體積計，其用量從≥8％重量/體積到≤50％重量/體積。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑”表示裂解試劑、結(jié)合試劑或洗滌試劑的試劑，或者可用作裂解試劑也可用作結(jié)合試劑也可用作洗滌試劑的試劑。更具體說，出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑”也可表示本發(fā)明的裂解試劑、結(jié)合試劑和/或洗滌試劑的混合物。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“試劑”表示裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“離液化合物”表示以變性方式作用于蛋白質(zhì)的化合物，具體是破壞基于氫鍵形成的液態(tài)水的常規(guī)結(jié)構(gòu)。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“緩沖化合物”表示可以為水溶液提供緩沖或pH穩(wěn)定作用的化合物。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“磷酸鹽緩沖劑”表示磷酸鹽，例如磷酸二氫鹽如磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)或磷酸二氫鈉(NaH₂PO₄)，和磷酸氫鹽如磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄·2H₂O)或磷酸氫二鉀。類似地，可使用磷酸鹽的混合物。另一種常用的磷酸鹽緩沖劑是包含氯化鈉、Na₂HPO₄、氯化鉀和KH₂PO₄的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“核酸”表示但不限于：天然，優(yōu)選分離的、線性、支化或環(huán)狀核酸如RNA，具體是mRNA、siRNA、miRNA、snRNA、tRNA、hnRNA或核酶，DNA，質(zhì)粒DNA等，合成或修飾的核酸，體外轉(zhuǎn)錄物，例如寡核苷酸，更具體是引物、探針或PCR可用的標準品，地高辛配基(digoxygenin)、生物素或熒光染料標記的核酸，甲基化核酸或“PNA”(“肽核酸”)。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“表面活性劑”表示界面活性和/或表面活性物質(zhì)。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“脂肪醇”表示鏈長6-22個碳原子，優(yōu)選8-20個碳原子，優(yōu)選10-18個碳原子，更優(yōu)選12-18個碳原子的醇。尤其優(yōu)選具有12、14、16或18個碳原子的醇。雖然脂肪醇可以是單或多不飽和的，它們優(yōu)選是飽和脂肪醇。

出于本發(fā)明的目的，“聚氧乙烯”表示HO-(CH₂CH₂O)_n單元，n優(yōu)選是2-150的整數(shù)，更優(yōu)選4-120，甚至更優(yōu)選8-80，最優(yōu)選是選自下組的整數(shù)：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150。

出于本發(fā)明的目的，“聚氧丙烯”表示HO-(CH₂CH₂CH₂O)_n單元，n優(yōu)選是10-90的整數(shù)，更優(yōu)選20-80，甚至更優(yōu)選30-70，最優(yōu)選n是選自下組的整數(shù)：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和90。

出于本發(fā)明的目的，信息“％重量/體積”、“％(重量/體積)”或“％(w/v)”表示例如每100毫升的試劑或組合物中表面活性劑的克數(shù)的信息。

意外地，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑在儲存期間具有改良的穩(wěn)定性。因此，例如，本發(fā)明的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑在室溫下儲存3個月，優(yōu)選6個月，更優(yōu)選至少8個月具有穩(wěn)定的pH。更具體說，在升高的溫度下，例如在50℃儲存幾周，優(yōu)選幾個月，本發(fā)明的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑也可具有穩(wěn)定的pH。

這對于裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑是有益的，因為懷疑pH不穩(wěn)定可能與分離后獲得的包含核酸的洗脫液中污染的發(fā)生有關(guān)。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑是聚氧乙烯脂肪醇醚。

合適的聚氧乙烯脂肪醇醚的例子是聚乙氧基化月桂基、鯨蠟基、油基或硬脂基醇，它們可以單獨使用或作為混合物使用。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，聚氧乙烯脂肪醇醚包括具有6-22個碳原子的脂肪醇部分和具有2-150個(CH₂CH₂O)單元的聚氧乙烯部分。

根據(jù)本發(fā)明一個尤其優(yōu)選的實施方式，聚氧乙烯脂肪醇醚選自：聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚，聚氧乙烯硬脂基醚，和/或聚氧乙烯油基醚。

基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，特別是聚氧乙烯脂肪醇醚對于本發(fā)明內(nèi)的廣泛應(yīng)用是有益的。具體是在包含優(yōu)選選自下組的緩沖化合物的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑中觀察到改善的儲存穩(wěn)定性，這些緩沖組分優(yōu)選選自：三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羥甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1,4-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸鹽緩沖劑。

發(fā)現(xiàn)以裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑的總體積計，基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑含量在≥8％(重量/體積)到≤50％(重量/體積)的范圍內(nèi)，本發(fā)明的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑尤其具有有益效果，所述基于聚氧乙烯的非離子表面活性劑選自：聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。

如果使用表面活性劑的混合物，以試劑的總體積計，濃度信息優(yōu)選表面活性劑總含量，例如從≥8％(重量/體積)到≤50％(重量/體積)。

這對于本發(fā)明的裂解試劑尤其有益。

優(yōu)選的聚氧乙烯脂肪醇醚是乙氧基化月桂基、鯨蠟基、油基或硬脂基醇，選自：聚氧乙烯月桂基醚，聚氧乙烯鯨蠟基醚，聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚。

優(yōu)選的聚氧乙烯脂肪醇醚選自下組：聚氧乙烯(4)月桂基醚、聚氧乙烯(23)月桂基醚、聚氧乙烯(2)鯨蠟基醚、聚氧乙烯(10)鯨蠟基醚、聚氧乙烯(20)鯨蠟基醚、聚氧乙烯(2)硬脂基醚、聚氧乙烯(10)硬脂基醚、聚氧乙烯(20)硬脂基醚、聚氧乙烯(2)油基醚、聚氧乙烯(10)油基醚、聚氧乙烯(20)油基醚和/或聚氧乙烯(100)硬脂基醚。數(shù)字表述環(huán)氧乙烷單元的平均數(shù)量。

尤其適合本發(fā)明的是例如由ICI表面活性劑公司(ICI Surfactants)以商品名銷售的聚氧乙烯脂肪醇醚。

合適的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯油基醚或聚氧乙烯硬脂基醚的例子優(yōu)選選自：聚氧乙烯(4)月桂基醚聚氧乙烯(23)月桂基醚(35)、聚氧乙烯(2)鯨蠟基醚聚氧乙烯(10)鯨蠟基醚聚氧乙烯(20)鯨蠟基醚聚氧乙烯(2)硬脂基醚聚氧乙烯(10)硬脂基醚聚氧乙烯(20)硬脂基醚聚氧乙烯(2)油基醚聚氧乙烯(10)油基醚聚氧乙烯(20)油基醚和/或聚氧乙烯(100)硬脂基醚

合適的聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯油基醚或聚氧乙烯硬脂基醚也可以粉末形式使用，例如聚氧乙烯(21)硬脂基醚粉末721P)。

本發(fā)明裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑的另一個優(yōu)點在于，用于分離和/或純化核酸時，裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑顯示始終如一的分離核酸的優(yōu)良產(chǎn)量，即使裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑已在室溫或在升高的溫度下(例如最高達50℃)儲存幾周或者幾個月，而現(xiàn)有技術(shù)的緩沖劑，尤其是包含20的緩沖劑在儲存后顯示核酸產(chǎn)量較低。

使用本發(fā)明裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑的一個具體優(yōu)點在于，即使儲存幾周或幾個月后，包含核酸的洗脫液不會混濁或者僅稍許混濁。因此，洗脫液不含污染物或者至少明顯較少的污染物的優(yōu)點使得包含核酸的洗脫液的進一步應(yīng)用顯著更加有益，因為可省去降低核酸產(chǎn)量的耗時的進一步純化步驟。

次優(yōu)選包含聚氧乙烯月桂醇醚，例如聚氧乙烯(4)月桂基醚或聚氧乙烯(23)月桂基醚的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑。因此，在優(yōu)選實施方式中，裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑不含任何這些物質(zhì)。在尤其優(yōu)選的實施方式中，裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑的聚氧乙烯脂肪醇醚不是聚氧乙烯月桂基醚。

在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方式中，聚氧乙烯脂肪醇醚選自：聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚。

優(yōu)選聚氧乙烯鯨蠟醇醚、聚氧乙烯油醇醚或聚氧乙烯硬脂醇醚，選自：聚氧乙烯(10)鯨蠟基醚聚氧乙烯(20)鯨蠟基醚聚氧乙烯(20)硬脂基醚和/或聚氧乙烯(20)油基醚

尤其優(yōu)選聚氧乙烯鯨蠟醇醚或聚氧乙烯油醇醚，優(yōu)選選自：聚氧乙烯(10)鯨蠟基醚聚氧乙烯(20)鯨蠟基醚和/或聚氧乙烯(20)油基醚

更具體說，通過比較，本發(fā)明包含聚氧乙烯脂肪醇醚，具體是聚氧乙烯鯨蠟醇醚或聚氧乙烯油醇醚的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑具有尤其優(yōu)良的分離核酸，特別是病毒DNA的產(chǎn)量。更具體說，與包含20的裂解緩沖劑相比，使用新鮮制備的包含聚氧乙烯鯨蠟醇醚的裂解和/或結(jié)合試劑以及在50℃儲存幾周、甚至幾個月后使用來分離乙型肝炎病毒(HBV)，均意外地發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生顯著升高的病毒DNA產(chǎn)量。這具體提供了本發(fā)明裂解和/或結(jié)合試劑的特別優(yōu)點，因為已知乙型肝炎病毒(HBV)難以裂解。本發(fā)明的裂解試劑尤其適用于分離病毒DNA。

而且，合適的有聚乙氧基化月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇或油醇，它們分別以INCI名稱月桂醇聚醚(laureth)、鯨蠟醇聚醚(ceteth)、硬脂醇聚醚(steareth)或油酰基醇聚醚(oleth)可得。

尤其合適的乙氧基化十二烷醇、月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇或油醇的例子可以選自下組的名稱獲得：月桂醇聚醚-9、月桂醇聚醚-4、月桂醇聚醚-23、鯨蠟醇聚醚-2、鯨蠟醇聚醚-20、硬脂醇聚醚-2、硬脂醇聚醚-10、硬脂醇聚醚-20、油?；季勖?2、油?；季勖?10和/或油?；季勖?20。

進一步優(yōu)選的基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑是聚氧乙烯烷基苯基醚。優(yōu)選的聚氧乙烯烷基苯基醚具有包含5-15個碳原子、優(yōu)選6-10個碳原子的烷基。更優(yōu)選支化或非支化C₇-至C₁₀-烷基，更優(yōu)選支化或非支化C₈-和C₉-烷基，更優(yōu)選異辛基和壬基。

在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方式中，聚氧乙烯烷基苯基醚選自：聚氧乙烯壬基苯基醚和/或聚氧乙烯異辛基苯基醚。合適的聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯異辛基苯基醚例如以商品名從巴斯夫公司(BASF)獲得。

合適的聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯異辛基苯基醚的例子優(yōu)選選自：聚氧乙烯(2)壬基苯基醚聚氧乙烯(2)異辛基苯基醚聚氧乙烯(5)壬基苯基醚聚氧乙烯(5)異辛基苯基醚聚氧乙烯(9)壬基苯基醚聚氧乙烯(9)異辛基苯基醚聚氧乙烯(12)壬基苯基醚聚氧乙烯(12)異辛基苯基醚和/或聚氧乙烯(100)壬基苯基醚

更優(yōu)選的基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物也稱為“泊洛沙姆”。優(yōu)選經(jīng)驗公式HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，其中“a”表示聚氧乙烯單元的數(shù)目，“b”表示聚氧丙烯單元的數(shù)目，a/b重量比優(yōu)選在0.1至3的范圍內(nèi)。

“a”更優(yōu)選為2-150，優(yōu)選4-120，更優(yōu)選8-80，甚至更優(yōu)選“a”是選自下組的整數(shù)：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150，最優(yōu)選“a”是選自2、4、10、20、23、40、55、70和100的整數(shù)。

“b”更優(yōu)選為10-90，優(yōu)選20-80，更優(yōu)選30-70，甚至更優(yōu)選“b”是選自下組的整數(shù)：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和90，最優(yōu)選“b”是選自15、18、23、40、55、67和75的整數(shù)。

更優(yōu)選具有不同長度的聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，其中具有15-67個聚丙烯單元的聚氧丙烯嵌段被各自相互獨立具有2-130個聚乙烯單元的兩個聚氧乙烯嵌段所包圍。

合適的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物可以商品名或例如從巴斯夫公司獲得。

合適的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的例子優(yōu)選選自：PE6200、PE6400、PE6800、PE10300、PE10500、F127、F108、F108、F127和/或F68。

根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選的實施方式，裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑包含非離子型表面活性劑，以試劑的總體積計，其用量從≥9％(重量/體積)至≤40％(重量/體積)，優(yōu)選≥10％(重量/體積)至≤30％(重量/體積)，優(yōu)選≥15％(重量/體積)至≤20％(重量/體積)。

根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選的實施方式，離液化合物是鈉鹽或胍鹽，優(yōu)選選自：碘化鈉、高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍和/或兩種或更多種鹽的混合物。離液化合物優(yōu)選是胍鹽，優(yōu)選選自：鹽酸胍、硫氰酸胍和/或異硫氰酸胍。

具體說，上述離液化合物和基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑的組合有利于裂解病毒細胞和從病毒細胞分離核酸。

離液化合物的合適濃度和用量可根據(jù)樣品類型或裂解參數(shù)而變化，以試劑的總體積計，離液化合物的濃度一般優(yōu)選≥0.1M至≤10M。裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑中離液化合物的濃度優(yōu)選≥0.5M至≤8M，優(yōu)選≥0.9M至≤6M。

裂解試劑中離液化合物的濃度優(yōu)選≥3M至≤7M，更優(yōu)選≥4M至≤6M。結(jié)合試劑中離液化合物的濃度優(yōu)選≥0.5M至≤7M，更優(yōu)選≥1M至≤6M。洗滌試劑中離液化合物的濃度優(yōu)選≥0.5M至≤3.5M，更優(yōu)選≥0.9M至≤3M。

根據(jù)另一優(yōu)選的實施方式，裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑包含至少一種選自下組的緩沖化合物：三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸鹽緩沖劑。

根據(jù)一尤其優(yōu)選的實施方式，裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑包含至少一種選自下組的緩沖化合物：三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)。

裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑優(yōu)選水溶液。

根據(jù)進一步優(yōu)選的實施方式，裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑的pH從≥4至≤12，更優(yōu)選≥6至≤11，優(yōu)選≥7至≤10，更優(yōu)選≥8至≤9。

在優(yōu)選實施方式中，裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑，尤其是裂解試劑還可包含酶，例如裂解酶，具體說，例如蛋白酶K，蛋白酶(例如QIAGEN蛋白酶)，消解酶，溶細胞酶，無色肽酶，溶葡球菌酶，溶菌酶以及根據(jù)應(yīng)用，核酸酶，例如DNA酶和/或RNA酶。

本發(fā)明的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑可以是裂解試劑，結(jié)合試劑或洗滌試劑，或者本發(fā)明裂解試劑、結(jié)合試劑和/或洗滌試劑的混合物。

在離液化合物的存在下，優(yōu)選支化或非支化鏈烷醇的存在下，將核酸固定到基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)上。因此，優(yōu)選包含至少一種支鏈或支鏈鏈烷醇的結(jié)合試劑。

優(yōu)選有用的是具有1-5個碳原子的短鏈支化或非支化鏈烷醇。根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選的實施方式，支化或非支化鏈烷醇是具有1-5個碳原子的醇，優(yōu)選選自：甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、支化或非支化丁醇或戊醇、和/或它們的混合物。

除非另有說明，定義“支化或非支化鏈烷醇”，具體是丙醇、丁醇和戊醇包括任何可消耗的具體基團的異構(gòu)體形式。因此，例如，支化或非支化丙醇包括正丙醇和異丙醇，支化或非支化丁醇包括異丁醇、仲丁醇和叔丁醇，支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和異戊醇。優(yōu)選使用選自下組的醇：甲醇、乙醇、異丙醇和/或其混合物，尤其優(yōu)選使用選自下組的醇：乙醇、異丙醇和/或其混合物。

根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選的實施方式，以結(jié)合試劑的總體積計，結(jié)合試劑包含體積含量從≥20％至≤80％，優(yōu)選≥40％至≤70％，優(yōu)選≥50％至≤60％的支化或非支化鏈烷醇。

當(dāng)涉及體積和/或重量含量時，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明白選擇各組分的所述體積和/或重量含量，使得組分的總體積或總重量不超過100體積％或100重量％。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑在分離和/或純化核酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及從包含核酸的生物樣品分離和/或純化核酸的方法，該方法包括以下步驟：

a)裂解生物樣品，

b)在離液化合物和/或支化或非支化鏈烷醇的存在下，將釋放的核酸固定到基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)上，

c)任選地洗滌固定在基質(zhì)上的核酸，

d)任選地去除結(jié)合的核酸，

其中，裂解和/或固定在包含以下組分的裂解和/或結(jié)合組合物的存在下進行：

-至少一種離液化合物，和

-至少一種基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，選自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以組合物的總體積計，用量從≥0.1％重量/體積至≤50％重量/體積。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“組合物”表示裂解和/或結(jié)合組合物。

在本發(fā)明方法優(yōu)選的實施方式中，使用本發(fā)明的裂解試劑裂解樣品。使裂解試劑與要裂解的生物樣品相接觸。根據(jù)應(yīng)用，在各時間點相互獨立地加入一種或多種酶。樣品可以是液態(tài)，例如在液態(tài)臨床樣品的情況下。通常，將包含固體組分的臨床樣品，例如糞便樣品或拭子樣品，懸浮在合適的水性溶液中，然后進一步分析。通常裂解之前從培養(yǎng)基獲取細胞培養(yǎng)物，但大多數(shù)情況下避免完全干燥樣品。在完全干燥的樣品的情況下，例如凍干樣品，要先在水性溶液中重建樣品再作進一步處理，例如病毒標準品的凍干品。因此需要裂解的樣品通常包含一些液體。使樣品中存在的液體與裂解試劑相接觸。在這方面，用于從樣品分離和/或純化核酸的方法通常涉及包含裂解試劑以及樣品的或已經(jīng)加入所述樣品的溶液的其他液體的裂解組合物。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“裂解和/或結(jié)合組合物”表示從樣品分離和/或純化核酸的方法中使用的裂解和/或結(jié)合試劑，除裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑外還可包含液體。裂解和/或結(jié)合組合物優(yōu)選包含本發(fā)明的裂解和/或結(jié)合試劑。

根據(jù)所述方法另一優(yōu)選的實施方式，在本發(fā)明結(jié)合組合物存在下，使釋放的核酸固定到基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)上。

優(yōu)選使本發(fā)明的裂解和/或結(jié)合試劑與裂解的樣品相接觸。在樣品與結(jié)合試劑接觸之前可去除裂解組合物或另一種進行裂解的溶液。優(yōu)選不去除裂解組合物。優(yōu)選地，使結(jié)合試劑與包含裂解組合物的樣品相接觸。

根據(jù)所述方法尤其優(yōu)選的實施方式，在裂解組合物的存在下進行裂解，在結(jié)合組合物的存在下進行固定。因此，固定優(yōu)選在裂解組合物和結(jié)合組合物的混合物的存在下進行。

任選地，裂解試劑同時也可用作結(jié)合試劑。任選地，結(jié)合試劑同時也可用作裂解試劑。任選地，結(jié)合試劑也可用作洗滌試劑。

裂解和/或結(jié)合組合物包含至少一種離液化合物和至少一種基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，選自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以組合物的總體積計，所述基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑從≥0.1％(重量/體積)至≤50％(重量/體積)。如果使用表面活性劑的混合物，以組合物的總體積計，優(yōu)選表面活性劑總含量例如從≥0.1％(重量/體積)至≤50％(重量/體積)。

從含核酸的生物樣品分離和/或純化核酸的此類方法的優(yōu)點在于，如果使用包含至少一種離液化合物和至少一種基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑的裂解和/或結(jié)合組合物，即使在室溫或升高的溫度(例如50℃)儲存幾周或者幾個月后，包含核酸的洗脫液不會混濁或者僅稍許混濁，所述至少一種基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑選自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以組合物的總體積計，用量從≥0.1％(重量/體積)至≤50％(重量/體積)。因此，有益地，洗脫液不含污染物或者包含至少明顯較少的污染物。這使得該包含核酸的洗脫液的進一步使用顯著更加有益，因為省去了降低核酸產(chǎn)量的耗時的進一步純化步驟。

用于從含核酸的生物樣品分離和/或純化核酸的此類方法的另一個優(yōu)點在于，例如，分離的核酸，特別是病毒DNA，例如乙型肝炎病毒(HBV)DNA的尤其優(yōu)良產(chǎn)量成為可能。

“生物樣品”可理解為表示基于顆?；蚍肿拥牟牧?，具體是病毒、噬菌體和細胞如細菌細胞、酵母或霉菌細胞或人、動物或植物細胞。所述方法尤其適用于從人或動物來源的樣品材料分離核酸如DNA或RNA，例如臨床樣品如血液、血漿、血清、口、喉、鼻沖洗液、支氣管肺泡灌洗液、尿、腦脊液、痰、唾液、糞便、抽吸物、涂片/拭子、例如鼻腔涂片/拭子、口頰涂片/拭子、頸部涂片/拭子、陰道涂片/拭子、尿道涂片/拭子、咽部涂片/拭子、會陰涂片/拭子和直腸涂片/拭子、糞便、抽吸物、上皮涂片/拭子、活檢和其他組織或骨髓樣品、以及這些樣品材料在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物。

樣品也可來自環(huán)境分析、食物分析或分子生物研究領(lǐng)域，例如來自細菌培養(yǎng)物、酵母或真菌培養(yǎng)物、病毒培養(yǎng)物、噬菌體裂解物或擴增過程的產(chǎn)物，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物。

本發(fā)明方法尤其適用于從全血分離和/或純化基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA和病毒RNA，用于從全血分離和純化胞內(nèi)RNA，例如用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，也可用于分離和/或純化無細胞樣品材料中存在的自由循環(huán)的核酸。本發(fā)明的方法尤其適用于分離和/或純化病毒DNA。

生物樣品在所述方法的步驟a)中裂解。原則上，下面所列的方法適用于裂解生物樣品，所述方法選自：在離子和非離子型表面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸鋰(LiDS)或月硅酰基肌氨酸鈉(肌氨酰)的幫助下，在合適的試劑或緩沖劑中，使用離液鹽，機械撕裂，例如通過超聲方式，“弗氏細胞壓碎器”，用顆粒如玻璃球、陶瓷球或金屬顆粒研磨，或者在液氮中，通過反復(fù)凍融，或者通過煮沸，酶裂解，凍干裂解，滲透壓休克裂解，微波和/或溫度處理，和/或它們的組合。裂解優(yōu)選在離液鹽的存在下進行。

優(yōu)選在裂解組合物的存在下裂解生物樣品，所述裂解組合物包含至少一種離液化合物和至少一種基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，選自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以裂解組合物的總體積計，所述基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑從≥0.1％(重量/體積)至≤50％(重量/體積)。

更具體說，離液劑和選自下組的基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑的組合對于病毒細胞的裂解尤其有效：聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。

裂解和/或結(jié)合組合物包含至少一種離液化合物和至少一種選自下組的基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑：聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。

關(guān)于基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，在這里參見說明書的全部內(nèi)容。

合適的乙氧基化脂肪醇的例子是乙氧基化十二烷基醇、月桂醇、鯨蠟醇、油醇或硬脂醇，它們可單獨使用或作為混合物使用。優(yōu)選的聚氧乙烯脂肪醇醚是乙氧基化月桂醇醚、鯨蠟醇醚、油酰基醇醚或硬脂醇醚，選自：聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚。

優(yōu)選的聚氧乙烯脂肪醇醚選自：聚氧乙烯(4)月桂基醚、聚氧乙烯(23)月桂基醚、聚氧乙烯(2)鯨蠟基醚、聚氧乙烯(10)鯨蠟基醚、聚氧乙烯(20)鯨蠟基醚、聚氧乙烯(2)硬脂基醚、聚氧乙烯(10)硬脂基醚、聚氧乙烯(20)硬脂基醚、聚氧乙烯(2)油基醚、聚氧乙烯(10)油基醚、聚氧乙烯(20)油基醚和/或聚氧乙烯(100)硬脂基醚。數(shù)字表述環(huán)氧乙烷單元的平均數(shù)量。

合適的聚氧乙烯月桂醇醚、聚氧乙烯鯨蠟醇醚、聚氧乙烯油醇醚或聚氧乙烯硬脂醇醚的例子優(yōu)選選自：聚氧乙烯(4)月桂基醚聚氧乙烯(23)月桂基醚聚氧乙烯(2)鯨蠟基醚聚氧乙烯(10)鯨蠟基醚聚氧乙烯(20)鯨蠟基醚聚氧乙烯(2)硬脂基醚聚氧乙烯(10)硬脂基醚聚氧乙烯(20)硬脂基醚聚氧乙烯(2)油基醚聚氧乙烯(10)油基醚聚氧乙烯(20)油基醚和/或聚氧乙烯(100)硬脂基醚

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，聚氧乙烯脂肪醇醚包括具有6-22個碳原子的脂肪醇組分和具有2-150個(CH₂CH₂O)單元的聚氧乙烯組分。

在所述方法一個尤其優(yōu)選的實施方式中，聚氧乙烯脂肪醇醚選自：聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚，聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚。

在所述方法一優(yōu)選的實施方式中，聚氧乙烯脂肪醇醚選自：聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚。在該實施方式中，次優(yōu)選包含聚氧乙烯月桂醇醚，例如聚氧乙烯(4)月桂基醚或聚氧乙烯(23)月桂基醚的裂解和/或結(jié)合試劑。因此，優(yōu)選裂解和/或結(jié)合組合物不含任何這些物質(zhì)。在尤其優(yōu)選的實施方式中，裂解和/或結(jié)合試劑的聚氧乙烯脂肪醇醚不是聚氧乙烯月桂基醚。

優(yōu)選聚氧乙烯鯨蠟醇醚、聚氧乙烯油醇醚或聚氧乙烯硬脂醇醚，優(yōu)選選自聚氧乙烯(10)鯨蠟基醚聚氧乙烯(20)鯨蠟基醚聚氧乙烯(20)硬脂基醚和/或聚氧乙烯(20)油基醚尤其優(yōu)選聚氧乙烯鯨蠟醇醚或聚氧乙烯油醇醚，優(yōu)選選自：聚氧乙烯(10)鯨蠟基醚聚氧乙烯(20)鯨蠟基醚和/或聚氧乙烯(20)油基醚

而且，合適的有聚乙氧基化月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇或油醇，它們分別可以INCI名稱月桂醇聚醚(laureth)、鯨蠟醇聚醚(ceteth)、硬脂醇聚醚(steareth)或油?；季勖?oleth)獲得。

進一步優(yōu)選的基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑是聚氧乙烯烷基苯基醚。優(yōu)選烷基包含5-15個碳原子、優(yōu)選6-10個碳原子的聚氧乙烯烷基苯基醚。更優(yōu)選支化或非支化C₇-至C₁₀-烷基，更優(yōu)選支化或非支化C₈-和C₉-烷基，特別優(yōu)選異辛基和壬基。在所述方法一優(yōu)選的實施方式中，聚氧乙烯烷基苯基醚選自：聚氧乙烯壬基苯基醚和/或聚氧乙烯異辛基苯基醚。合適的聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯異辛基苯基醚例如以商品名從巴斯夫公司獲得。

更優(yōu)選的基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物也稱為“泊洛沙姆”。優(yōu)選經(jīng)驗公式HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，其中“a”表示聚氧乙烯單元的數(shù)目，“b”表示聚氧丙烯單元的數(shù)目，a/b重量比優(yōu)選在0.1至3的范圍內(nèi)。

“a”更優(yōu)選為2-150，優(yōu)選4-120，更優(yōu)選8-80，甚至更優(yōu)選“a”是選自下組的整數(shù)：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150，最優(yōu)選“a”是選自2、4、10、20、23、40、55、70和100的整數(shù)。

“b”更優(yōu)選為10-90，優(yōu)選20-80，更優(yōu)選30-70，甚至更優(yōu)選“b”是選自下組的整數(shù)：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和90，最優(yōu)選“b”是選自15、18、23、40、55、67和75的整數(shù)。

更優(yōu)選具有不同長度的聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，其中具有15-67個聚丙烯單元的聚氧丙烯嵌段被各自相互獨立具有2-130個聚乙烯單元的兩個聚氧乙烯嵌段包圍。

合適的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物可以商品名或例如從巴斯夫公司獲得。

根據(jù)所述方法一優(yōu)選的實施方式，以組合物的總體積計，裂解和/或結(jié)合組合物包含≥0.2％(重量/體積)至≤30％(重量/體積)的非離子型表面活性劑，優(yōu)選≥3％(重量/體積)至≤10％(重量/體積)，優(yōu)選≥3.2％(重量/體積)至≤8％(重量/體積)。

這對于裂解組合物以及裂解和結(jié)合組合物的混合物尤其有益。

根據(jù)所述方法一優(yōu)選的實施方式，裂解和/或結(jié)合組合物的離液化合物是鈉鹽或胍鹽，優(yōu)選選自：碘化鈉、高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍和/或兩種或更多種鹽的混合物。離液化合物優(yōu)選是胍鹽，優(yōu)選選自：鹽酸胍、硫氰酸胍和/或異硫氰酸胍。

具體說，上述離液化合物和基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑的組合有利于裂解病毒細胞和從病毒細胞分離核酸。

裂解和/或結(jié)合組合物中離液化合物的濃度從≥0.1M至≤10M是有益的。優(yōu)選離液化合物的濃度從≥1M至≤8M，優(yōu)選≥3M至≤7M，尤其優(yōu)選≥4M至≤6M。

根據(jù)所述方法一優(yōu)選的實施方式，裂解和/或結(jié)合組合物包含至少一種緩沖化合物，所述緩沖化合物選自：三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羥甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1,4-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸鹽緩沖劑。

根據(jù)所述方法一尤其優(yōu)選的實施方式，裂解和/或結(jié)合組合物包含至少一種緩沖化合物，所述緩沖化合物選自：三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)和/或磷酸鹽緩沖劑。根據(jù)所述方法又一更優(yōu)選的實施方式，裂解和/或結(jié)合組合物包含至少一種緩沖化合物，所述緩沖化合物選自：三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)。

生物樣品可以在室溫，例如在15℃至25℃裂解，或者在升高的溫度，例如從≥37℃至≤75℃的溫度進行裂解。

在優(yōu)選實施方式中，裂解組合物還可包含酶，例如蛋白酶K，蛋白酶(例如QIAGEN蛋白酶)，消解酶，溶細胞酶，無色肽酶，溶葡球菌酶，溶菌酶以及根據(jù)應(yīng)用，核酸酶，例如DNA酶和/或RNA酶。

在離液化合物和/或支化或非支化鏈烷醇的存在下，將釋放的核酸固定到基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)上。

優(yōu)選包含支化或非支化鏈烷醇的結(jié)合組合物。根據(jù)一優(yōu)選的實施方式，支化或非支化鏈烷醇是具有1-5個碳原子的醇，優(yōu)選選自：甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇和/或它們的混合物。

根據(jù)一優(yōu)選的實施方式，以結(jié)合組合物的總體積計，結(jié)合組合物包含體積含量從≥1％至≤80％的支化或非支化鏈烷醇，優(yōu)選≥5％至≤70％，優(yōu)選≥10％至≤60％，更優(yōu)選≥15％至≤50％。

根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選的實施方式，以混合物的總體積計，結(jié)合組合物的混合物包含裂解試劑和任選地一種或多種其他添加劑，優(yōu)選支化或非支化鏈烷醇，所述支化或非支化鏈烷醇的體積含量從≥1％至≤80％，優(yōu)選≥5％至≤70％，優(yōu)選≥15％至≤50％。

使樣品與基于一種或多種二氧化硅化合物如二氧化硅、硅酸鹽、玻璃和/或硅膠的基質(zhì)接觸并孵育足以實現(xiàn)結(jié)合的時間，從而分離核酸?；|(zhì)可以是現(xiàn)有技術(shù)已知的常規(guī)設(shè)計，例如顆粒形式，膜形式或濾器形式。為便于去除，優(yōu)選具有磁性的顆粒。10秒到30分鐘之間的孵育時間對于核酸是方便的。從1分鐘到20分鐘，具體約為10分鐘的孵育時間是有益的。

優(yōu)選采用具有膠狀二氧化硅涂層的磁性顆粒來分離核酸。優(yōu)選采用具有膠狀二氧化硅涂層并且平均粒度從≥1μm至≤25μm，優(yōu)選≥5μm至≤15μm，尤其優(yōu)選≥6μm至≤10μm，優(yōu)選粒度分布窄的磁性顆粒來分離核酸。更優(yōu)選地，采用具有膠狀二氧化硅涂層并且平均粒度從≥1μm至≥5μm，優(yōu)選粒度分布窄的磁性顆粒來分離核酸。

在又一優(yōu)選的實施方式中，磁性或有磁力吸引的顆粒是具有基于氧化鐵的磁心的顆粒，優(yōu)選選自磁鐵礦(Fe₃O₄)，磁赤鐵礦(γ-Fe₂-O₃)和/或鐵氧體。

能夠以有益方式使用的磁性二氧化硅顆?？蓞⒁娎鐕H申請WO 01/71732，其內(nèi)容被納入本文作為參考。

在優(yōu)選實施方式中，可使用具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性顆粒形式的基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)。

優(yōu)選在≥15℃至≤75℃的溫度進行結(jié)合，優(yōu)選≥20℃至≤70℃，尤其優(yōu)選≥46℃至≤65℃，最優(yōu)選≥50℃至≤60℃。結(jié)合也可以是室溫進行，例如≥15℃至≤28℃。

孵育后，從裂解和/或結(jié)合組合物中去除結(jié)合到基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)的核酸。當(dāng)使用磁性二氧化硅顆粒時，這可以在磁場的幫助下實現(xiàn)。例如，可通過施加磁場將磁性顆粒拖曳至在其中進行孵育的容器的壁，以合適的吸管尖端收集，或者固定到塑料涂層保護的磁棒上。用于去除裂解和/或結(jié)合組合物的合適方法步驟的例子是通過吸液或抽吸液體或者使磁性顆粒在吸管尖端或者磁棒上升起，或者降低裂解和/或結(jié)合混合物進行去除，其中分離的磁性顆粒保持同一水平。

任選地，固定到基質(zhì)上的核酸可以在去除之前進行洗滌。洗滌步驟優(yōu)選通過孵育洗滌溶液與加載的顆粒來進行，優(yōu)選涉及所述顆粒的重懸，例如通過震搖或應(yīng)用磁場。優(yōu)選去除污染的洗滌溶液，即結(jié)合后留下的裂解和/或結(jié)合組合物，具體是裂解組合物和/或結(jié)合組合物的混合物。

使用的洗滌試劑可以是常規(guī)洗滌緩沖劑或者任何其他合適的介質(zhì)。通常，優(yōu)選具有低到中度離子強度的洗滌試劑，例如10mM三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)的溶液。還可使用具有較高鹽濃度的洗滌緩沖劑，例如4-6M鹽酸胍的溶液。如上所述，本發(fā)明的洗滌試劑類似地是合適的洗滌試劑。

而且，也可使用含醇的洗滌試劑，例如具有1-5個碳原子的醇的水溶液，優(yōu)選乙醇的水溶液，具體是50-100％強度乙醇的水溶液。

優(yōu)選將固定到基質(zhì)的核酸洗滌幾次，例如2-4次，優(yōu)選用不同的洗滌試劑。在優(yōu)選實施方式中，洗滌首先用具有低到中度離子強度的洗滌試劑進行，然后用70-100％強度的乙醇水溶液。

更具體說，利用磁性顆粒，由于顆粒的磁性聚集而便于進行分離和/或洗滌步驟。

最后的洗滌步驟或水洗之后，可干燥優(yōu)選的磁性顆粒，例如真空干燥或者通過蒸發(fā)液體或者讓液體蒸發(fā)。

根據(jù)所述方法的步驟d)，可從基質(zhì)去除結(jié)合的核酸。去除核酸也成為洗脫。

也優(yōu)選使用結(jié)合到基質(zhì)(具體是磁性顆粒)上的核酸，無需去除步驟，例如用于PCR或其他擴增方法，DNA檢測方法或DNA鑒定方法。

結(jié)合的核酸可借助低鹽含量的洗脫試劑從顆粒去除。更具體說，可使用鹽含量小于0.1摩爾/升的試劑作為低鹽含量的洗脫試劑。尤其優(yōu)選包含緩沖化合物三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)的洗脫試劑。尤其適用于洗脫的還有軟化水，任選地包含一種或多種添加劑，例如絡(luò)合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、疊氮化合物和/或緩沖化合物如三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)。

具體說，使用裂解和/或結(jié)合組合物產(chǎn)生了從生物樣品分離核酸，具體是分離病毒DNA的尤其有益的方法。

即使在儲存之后，裂解和/或結(jié)合試劑的優(yōu)點尤其在于可獲得優(yōu)良產(chǎn)量。

本發(fā)明還涉及從含核酸的生物樣品分離和/或純化核酸的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明的裂解、結(jié)合和/或洗滌試劑。

在優(yōu)選實施方式中，試劑盒還包含基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)，具體是具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性顆粒形式的基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)。優(yōu)選包含在所述試劑盒中的磁性二氧化硅顆粒的例子參見國際申請WO 01/71732，其全部內(nèi)容被納入本文作為參考。

在又一優(yōu)選的實施方式中，試劑盒還可包含合適的洗滌和/或洗脫試劑，具體是本發(fā)明的洗滌試劑。

在另一優(yōu)選的實施方式中，試劑盒可包含除磁性二氧化硅顆粒之外的硅烷化載體材料，優(yōu)選具有二氧化硅膜的離心柱。

本發(fā)明還涉及基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑在溶解生物樣品的脂質(zhì)中的應(yīng)用，所述基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑選自：聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，具體是選自聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚的聚氧乙烯脂肪醇醚。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“脂質(zhì)”表示不溶于水或者至少大部分不溶于水的天然物質(zhì)。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“脂質(zhì)”包括甘油三酯類，包括脂肪和油、蠟、磷脂、鞘脂、脂質(zhì)糖，以及類異戊烯類，包括類固醇和類胡蘿卜素。更具體說，術(shù)語“脂質(zhì)”表示有機體細胞膜的脂質(zhì)組分或結(jié)構(gòu)組分，例如磷脂和鞘酯。

從含核酸的生物樣品分離和/或純化核酸的方法中，優(yōu)選使用基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑來溶解生物樣品的脂質(zhì)，所述基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑選自：聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。

關(guān)于基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，在這里參見說明書的全部內(nèi)容。

從含核酸的生物樣品分離和/或純化核酸的方法中，尤其優(yōu)選使用聚氧乙烯脂肪醇醚來溶解生物樣品的脂質(zhì)，所述聚氧乙烯脂肪醇醚選自聚氧乙烯月桂基醚，聚氧乙烯鯨蠟基醚，聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚。

在利用基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)，優(yōu)選具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性顆粒形式的基質(zhì)來分離和/或純化核酸的方法中，優(yōu)選使用基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，具體是聚氧乙烯脂肪醇醚來溶解生物樣品的脂質(zhì)。

有益地，在利用基于一種或多種二氧化硅化合物的基質(zhì)，優(yōu)選具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性顆粒形式的基質(zhì)來分離和/或純化核酸的方法中，當(dāng)使用基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，具體是聚氧乙烯脂肪醇醚時，發(fā)現(xiàn)洗脫液不含污染物或者包含至少明顯較少的污染物。

此外，本發(fā)明涉及基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑在制備儲存穩(wěn)定的結(jié)合、裂解和/或洗滌試劑中的應(yīng)用，所述基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑選自：聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，優(yōu)選聚氧乙烯脂肪醇醚，選自聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和/或聚氧乙烯油基醚。

關(guān)于基于聚氧乙烯的非離子型表面活性劑，在這里參見說明書的全部內(nèi)容。

出于本發(fā)明的目的，“儲存穩(wěn)定”在這里優(yōu)選表示與具體應(yīng)用相關(guān)，在3個月，優(yōu)選6個月，更優(yōu)選至少8個月的儲存期間不以顯著破壞所述應(yīng)用的方式發(fā)生改變的裂解、結(jié)合或洗滌試劑的性質(zhì)。在優(yōu)選實施方式中，儲存穩(wěn)定性在室溫下展示，更優(yōu)選在例如50℃的升高溫度下展示。

pH是與應(yīng)用相關(guān)的試劑的性質(zhì)之一。因此，優(yōu)選地，試劑的儲存期間pH不會顯著變化，試劑儲存期間pH優(yōu)選降低不到1。

本發(fā)明主題的進一步細節(jié)、特征和優(yōu)點可參見從屬權(quán)利要求及以下附圖說明和實施例部分，這些內(nèi)容通過實施例闡述了本發(fā)明的示例性實施方式。

圖1a、1b分別描繪了在25℃(圖1a)和50℃(圖1b)儲存33周期間，本發(fā)明的裂解試劑B(空白柱表示)和包含吐溫的裂解試劑A(實心柱表示)的pH變化。

圖2描繪了用本發(fā)明的裂解試劑B和包含20的裂解試劑A制備病毒DNA之后，針對HBV-DNA進行HBV特異性實時PCR后的CT均值。

圖3描繪了使用在50℃儲存10周后的本發(fā)明的裂解試劑B和包含20的裂解試劑A制備病毒DNA之后，針對HBV-DNA進行HBV特異性實時PCR后的CT均值。在這里，使用室溫儲存約4周的裂解試劑A作為參比。在每種情況下，使用6μl和24μl洗脫液進行實時PCR，6μl洗脫液的結(jié)果以空白柱表示，24μl洗脫液的結(jié)果以實心柱表示。

下面將基于實施例闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，以下實施例僅僅是闡述的方式而不應(yīng)限制本發(fā)明。

實施例1：穩(wěn)定性測試

用雙蒸水新鮮制備包含20％(w/v)20(弗魯卡公司(Fluka))，異硫氰酸胍，三(羥甲基)氨基甲烷的裂解試劑A和用20％(w/v)58(西格瑪公司(Sigma))代替20的裂解試劑B，將它們各自在密封容器中于25℃和50℃儲存33周。

在儲存開始時和每周間隔，于20℃-28℃的溫度用pH計(Metrohm)測定各個溶液的pH。

圖1a繪制的柱形圖表明，在25℃儲存33周期間的裂解試劑A的pH從約pH 7.8稍微降低至pH 7.2，而圖1b顯示在50℃儲存33周期間pH從約pH 7.8降至約pH 5.9。不同的是，在25℃和50℃儲存33周期間，裂解試劑B的pH保持穩(wěn)定，約為pH 8。

實施例2：病毒DNA的提取

將陰性，即不含HBV病毒的人血漿與10⁴sgU/ml乙型肝炎病毒(HBV)混合。采用市售的自動化平臺(恰根公司(Qiagen))，通過從血漿樣品純化病毒核酸的自動化方案，從各自1000μl血漿樣品提取病毒DNA。

根據(jù)所采用的方案，使樣品與方案規(guī)定體積的包含異硫氰酸胍、三(羥甲基)氨基甲烷和20％(w/v)58(西格瑪公司)和蛋白酶K的裂解試劑B以及包含載體RNA的溶液AVE相接觸。然后在65℃進行孵育以裂解樣品。然后向樣品混合物中加入方案規(guī)定體積的包含異硫氰酸胍、三(羥甲基)氨基甲烷和9％(w/v)58(西格瑪公司)和異丙醇的結(jié)合試劑C。再孵育3分鐘后，如方案所指定的那樣，加入包含磁性二氧化硅顆粒的MagAttract懸浮液并混合。在此期間，核酸結(jié)合到二氧化硅顆粒。然后分離磁性氧化硅顆粒，去除液相。然后，向二氧化硅顆粒加入方案規(guī)定體積的包含硫氰酸胍和乙醇的洗滌溶液，顆粒懸浮在洗滌溶液中。再次去除上清液，加入方案規(guī)定體積的包含Tris、NaCl和乙醇的洗滌溶液，進行第二洗滌步驟。分離和去除液相之后，用方案規(guī)定體積的水性80％強度乙醇洗滌顆粒。分離顆粒之后，去除上清液，顆?？諝飧稍?分鐘。為洗脫DNA，加入方案規(guī)定體積的洗脫溶液E，顆粒懸浮其中3分鐘。然后取出顆粒，獲得洗脫液。

根據(jù)所述方案，再從1000μl血漿樣品提取病毒DNA，改變在于使用包含20％(w/v)20(弗魯卡公司)的裂解試劑A和包含9％(w/v)20(弗魯卡公司)的結(jié)合試劑D。

對所得洗脫液各自進行HBV-特異性實時(RT-)PCR，各自使用24μl洗脫液。如圖2所示，描述熒光開始對數(shù)增加時的循環(huán)的CT值(閾值循環(huán)數(shù))的平均值表明，使用本發(fā)明的裂解試劑B和結(jié)合試劑C提取實現(xiàn)了較高的產(chǎn)量。

實施例3：裂解試劑儲存之后提取病毒DNA

包含異硫氰酸胍、三(羥甲基)氨基甲烷和20％(w/v)58(西格瑪公司)的裂解試劑B和用20％(w/v)20(弗魯卡公司)代替58的裂解試劑A各自在密封容器中于50℃儲存10周。

然后，使用市售自動化平臺(恰根公司)，通過從血漿樣品純化病毒核酸的自動化方案來提取病毒核酸。

根據(jù)實施例2所述的方案，使用市售自動化平臺(恰根公司)從各自1000μl的血漿樣品提取病毒DNA，對于不同的混合物，包含異硫氰酸胍、三(羥甲基)氨基甲烷和20％(w/v)58(西格瑪公司)的裂解試劑B以及58被20％(w/v)20(弗魯卡公司)代替的裂解試劑A各自在50℃儲存10周。所用參比是在室溫儲存約4周的裂解試劑A。

我們發(fā)現(xiàn)，使用于50℃儲存的裂解試劑A獲得的洗脫液非常混濁，而使用裂解試劑B獲得的洗脫液澄清。

在每種情況下，對獲得的6μl和24μl洗脫液進行HBV-特異性實時(RT-)PCR。如圖3所示，CT值的平均值表明，用本發(fā)明的裂解試劑B和結(jié)合試劑C提取實現(xiàn)了較高的產(chǎn)量。