本發(fā)明公開了一種玻璃酸酶的制備方法，屬于玻璃酸酶制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，是一種能夠降低體內(nèi)透明質(zhì)酸的活性，從而提高組織中液體滲透能力的酶。玻璃酸酶主要存在于哺乳動物睪丸、蛇毒以及其他動物毒液中。玻璃酸酶根據(jù)其種類、分子量大小、最適pH值、降解底物的機(jī)理不同被分離。玻璃酸酶用于腫瘤治療可以降低人膀胱癌的復(fù)發(fā)率；用于心肌梗塞治療可使心肌透明質(zhì)酸含量顯著降低，增加血流量；另外用玻璃酸酶的酶液滴注眼前房可以降低白內(nèi)障病人術(shù)后過高的眼內(nèi)壓。玻璃酸酶不但在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，而且在保健品領(lǐng)域也有卓越的貢獻(xiàn)，人為補(bǔ)充玻璃酸酶可消除皺紋或使局部器官增厚增高，使皮膚保持彈性，從而達(dá)到整容效果。

玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42℃加熱60分鐘活力不損失；100℃加熱5分鐘，活力可保留80%。受熱失活后進(jìn)行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯膠或0.2%明膠保護(hù)。Fe2+、Cu2+對酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等對酶活性沒有明顯影響。高濃度玻璃酸酶對酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化鈉或硫酸魚精蛋白所逆轉(zhuǎn)。

目前傳統(tǒng)的玻璃酸酶生產(chǎn)工藝，采用酸液提取和硫酸銨鹽析的方法制得玻璃酸酶粗品，粗品再經(jīng)過透析、除熱原、凍干工序得到玻璃酸酶精品；該生產(chǎn)工藝普遍采用的提取劑為乙酸或乙酸與鹽酸的混合液，這類提取劑不利于保護(hù)酶的活力，且使得玻璃酸酶提取率較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題：針對目前傳統(tǒng)方法在制備玻璃酸酶的過程中，往往采用酸液提取和硫酸銨鹽析的方法，且加入的提取劑不利于保護(hù)酶的活力，使得玻璃霉菌提取率較低的現(xiàn)狀，提供了一種將注入碳酸氫鈉的豬睪丸蒸煮后絞碎成糜漿，隨后利用蘿卜發(fā)酵酸液浸泡豬睪丸糜漿，使其自然長除霉菌，之后收集長出的霉菌，并用乙醇進(jìn)行提取，最后將提取物進(jìn)行冷凍干燥，從而得到玻璃酸酶的制備方法。該方法操作簡便，原料易得，在制備的過程中避免過多的酸液提取劑，使得制得的玻璃酸酶活力高、純度高且提取率達(dá)到88％以上，在醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

（1）選取3～5個豬睪丸，放入清水中，反復(fù)搓洗，去除表層殘留污物后，剝?nèi)?nèi)外皮層及副睪丸，待處理結(jié)束，用注射器抽取質(zhì)量濃度為60％的碳酸氫鈉溶液，緩慢注入處理后的豬睪丸中，其中每個豬睪丸中注射量為7～9mL，待注射結(jié)束，將注射后的豬睪丸放置在蒸爐中，在85～95℃下蒸煮35～45min，隨后將煮后的豬睪丸取出放于菠蘿篩中，自然冷卻至室溫后，倒入絞碎機(jī)中，絞成糜漿；

（2）稱取500～600g無霉斑、無病蟲害、無腐爛的白蘿卜，用清水洗凈外皮殘留污泥后，用刀將其均勻切成條狀，放入轉(zhuǎn)速為250r/min的離心機(jī)中進(jìn)行甩干操作，直至蘿卜表面無自然滴水，隨后將甩干后的蘿卜條放于發(fā)酵罐中，并向其中加入質(zhì)量濃度為37％氯化鈉溶液，直至完全浸沒蘿卜條為止，之后在80～90℃下密封發(fā)酵8～12天，待發(fā)酵結(jié)束，提升發(fā)酵溫度為85～95℃，再次密封發(fā)酵5～7天，得發(fā)酵混合物，隨后將得到的發(fā)酵混合物放入高速離心機(jī)中，在1200～1300r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理20～25min，去渣留液，得發(fā)酵液；

（3）將上述得到的發(fā)酵液放入容器中，并向其中加入上述步驟（1）制得的豬睪丸糜漿，充分混合均勻，用紗布遮蓋，在溫度為25～32℃，空氣相對濕度為65～68％下自行發(fā)霉，當(dāng)混合物變質(zhì)產(chǎn)生霉菌時，選取濃度為1.5mol/L的亞硫酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值為5.7～6.3，每隔一天對霉菌進(jìn)行1～3次淋洗，直至混合物表層長出一層3～5cm的青褐色菌絲；

（4）用質(zhì)量濃度為75％乙醇溶液沖洗上述長出的青褐色菌絲2～4次，收集沖洗后的混合液，得到菌絲懸浮液，置于微波提取裝置中，在溫度30～40℃，功率為50～60W下進(jìn)行微波提取45～55min，隨后將混合物放入離心機(jī)中，在1000～1200r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理10～15min，取下層沉淀，得菌絲提取物；

（5）將上述得到的菌絲提取物放入真空凍干機(jī)中，抽真空至15～18kPa，同時啟動制冷，在1～2h內(nèi)將真空冷凍干燥機(jī)溫度降至-10～-8℃，保持時間35～45min，隨后在3～5h內(nèi)將菌絲提取物升溫至0～3℃，使得菌絲提取物干燥，即可得到一種玻璃酸酶。

本發(fā)明的原理：本發(fā)明利用將蘿卜切條，加入氯化鈉溶液進(jìn)行發(fā)酵處理，得蘿卜酸液作為提取劑，代替?zhèn)鹘y(tǒng)乙酸或乙酸與鹽酸的混合液，并且在洗凈的豬睪丸中注入碳酸氫鈉溶液，使得酸堿中和，保護(hù)了酶的活力，另外將直接從豬睪丸中提取轉(zhuǎn)變?yōu)閺拿咕刑崛?，更加提高了玻璃酸酶的提取率，使得純度也得到了提高?/p>

本發(fā)明制得的玻璃酸酶顏色為淡黃色；易溶于水，不易溶于丙酮和乙醇；酪氨酸含量為0.03～0.08mg；酸度為6.2；玻璃酸酶效價≥1600單位。

本發(fā)明的應(yīng)用方法是：將本發(fā)明制得的玻璃酸酶放入制囊機(jī)中，制成玻璃酸酶膠囊，其中每個膠囊中含有1～2g玻璃酸酶，食用時，配以250～300mL溫開水送服，每天三餐后食用，每次食用1～3粒，長期食用，可以降低腫瘤治療者膀胱癌的復(fù)發(fā)率，在醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明操作簡便，在制備的過程中避免過多的酸液提取劑，使得玻璃酸酶的活力得到了保護(hù)；

（2）本發(fā)明在制備的過程中無需特殊設(shè)備，生產(chǎn)時間短，且對于環(huán)境無任何危害，最終使得制得的玻璃酸酶性能穩(wěn)定、純度和提取效率均得到了顯著提高。

具體實(shí)施方式

首先選取3～5個豬睪丸，放入清水中，反復(fù)搓洗，去除表層殘留污物后，剝?nèi)?nèi)外皮層及副睪丸，待處理結(jié)束，用注射器抽取質(zhì)量濃度為60％碳酸氫鈉溶液，緩慢注入處理后的豬睪丸中，其中每個豬睪丸中注射量為7～9mL，待注射結(jié)束，將注射后的豬睪丸放置在蒸爐中，在85～95℃下蒸煮35～45min，隨后將煮后的豬睪丸取出放于菠蘿篩中，自然冷卻至室溫后，倒入絞碎機(jī)中，絞成糜漿；然后稱取500～600g無霉斑、無病蟲害、無腐爛的白蘿卜，用清水洗凈外皮殘留污泥后，用刀將其均勻切成條狀，放入轉(zhuǎn)速為250r/min的離心機(jī)中進(jìn)行甩干操作，直至蘿卜表面無自然滴水，隨后將甩干后的蘿卜條放于發(fā)酵罐中，并向其中加入質(zhì)量濃度為37％氯化鈉溶液，直至完全浸沒蘿卜條為止，之后在80～90℃下密封發(fā)酵8～12天，待發(fā)酵結(jié)束，提升發(fā)酵溫度為85～95℃，再次密封發(fā)酵5～7天，得發(fā)酵混合物，隨后將得到的發(fā)酵混合物放入高速離心機(jī)中，在1200～1300r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理20～25min，去渣留液，得發(fā)酵液；接下來將上述得到的發(fā)酵液放入容器中，并向其中加入上述制得的豬睪丸糜漿，充分混合均勻，用紗布遮蓋，在溫度為25～32℃，空氣相對濕度為65～68％下自行發(fā)霉，當(dāng)混合物變質(zhì)產(chǎn)生霉菌時，選取濃度為1.5mol/L的亞硫酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值為5.7～6.3，每隔一天對霉菌進(jìn)行1～3次淋洗，直至混合物表層長出一層3～5cm的青褐色菌絲；之后用質(zhì)量濃度為75％乙醇溶液沖洗上述長出的青褐色菌絲2～4次，收集沖洗后的混合液，得到菌絲懸浮液，置于微波提取裝置中，在溫度30～40℃，功率為50～60W下進(jìn)行微波提取45～55min，隨后將混合物放入離心機(jī)中，在1000～1200r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理10～15min，取下層沉淀，得菌絲提取物；最后將上述得到的菌絲提取物放入真空凍干機(jī)中，抽真空至15～18kPa，同時啟動制冷，在1～2h內(nèi)將真空冷凍干燥機(jī)溫度降至-10～-8℃，保持時間35～45min，隨后在3～5h內(nèi)將菌絲提取物升溫至0～3℃，使得菌絲提取物干燥，即可得到一種玻璃酸酶。

實(shí)例1

首先選取3個豬睪丸，放入清水中，反復(fù)搓洗，去除表層殘留污物后，剝?nèi)?nèi)外皮層及副睪丸，待處理結(jié)束，用注射器抽取質(zhì)量濃度為60％碳酸氫鈉溶液，緩慢注入處理后的豬睪丸中，其中每個豬睪丸中注射量為7mL，待注射結(jié)束，將注射后的豬睪丸放置在蒸爐中，在85℃下蒸煮35min，隨后將煮后的豬睪丸取出放于菠蘿篩中，自然冷卻至室溫后，倒入絞碎機(jī)中，絞成糜漿；然后稱取500g無霉斑、無病蟲害、無腐爛的白蘿卜，用清水洗凈外皮殘留污泥后，用刀將其均勻切成條狀，放入轉(zhuǎn)速為250r/min的離心機(jī)中進(jìn)行甩干操作，直至蘿卜表面無自然滴水，隨后將甩干后的蘿卜條放于發(fā)酵罐中，并向其中加入質(zhì)量濃度為37％氯化鈉溶液，直至完全浸沒蘿卜條為止，之后在80℃下密封發(fā)酵8天，待發(fā)酵結(jié)束，提升發(fā)酵溫度為85℃，再次密封發(fā)酵5天，得發(fā)酵混合物，隨后將得到的發(fā)酵混合物放入高速離心機(jī)中，在1200r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理20min，去渣留液，得發(fā)酵液；接下來將上述得到的發(fā)酵液放入容器中，并向其中加入上述制得的豬睪丸糜漿，充分混合均勻，用紗布遮蓋，在溫度為25℃，空氣相對濕度為65％下自行發(fā)霉，當(dāng)混合物變質(zhì)產(chǎn)生霉菌時，選取濃度為1.5mol/L的亞硫酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值為5.7，每隔一天對霉菌進(jìn)行1次淋洗，直至混合物表層長出一層3cm的青褐色菌絲；之后用質(zhì)量濃度為75％乙醇溶液沖洗上述長出的青褐色菌絲2次，收集沖洗后的混合液，得到菌絲懸浮液，置于微波提取裝置中，在溫度30℃，功率為50W下進(jìn)行微波提取45min，隨后將混合物放入離心機(jī)中，在1000r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理10min，取下層沉淀，得菌絲提取物；最后將上述得到的菌絲提取物放入真空凍干機(jī)中，抽真空至15kPa，同時啟動制冷，在1h內(nèi)將真空冷凍干燥機(jī)溫度降至-10℃，保持時間35min，隨后在3h內(nèi)將菌絲提取物升溫至0℃，使得菌絲提取物干燥，即可得到一種玻璃酸酶。

本實(shí)例操作簡單易行，使用時，將本發(fā)明制得的玻璃酸酶放入制囊機(jī)中，制成玻璃酸酶膠囊，其中每個膠囊中含有1g玻璃酸酶，食用時，配以250mL溫開水送服，每天三餐后食用，每次食用1粒，長期食用，可以降低腫瘤治療者膀胱癌的復(fù)發(fā)率，在醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

實(shí)例2

首先選取4個豬睪丸，放入清水中，反復(fù)搓洗，去除表層殘留污物后，剝?nèi)?nèi)外皮層及副睪丸，待處理結(jié)束，用注射器抽取質(zhì)量濃度為60％碳酸氫鈉溶液，緩慢注入處理后的豬睪丸中，其中每個豬睪丸中注射量為8mL，待注射結(jié)束，將注射后的豬睪丸放置在蒸爐中，在90℃下蒸煮40min，隨后將煮后的豬睪丸取出放于菠蘿篩中，自然冷卻至室溫后，倒入絞碎機(jī)中，絞成糜漿；然后稱取550g無霉斑、無病蟲害、無腐爛的白蘿卜，用清水洗凈外皮殘留污泥后，用刀將其均勻切成條狀，放入轉(zhuǎn)速為250r/min的離心機(jī)中進(jìn)行甩干操作，直至蘿卜表面無自然滴水，隨后將甩干后的蘿卜條放于發(fā)酵罐中，并向其中加入質(zhì)量濃度為37％氯化鈉溶液，直至完全浸沒蘿卜條為止，之后在85℃下密封發(fā)酵10天，待發(fā)酵結(jié)束，提升發(fā)酵溫度為90℃，再次密封發(fā)酵6天，得發(fā)酵混合物，隨后將得到的發(fā)酵混合物放入高速離心機(jī)中，在1250r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理23min，去渣留液，得發(fā)酵液；接下來將上述得到的發(fā)酵液放入容器中，并向其中加入上述制得的豬睪丸糜漿，充分混合均勻，用紗布遮蓋，在溫度為30℃，空氣相對濕度為67％下自行發(fā)霉，當(dāng)混合物變質(zhì)產(chǎn)生霉菌時，選取濃度為1.5mol/L的亞硫酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值為6.1，每隔一天對霉菌進(jìn)行2次淋洗，直至混合物表層長出一層4cm的青褐色菌絲；之后用質(zhì)量濃度為75％乙醇溶液沖洗上述長出的青褐色菌絲3次，收集沖洗后的混合液，得到菌絲懸浮液，置于微波提取裝置中，在溫度35℃，功率為55W下進(jìn)行微波提取50min，隨后將混合物放入離心機(jī)中，在1100r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理13min，取下層沉淀，得菌絲提取物；最后將上述得到的菌絲提取物放入真空凍干機(jī)中，抽真空至17kPa，同時啟動制冷，在1.5h內(nèi)將真空冷凍干燥機(jī)溫度降至-9℃，保持時間40min，隨后在4h內(nèi)將菌絲提取物升溫至2℃，使得菌絲提取物干燥，即可得到一種玻璃酸酶。

本實(shí)例操作簡單易行，使用時，將本發(fā)明制得的玻璃酸酶放入制囊機(jī)中，制成玻璃酸酶膠囊，其中每個膠囊中含有1.5g玻璃酸酶，食用時，配以280mL溫開水送服，每天三餐后食用，每次食用2粒，長期食用，可以降低腫瘤治療者膀胱癌的復(fù)發(fā)率，在醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

實(shí)例3

首先選取5個豬睪丸，放入清水中，反復(fù)搓洗，去除表層殘留污物后，剝?nèi)?nèi)外皮層及副睪丸，待處理結(jié)束，用注射器抽取質(zhì)量濃度為60％碳酸氫鈉溶液，緩慢注入處理后的豬睪丸中，其中每個豬睪丸中注射量為9mL，待注射結(jié)束，將注射后的豬睪丸放置在蒸爐中，在95℃下蒸煮45min，隨后將煮后的豬睪丸取出放于菠蘿篩中，自然冷卻至室溫后，倒入絞碎機(jī)中，絞成糜漿；然后稱取600g無霉斑、無病蟲害、無腐爛的白蘿卜，用清水洗凈外皮殘留污泥后，用刀將其均勻切成條狀，放入轉(zhuǎn)速為250r/min的離心機(jī)中進(jìn)行甩干操作，直至蘿卜表面無自然滴水，隨后將甩干后的蘿卜條放于發(fā)酵罐中，并向其中加入質(zhì)量濃度為37％氯化鈉溶液，直至完全浸沒蘿卜條為止，之后在90℃下密封發(fā)酵12天，待發(fā)酵結(jié)束，提升發(fā)酵溫度為95℃，再次密封發(fā)酵7天，得發(fā)酵混合物，隨后將得到的發(fā)酵混合物放入高速離心機(jī)中，在1300r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理25min，去渣留液，得發(fā)酵液；接下來將上述得到的發(fā)酵液放入容器中，并向其中加入上述制得的豬睪丸糜漿，充分混合均勻，用紗布遮蓋，在溫度為32℃，空氣相對濕度為68％下自行發(fā)霉，當(dāng)混合物變質(zhì)產(chǎn)生霉菌時，選取濃度為1.5mol/L的亞硫酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值為6.3，每隔一天對霉菌進(jìn)行3次淋洗，直至混合物表層長出一層5cm的青褐色菌絲；之后用質(zhì)量濃度為75％乙醇溶液沖洗上述長出的青褐色菌絲4次，收集沖洗后的混合液，得到菌絲懸浮液，置于微波提取裝置中，在溫度40℃，功率為60W下進(jìn)行微波提取55min，隨后將混合物放入離心機(jī)中，在1200r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理15min，取下層沉淀，得菌絲提取物；最后將上述得到的菌絲提取物放入真空凍干機(jī)中，抽真空至18kPa，同時啟動制冷，在2h內(nèi)將真空冷凍干燥機(jī)溫度降至-8℃，保持時間45min，隨后在5h內(nèi)將菌絲提取物升溫至3℃，使得菌絲提取物干燥，即可得到一種玻璃酸酶。

本實(shí)例操作簡單易行，使用時，將本發(fā)明制得的玻璃酸酶放入制囊機(jī)中，制成玻璃酸酶膠囊，其中每個膠囊中含有2g玻璃酸酶，食用時，配以300mL溫開水送服，每天三餐后食用，每次食用3粒，長期食用，可以降低腫瘤治療者膀胱癌的復(fù)發(fā)率，在醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。