本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及頭孢菌素?；竿蛔凅w及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素作為醫(yī)藥行業(yè)中最廣泛使用的抗生素，每年產(chǎn)量達(dá)3萬(wàn)噸，占整個(gè)抗生素市場(chǎng)的65％。在抗生素生產(chǎn)過(guò)程中，抗生素母核的獲得至關(guān)重要，如6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanicacid，6-APA)和7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanicacid，7-ACA)是合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的起點(diǎn)。通常，抗生素母核通過(guò)由細(xì)菌發(fā)酵得到的天然抗生素水解得到，如6-APA可由青霉素G(PenicillinG，PG)水解得到，7-ACA可由頭孢菌素C(CephalosporinC，CPC)水解得到。以7-ACA作為母核的頭孢類(lèi)抗生素是一類(lèi)高效、低毒、臨床廣泛應(yīng)用的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。但是，傳統(tǒng)的化學(xué)法制備7-ACA工藝流程復(fù)雜，通常都需要活化、縮合、保護(hù)和去保護(hù)的過(guò)程，而且反應(yīng)條件苛刻，能耗高，容易引入雜質(zhì)。相比而言，生物法采用酶作為催化劑，在水環(huán)境中進(jìn)行反應(yīng)，條件溫和，無(wú)需中間產(chǎn)物的提純過(guò)程，且由于酶具有很好的特異性和選擇性，并不要求使用純的反應(yīng)物，從而大大降低工藝的復(fù)雜性和生產(chǎn)成本，因此生物法在β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素工業(yè)生產(chǎn)中逐漸成為主導(dǎo)方法。目前工業(yè)中廣泛采用的CPC水解工藝是由D-氨基酸氧化酶(D-aminoacidoxidase，DAAO)和戊二酰基轉(zhuǎn)移酶(glutaryl-7-ACAacylase，GA)混合的兩步酶法。反應(yīng)步驟為：首先DAAO將CPC氧化成α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸(AKA-7-ACA)，并產(chǎn)生過(guò)氧化氫和氨，隨后過(guò)氧化氫迅速與AKA-7-ACA反應(yīng)生成戊二?；?7-氨基頭孢烷酸(glutaryl-7-aminocephalosporanicacid，GL-7-ACA)；最后，GA將GL-7-ACA水解得到7-ACA。由于兩步酶法水解CPC的第一步反應(yīng)中會(huì)生成副產(chǎn)物過(guò)氧化氫，對(duì)酶的穩(wěn)定性造成不可忽視的影響，造成酶的使用批次降低。因此，探索一步酶法直接催化CPC水解的研究對(duì)工業(yè)生產(chǎn)意義重大。但是，實(shí)現(xiàn)一步酶法水解CPC制備7-ACA并不容易。目前，自然界中尚未發(fā)現(xiàn)以CPC為天然底物的酶，而已知能夠水解CPC的?；妇訥L-7-ACA為天然底物，其催化CPC水解的活性和特異性都非常低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求。例如，從假單胞菌N176中提取的戊二?；D(zhuǎn)移酶，對(duì)CPC的水解活性只有對(duì)其天然底物GL-7-ACA的1/250(二者的Vmax/Km分別為0.06和15.1U·mg-1·mM-1)(LiY,ChenJ,JiangW,MaoX,ZhaoG,WangE.Invivopost-translationalprocessingandsubunitreconstitutionofcephalosporinacylasefromPseudomonassp.130.EuropeanJournalofBiochemistry1999；262:713-719.)，盡管如此，該酶也已經(jīng)是天然酶中對(duì)CPC活性較高的了。在過(guò)去二十多年的研究中，不斷有學(xué)者測(cè)定出新的頭孢菌素?；傅木w結(jié)構(gòu)，并對(duì)已有基因序列進(jìn)行突變，以此改善對(duì)CPC的水解活性，使其能夠應(yīng)用于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的工業(yè)生產(chǎn)中來(lái)。1991年，Aramori等人成功測(cè)定了頭孢菌素?；窷176的基因序列，其屬于第III類(lèi)頭孢菌素?；?。1995年，Ishii等人基于已有的頭孢菌素?；窷176的基因序列，得到了CPC催化活性相對(duì)于天然酶提高了1.7倍的單點(diǎn)突變Metβ31Phe，對(duì)頭孢菌素C的水解活性(Vmax/Km)為0.06U·mg-1·mM-1。2005年，Pollegioni等人通過(guò)易錯(cuò)PCR突變、分子建模方法、飽和突變及定向進(jìn)化等方法，在引入已有突變Metβ31Phe的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選出了4倍于起始突變體(單點(diǎn)突變Metβ31Phe)催化活性的兩點(diǎn)突變Hisβ57Ser/Hisβ70Ser，對(duì)頭孢菌素C的水解活性(Vmax/Km)為0.227U·mg-1·mM-1。但是，上述突變體中，酶的催化活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，酶的穩(wěn)定性也較差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，可為如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)或a7)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)；a4)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)；a5)在序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a6)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白質(zhì)；a7)將a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。序列表中序列2可由774個(gè)氨基酸殘基組成。序列表中序列4可由784個(gè)氨基酸殘基組成。序列表中序列6可由774個(gè)氨基酸殘基組成。序列表中序列8可由784個(gè)氨基酸殘基組成。為了使a1)或a4)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2或序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a7)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述a7)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述a7)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1自5’末端起第9至2330位、序列表中序列3自5’末端起第3至2354位、序列表中序列5自5’末端起第9至2330位或序列表中序列7自5’末端起第3至2354位所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5’端和/或3’端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子，具體可為如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)所示的DNA分子：b1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第9至2330位所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第3至2354位所示的DNA分子；b3)核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第9至2330位所示的DNA分子；b4)核苷酸序列是序列表中序列7自5’末端起第3至2354位所示的DNA分子；b5)與b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子；b6)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。序列表中序列1由2336個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1自5’末端起第9至2330位的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3由2357個(gè)核苷酸組成，序列表中序列3自5’末端起第3至2354位的核苷酸編碼序列表中序列4所示的氨基酸序列。序列表中序列5由2336個(gè)核苷酸組成，序列表中序列5自5’末端起第9至2330位的核苷酸編碼序列表中序列6所示的氨基酸序列。序列表中序列7由2357個(gè)核苷酸組成，序列表中序列7自5’末端起第3至2354位的核苷酸編碼序列表中序列8所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述蛋白質(zhì)，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的編碼序列表的序列2、序列表的序列4、序列表的序列6或序列表的序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。含有所述編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體可為將所述蛋白質(zhì)的編碼基因插入出發(fā)質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒。所述出發(fā)質(zhì)粒可為克隆載體。所述克隆載體可為載體pET28a(+)。所述重組載體可為將所述蛋白質(zhì)的編碼基因通過(guò)多克隆位點(diǎn)插入出發(fā)質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為將所述蛋白質(zhì)的編碼基因(序列表的序列1自5’末端起第9至2330位所示的DNA分子)插入載體pET28a(+)的NcoI和XhoI識(shí)別位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒pET28a-N176M1。所述重組載體具體可為將所述蛋白質(zhì)的編碼基因(序列表的序列5自5’末端起第9至2330位所示的DNA分子)插入載體pET28a(+)的NcoI和XhoI識(shí)別位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒pET28a-N176M2。所述重組微生物可為將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到重組菌。所述重組微生物具體可為將所述重組質(zhì)粒pET28a-N176M1導(dǎo)入出發(fā)微生物得到重組菌。所述重組微生物具體可為將所述重組質(zhì)粒pET28a-N176M2導(dǎo)入出發(fā)微生物得到重組菌。所述出發(fā)微生物可為酵母、細(xì)菌、藻類(lèi)或真菌。所述細(xì)菌可為大腸桿菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21(DE3)。所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系均不包括繁殖材料。所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用可為如下d1)或d2)：d1)作為頭孢菌素?；傅膽?yīng)用；d2)在制備具有頭孢菌素?；腹δ艿漠a(chǎn)品中的應(yīng)用。所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用可為如下e1)或e2)：e1)在水解頭孢菌素C中的應(yīng)用；e2)在制備用于水解頭孢菌素C的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用可為如下f1)或f2)：f1)在生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸中的應(yīng)用；f2)在制備用于生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述f2)中，所述“生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸”是以頭孢菌素C作為底物的。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)(氨基酸序列是序列表中序列4所示)對(duì)頭孢菌素C的水解活性(Vmax/Km)為0.228U·mg-1·mM-1，比純化的對(duì)照蛋白1(氨基酸序列是序列表中序列10所示)對(duì)頭孢菌素C的水解活性提高了60.6％；蛋白質(zhì)(氨基酸序列是序列表中序列4所示)水解后形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量68.67μg/mL，而純化的對(duì)照蛋白1水解后形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量為42.65μg/mL。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)(氨基酸序列是序列表中序列8所示)對(duì)頭孢菌素C的水解活性(Vmax/Km)為0.363U·mg-1·mM-1，比純化的對(duì)照蛋白2(氨基酸序列是序列表中序列12所示)對(duì)頭孢菌素C的水解活性提高了59.5％；蛋白質(zhì)(氨基酸序列是序列表中序列8所示)水解后形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量85.32μg/mL，而純化的對(duì)照蛋白2水解后形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量為53.66μg/mL?？梢?jiàn)，本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)催化頭孢菌素C的活性增強(qiáng)、形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量更高。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)在水解頭孢菌素C和/或生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為N176M1粗酶、N176M2粗酶、N176M1純酶和N176M2純酶的SDS-PAGE。圖2為重組頭孢菌素酰化酶甲和重組頭孢菌素?；敢业奈舛惹€。圖3為重組頭孢菌素?；讣椎娜刍瘻囟惹€。圖4為頭孢菌素C?；复呋^孢菌素C水解生成7-氨基頭孢烷酸的反應(yīng)式。圖5為頭孢菌素C?；敢业母咝б合嗌V檢測(cè)圖譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。結(jié)合緩沖液A：含500mMNaCl和20mM咪唑的pH8.0、100mMTris－HCl緩沖液。結(jié)合緩沖液B：含500mMNaCl和50mM咪唑的pH8.0、100mMTris－HCl緩沖液。洗脫緩沖液：含500mMNaCl和250mM咪唑的pH8.0、100mMTris－HCl緩沖液。載體pET28a(+)為Novagen公司的產(chǎn)品。大腸桿菌BL21(DE3)為寶生物工程(大連)有限公司的產(chǎn)品。層析柱為北京韋氏博慧色譜科技有限公司公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為CS-A01S-0B。10kDaUltra-0.5超濾離心管為Millipore公司產(chǎn)品。脫鹽柱為北京韋氏博慧色譜科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為CC-G01-50。C18反相柱為日本島津公司產(chǎn)品，規(guī)格為5μm、150×4.6mm。高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品，型號(hào)為L(zhǎng)C-20AT。頭孢菌素C為石藥集團(tuán)公司產(chǎn)品。7-氨基頭孢烷酸為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為191140。頭孢菌素C溶液：用去離子水溶解頭孢菌素C至其濃度為20mg/mL。7-氨基頭孢烷酸溶液：用去離子水溶解7-氨基頭孢烷酸至其濃度為0.1mg/mL。實(shí)施例1、重組頭孢菌素?；讣缀椭亟M頭孢菌素?；敢业闹苽湟弧⒅亟M質(zhì)粒的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pET28a-N176M1的構(gòu)建(1)人工合成序列表中序列1所示的雙鏈DNA分子1。(2)用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切雙鏈DNA分子1，回收酶切產(chǎn)物1。(3)用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切載體pET28a(+)，回收約5300bp的載體骨架1。(4)將酶切產(chǎn)物1與載體骨架1連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-N176M1。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pET28a-N176M1進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pET28a(+)的NcoI識(shí)別序列和XhoI識(shí)別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列1自5’末端起第9至2330位所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pET28a-N176M1中，序列表的序列1所示的DNA分子與載體骨架上的His-tag標(biāo)簽(由6個(gè)組氨酸殘基組成)的編碼序列融合，形成序列表的序列3所示的融合基因，表達(dá)序列表的序列4所示的具有His-tag標(biāo)簽的融合蛋白。2、重組質(zhì)粒pET28a-N176M2的構(gòu)建(1)人工合成序列表中序列5所示的雙鏈DNA分子2。(2)用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切雙鏈DNA分子2，回收酶切產(chǎn)物2。(3)用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切載體pET28a(+)，回收約5300bp的載體骨架1。(4)將酶切產(chǎn)物2與載體骨架1連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-N176M2。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pET28a-N176M2進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pET28a(+)的NcoI識(shí)別序列和XhoI識(shí)別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列5自5’末端起第9至2330位所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pET28a-N176M1中，序列表的序列5所示的DNA分子與載體骨架上的His-tag標(biāo)簽(由6個(gè)組氨酸殘基組成)的編碼序列融合，形成序列表的序列7所示的融合基因，表達(dá)序列表的序列8所示的具有His-tag標(biāo)簽的融合蛋白。3、重組質(zhì)粒pET28a-d1的構(gòu)建(1)人工合成序列表中序列9所示的雙鏈DNA分子3。(2)用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切雙鏈DNA分子3，回收酶切產(chǎn)物3。(3)用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切載體pET28a(+)，回收約5300bp的載體骨架1。(4)將酶切產(chǎn)物3與載體骨架1連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-d1。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pET28a-d1進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pET28a(+)的NcoI識(shí)別序列和XhoI識(shí)別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列9自5’末端起第9至2330位所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pET28a-d1中，序列表的序列9所示的DNA分子與載體骨架上的His-tag標(biāo)簽(由6個(gè)組氨酸殘基組成)的編碼序列融合形成融合基因，表達(dá)序列表的序列10所示的具有His-tag標(biāo)簽的融合蛋白。4、重組質(zhì)粒pET28a-d2的構(gòu)建(1)人工合成序列表中序列11所示的雙鏈DNA分子4。雙鏈DNA分子4的核苷酸序列記載于如下文獻(xiàn)中：PollegioniL，LorenziS，RosiniE，MarconeGL，MollaG，VergaR，CabriW，PiloneMS.EvolutionofanacylaseactiveoncephalosporinC.ProteinSci.2005；14:3064-3076.(2)用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切雙鏈DNA分子4，回收酶切產(chǎn)物4。(3)用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切載體pET28a(+)，回收約5300bp的載體骨架1。(4)將酶切產(chǎn)物4與載體骨架1連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-d2。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pET28a-d2進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pET28a(+)的NcoI識(shí)別序列和XhoI識(shí)別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列11自5’末端起第9至2330位所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pET28a-d2中，序列表的序列11所示的DNA分子與載體骨架上的His-tag標(biāo)簽(由6個(gè)組氨酸殘基組成)的編碼序列融合形成融合基因，表達(dá)序列表的序列12所示的具有His-tag標(biāo)簽的融合蛋白。二、蛋白的表達(dá)1、重組頭孢菌素?；讣椎谋磉_(dá)(1)將重組質(zhì)粒pET28a-N176M1導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌，將該重組菌命名為BL21(DE3)－N176M1。(2)取BL21(DE3)－N176M1單克隆，接種至100mLLB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)7h，得到培養(yǎng)菌液。(3)取培養(yǎng)菌液，按體積比為1:100接種至1LLB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600nm值0.6～0.8，然后加入IPTG并使其濃度為0.5mM，28℃、120rpm振蕩培養(yǎng)20h，4℃、10000rpm離心10min，收集菌體沉淀。(4)完成步驟(3)后，取菌體沉淀，加入100mLpH8.0、100mM的Tris-HCl緩沖液，重懸后超聲破碎(超聲波功率600W，循環(huán)程序?yàn)椋浩扑?s，停6s，共20min)，然后4℃、10000rpm離心10min，收集上清液。(5)完成步驟(4)后，取上清液，4℃、12000rpm離心10min(目的是進(jìn)一步去除超聲破碎帶來(lái)的細(xì)胞雜質(zhì))，得到重組頭孢菌素?；讣椎拇置敢?，以下簡(jiǎn)稱(chēng)N176M1粗酶。2、重組頭孢菌素?；敢业谋磉_(dá)按照上述步驟1的步驟，將重組質(zhì)粒pET28a-N176M1替換為重組質(zhì)粒pET28a-N176M2，其它步驟均不變，得到重組頭孢菌素?；敢业拇置敢?，以下簡(jiǎn)稱(chēng)N176M2粗酶。3、對(duì)照蛋白1的表達(dá)按照上述步驟1的步驟，將重組質(zhì)粒pET28a-N176M1替換為重組質(zhì)粒pET28a-d1，其它步驟均不變，得到對(duì)照蛋白1的粗酶液。4、對(duì)照蛋白2的表達(dá)按照上述步驟1的步驟，將重組質(zhì)粒pET28a-N176M1替換為重組質(zhì)粒pET28a-d2，其它步驟均不變，得到對(duì)照蛋白2的粗酶液。三、蛋白的純化1、重組頭孢菌素?；讣椎拇置敢旱募兓捎面嚟傊悄z為層析柱填料，采用層析柱(規(guī)格為20mL)進(jìn)行純化，具體步驟如下：(1)先用2～4個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液A平衡層析柱(流速為2mL/min)。(2)完成步驟(1)后，將N176M1粗酶上樣至層析柱(流速為1.5mL/min)。(3)完成步驟(2)后，用結(jié)合緩沖液B沖洗層析柱(流速為2mL/min)，直至洗脫液在280nm處的吸光值與結(jié)合緩沖液B在280nm處的吸光值基本相同。(4)完成步驟(3)后，用洗脫緩沖液沖洗層析柱(流速為2mL/min)，收集保留體積為18-40mL的過(guò)柱后溶液，再用10kDaUltra-0.5超濾離心管(Millipore公司產(chǎn)品)濃縮，得到濃縮蛋白。(5)完成步驟(4)后，將濃縮蛋白用脫鹽柱透析除鹽兩次(以除去濃縮蛋白中的咪唑和NaCl組分)，再置換入pH8.0、100mM的Tris－HCl緩沖液中，得到N176M1純酶。N176M1純酶的濃度通過(guò)Bradford法檢測(cè)(使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，檢測(cè)時(shí)使用的吸光度為595nm)，然后置于4℃冷藏保存。2、重組頭孢菌素?；敢业拇置敢旱募兓凑丈鲜霾襟E1，將N176M1粗酶替換為N176M2粗酶，其它步驟均不變，得到N176M2純酶。3、對(duì)照蛋白1的粗酶液的純化按照上述步驟1，將N176M1粗酶替換為對(duì)照蛋白1的粗酶液，其它步驟均不變，得到純化的對(duì)照蛋白1。4、對(duì)照蛋白2的粗酶液的純化按照上述步驟1，將N176M1粗酶替換為對(duì)照蛋白2的粗酶液，其它步驟均不變，得到純化的對(duì)照蛋白2。將上述得到的各酶進(jìn)行SDS-PAGE，部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1(M為高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì))。結(jié)果表明，N176M1粗酶、N176M2粗酶、N176M1純酶、N176M2純酶、對(duì)照蛋白1的粗酶液、對(duì)照蛋白2的粗酶液、純化的對(duì)照蛋白1和純化的對(duì)照蛋白2均含有兩條分子量條帶，且對(duì)應(yīng)分子量為22kDa(α鏈)和58kDa(β鏈)。實(shí)施例2、蛋白的穩(wěn)定性檢測(cè)1、取N176M1純酶、N176M2純酶、純化的對(duì)照蛋白1或純化的對(duì)照蛋白2，用脫鹽柱透析除鹽兩次(目的為去除減少對(duì)圓二色光譜吸光度信號(hào)的干擾)，并用10kDaUltra-0.5超濾離心管濃縮，使?jié)饪s后的蛋白樣品中蛋白的濃度為0.4－0.5mg/mL。2、取濃縮后的蛋白樣品，置于厚度為0.1cm的石英比色皿中，然后在遠(yuǎn)紫外區(qū)(波長(zhǎng)為180－260nm)測(cè)定圓二色光譜的吸光度信號(hào)，以確定其特征吸收峰，得到吸光度曲線。吸光度信號(hào)數(shù)據(jù)用平均殘基橢圓率表示，由圓二色譜儀(英國(guó)應(yīng)用光物理公司產(chǎn)品)測(cè)定并收集。結(jié)果表明(N176M1純酶和N176M2純酶的吸光度曲線見(jiàn)圖2，其中N176M1為N176M1純酶，N176M2為N176M2純酶)，N176M1純酶、N176M2純酶、純化的對(duì)照蛋白1和純化的對(duì)照蛋白2的特征吸收波長(zhǎng)均固定于220nm，溫度區(qū)間為4－85℃(精度為1℃)。測(cè)量過(guò)程中的升溫速率為1℃/min，并在隨后的1min內(nèi)使目的蛋白樣品達(dá)到熱力學(xué)平衡。3、完成步驟2后，使用Pro-DataViewer(英國(guó)應(yīng)用光物理公司產(chǎn)品)分析吸光度曲線，得到濃縮后的蛋白樣品的熔化溫度(Tm)曲線。結(jié)果表明(N176M1純酶和純化的對(duì)照蛋白1的熔化溫度(Tm)曲線見(jiàn)圖3)，純化的對(duì)照蛋白1的熔化溫度為43.8℃，N176M1純酶的熔化溫度為55.5℃，純化后的對(duì)照蛋白2的熔化溫度為51.7℃，N176M2純酶的熔化溫度為51.2℃。上述結(jié)果表明，與純化的對(duì)照蛋白1相比，N176M1純酶的熱穩(wěn)定性均有一定程度的提高；N176M2純酶與純化的對(duì)照蛋白2相比，熱穩(wěn)定性基本保持不變。實(shí)施例3、蛋白的催化活性檢測(cè)頭孢菌素?；复呋^孢菌素C的生成7-氨基頭孢烷酸的反應(yīng)式如圖4所示。為檢測(cè)實(shí)施例1純化的蛋白對(duì)頭孢菌素C是否具有催化活性，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。一、N176M1純酶的催化活性檢測(cè)1、N176M1純酶的催化活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次需進(jìn)行三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。(1)制備反應(yīng)體系1a和反應(yīng)體系1b：反應(yīng)體系1a(1mL)：由pH8.0、100mMTris-HCl緩沖液、頭孢菌素C溶液和N176M1純酶組成；反應(yīng)體系1a中，頭孢菌素C的濃度為0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、5.0mg/mL、7.0mg/mL或10.0mg/mL，N176M1純酶的濃度為0.1mg/mL。反應(yīng)體系1b(1mL)：由pH8.0、100mMTris-HCl緩沖液和N176M1純酶組成；反應(yīng)體系1b中，N176M1純酶的濃度為0.1mg/mL。作為參照組。(2)將步驟(1)制備的反應(yīng)體系1a或反應(yīng)體系1b置于37℃水浴條件下，反應(yīng)8min。(3)完成步驟(2)后，加入3mL終止液(含15％(體積百分比)乙酸和15mMNaOH的水溶液)終止反應(yīng)，得到待測(cè)溶液。(4)取步驟(3)得到的待測(cè)溶液、頭孢菌素C溶液和7-氨基頭孢烷酸溶液，分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)。使用配有C18反相柱的高效液相色譜儀進(jìn)行HPLC檢測(cè)。流動(dòng)相由15％(v/v)甲醇(A)、7.5％(v/v)乙腈(B)、1％(v/v)乙酸和76.5％(v/v)的水組成，流速為0.8mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。柱溫箱為30℃。通過(guò)Lineweaver-Burk法將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合為經(jīng)典的米氏方程(Michaelis-Mentenequation)得到酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax/Km。2、空白對(duì)照(1)制備反應(yīng)體系2反應(yīng)體系2(1mL)：由pH8.0、100mMTris-HCl緩沖液和N176M1純酶組成；反應(yīng)體系2中，N176M1純酶的濃度為0.1mg/mL。(2)將步驟(1)制備的反應(yīng)體系2置于37℃水浴條件下，反應(yīng)8min。(3)完成步驟(2)后，加入3mL終止液(含15％(體積百分比)乙酸和15mMNaOH的水溶液)終止反應(yīng)。(4)完成步驟(3)后，加入500μL的頭孢菌素C溶液(含頭孢菌素C0.8mg、1.0mg、1.2mg、2.0mg、3.0mg、5.0mg、7.0mg或10.0mg)，得到待測(cè)溶液a。(5)完成步驟(3)后，加入500μL的pH8.0、100mMTris-HCl緩沖液，得到待測(cè)溶液b。作為參照組。(6)取步驟(5)得到的待測(cè)溶液a、待測(cè)溶液b、頭孢菌素C溶液和7-氨基頭孢烷酸溶液，分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)。使用配有C18反相柱的高效液相色譜儀進(jìn)行HPLC檢測(cè)。流動(dòng)相由15％(v/v)甲醇(A)、7.5％(v/v)乙腈(B)、1％(v/v)乙酸和76.5％(v/v)的水組成，流速為0.8mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。柱溫箱為30℃。通過(guò)Lineweaver-Burk法將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合為經(jīng)典的米氏方程(Michaelis-Mentenequation)得到酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax/Km。3、純化的對(duì)照蛋白1的催化活性檢測(cè)按照步驟1的方法，將N176M1純酶替換為純化的對(duì)照蛋白1，其它步驟均不變，得到純化的對(duì)照蛋白1的催化活性檢測(cè)結(jié)果。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5(橫坐標(biāo)為保留時(shí)間，縱坐標(biāo)為峰面積，1)為步驟1中加入頭孢菌素C10.0mg的催化活性檢測(cè)結(jié)果，2)為步驟1中參照組的催化活性檢測(cè)結(jié)果)。在該色譜條件下，頭孢菌素C的保留時(shí)間為3.2min，7-氨基頭孢烷酸的保留時(shí)間為2.7min。N176M1純酶對(duì)頭孢菌素C的水解活性(Vmax/Km)為0.228U·mg-1·mM-1(三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值)，比純化的對(duì)照蛋白1對(duì)頭孢菌素C的水解活性提高了60.6％，而空白對(duì)照中僅能通過(guò)水解形成微量的7-氨基頭孢烷酸。N176M1純酶水解后形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量68.67μg/mL，而純化的對(duì)照蛋白1水解后形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量為42.65μg/mL。結(jié)果表明，N176M1純酶可催化頭孢菌素C形成7-氨基頭孢烷酸；與純化的對(duì)照蛋白1相比，N176M1純酶催化頭孢菌素C的活性增強(qiáng)，形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量更高。二、N176M2純酶的催化活性檢測(cè)1、N176M2純酶的催化活性檢測(cè)按照步驟一中1的方法，將反應(yīng)體系1a替換為反應(yīng)體系1A，反應(yīng)體系1b替換為反應(yīng)體系1B，其它步驟均不變，得到N176M2純酶的催化活性檢測(cè)結(jié)果。反應(yīng)體系1A(1mL)：由pH8.0、100mMTris-HCl緩沖液、頭孢菌素C溶液和N176M2純酶組成；反應(yīng)體系1a中，頭孢菌素C的濃度為0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、5.0mg/mL、7.0mg/mL或10.0mg/mL，N176M2純酶的濃度為0.1mg/mL。反應(yīng)體系1B(1mL)：由pH8.0、100mMTris-HCl緩沖液和N176M2純酶組成；反應(yīng)體系1B中，N176M2純酶的濃度為0.1mg/mL。作為參照組。2、空白對(duì)照按照步驟一中2的方法，將反應(yīng)體系2替換為反應(yīng)體系2A，其它步驟均不變，得到空白對(duì)照的催化活性檢測(cè)結(jié)果。反應(yīng)體系2A(1mL)：由pH8.0、100mMTris-HCl緩沖液和N176M2純酶組成；反應(yīng)體系2A中，N176M2純酶的濃度為0.1mg/mL。3、按照步驟1的方法，將N176M2純酶替換為純化的對(duì)照蛋白2，其它步驟均不變，得到純化的對(duì)照蛋白2的催化活性檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該色譜條件下，頭孢菌素C的保留時(shí)間為3.2min，7-氨基頭孢烷酸的保留時(shí)間為2.7min。N176M2純酶對(duì)頭孢菌素C的水解活性(Vmax/Km)為0.363U·mg-1·mM-1(三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值)，比純化的對(duì)照蛋白2對(duì)頭孢菌素C的水解活性提高了59.5％。N176M2純酶水解后形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量85.32μg/mL，而純化的對(duì)照蛋白2水解后形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量為53.66μg/mL。結(jié)果表明，N176M2純酶可催化頭孢菌素C形成7-氨基頭孢烷酸，而空白對(duì)照中僅能通過(guò)水解形成微量的7-氨基頭孢烷酸。與純化的對(duì)照蛋白2相比，N176M2純酶催化頭孢菌素C的活性增強(qiáng)，形成7-氨基頭孢烷酸的產(chǎn)量更高。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3