本發(fā)明涉及一種磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因、載體、工程菌，及其在制備抗雞球蟲的藥物中的應用。(二)
背景技術：
：磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)的種類很多，在細菌、原生動物、酵母、霉菌、植物、昆蟲和哺乳動物中均存在。在各個領域均有應用：醫(yī)藥領域，主要作為疫苗用于預防各種病原菌的感染；食品領域，多用于面包烘培、奶制品加工、保健食品等；工業(yè)領域，主要用于油脂精煉、磷脂改性、動物飼料添加劑等。雞球蟲病發(fā)病率高(50～70％)，致死率高(50～80％)，嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)，每年因球蟲病造成的損失高達數(shù)十億美元。現(xiàn)有雞球蟲病防治，主要依靠化學藥物，但存在耐藥性、藥物殘留等不足，若采用接種疫苗方式進行防治，又存在風險較大、且研發(fā)困難的不足，而采用抗生素或中草藥，也存在耐藥性的問題，且效果一般。因此，亟需尋找一種新的抗球蟲藥物替代化學藥物來有效控制雞球蟲病。細菌PI-PLC可裂解細胞膜表面糖基錨定蛋白，從而影響細胞膜表面上糖蛋白及碳水化合物的釋放，而球蟲等大多數(shù)致病性寄生蟲細胞膜表面抗原都是通過糖基錨定在細胞上的，PI-PLC能切斷錨定蛋白中肌醇磷脂與細胞膜的連接，使寄生蟲喪失入侵宿主細胞和在宿主細胞內增殖的能力，因此PI-PLC顯示出顯著的抗球蟲感染特性。PI-PLC的抗球蟲機理為新型抗球蟲藥的開發(fā)提供了理論基礎。PI-PLC降低了球蟲因耐藥性加劇而爆發(fā)的風險，避免養(yǎng)殖業(yè)因球蟲病復發(fā)而造成的重大損失。PI-PLC廣泛分布于動植物以及微生物的體內，本身就參與機體細胞的代謝和信息交流，不存在產生耐藥性及藥物殘留等問題。具有安全、無毒害作用。通過微生物異源表達，可以大量生產PI-PLC，降低抗球蟲藥的使用成本。(三)技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種可通過微生物異源表達的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因、載體、工程菌，及其在制備抗雞球蟲的藥物中的應用。本發(fā)明采用的技術方案是：磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因，其序列如SEQIDNo.1所示。該序列為從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到的一段蠟狀芽胞桿菌PI-PLC基因(Genbank:M30809.1)，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，在保證氨基酸序列不變的前提下，優(yōu)化設計并合成的PI-PLC目的基因，易于在大腸桿菌中穩(wěn)定表達、且表達量較高。SEQIDNo.1序列如下：5’-ATGTCTAACAAAAAACTTATCCTGAAATTATTTATCTGCTCCACAATCTTTATTACATTTGTCTTTGCTCTGCATGACAAACGGGTGGTTGCAGCGTCAAGCGTGAACGAACTGGAAAATTGGAGCAAATGGATGCAACCGATTCCTGATTCAATCCCGCTTGCGCGTATTAGCATCCCTGGCACGCATGACTCTGGAACATTTAAATTGCAAAACCCGATCAAACAGGTTTGGGGCATGACACAAGAATACGATTTTCGTTATCAGATGGACCATGGTGCTCGGATTTTTGATATCAGAGGCCGCTTAACGGATGACAATACAATCGTTTTGCATCATGGACCGTTGTACTTGTACGTGACGTTGCATGAATTTATCAACGAAGCGAAACAGTTTTTGAAAGATAACCCTTCAGAAACAATCATCATGAGCTTGAAAAAAGAATACGAAGATATGAAAGGCGCTGAAGACTCTTTTTCTTCCACGTTTGAGAAAAAATACTTTGTCGATCCTATCTTTCTGAAAACAGAAGGAAACATCAAACTTGGAGACGCCAGAGGTAAAATTGTACTGCTTAAACGCTATTCTGGTTCCAACGAACCGGGCGGATACAACAACTTTTACTGGCCTGATAACGAAACGTTTACAACGACAGTGAATCAAAACGCAAATGTTACAGTGCAGGATAAATACAAAGTCTCCTACGACGAAAAAGTAAAAAGCATCAAAGATACGATGGACGAAACAATGAATAACTCTGAAGATCTGAACCATCTTTACATCAACTTTACGTCACTTTCAAGCGGTGGCACAGCTTGGAATTCTCCGTATTACTATGCCTCCTACATCAACCCTGAAATCGCAAACTACATCAAACAGAAAAATCCGGCACGCGTCGGATGGGTAATCCAGGATTATATTAATGAAAAATGGAGCCCGTTACTGTATCAAGAAGTCATCAGAGCAAATAAATCCTTAATCAAAGAATAA-3’。本發(fā)明還涉及含有所述磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因的重組載體。本發(fā)明還涉及利用所述重組載體轉化得到的重組基因工程菌。本發(fā)明還涉及所述磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因在制備抗雞球蟲的藥物中的應用。具體的，所述的應用為：構建含有所述磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因的重組載體，將所述重組載體轉化至大腸桿菌中，獲得重組基因工程菌進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C的上清液。通過對重組大腸桿菌搖瓶條件下培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化，以4％的轉接量，37℃，200r/min條件下，培養(yǎng)重組大腸桿菌OD600＝0.4時，添加誘導物IPTG，工作濃度為1mM，進行誘導表達，于37℃，200r/min繼續(xù)培養(yǎng)6h后，測得培養(yǎng)基破碎上清液中PI-PLC的濃度可達到10mg/L以上。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明優(yōu)化設計并合成PI-PLC目的基因，成功實現(xiàn)了PI-PLC基因在大腸桿菌中的異源高表達，且重組蛋白顯示磷脂酶活性較高，表達的PI-PLC用于抗雞球蟲動物實驗，抗球蟲效果良好。(四)附圖說明圖1為目的基因擴增結果；M：DNAMaker；1：PCR擴增產物1；2：PCR擴增產物2；圖2為質粒pET28a(+)結構圖譜；圖3為重組質粒pET28a(+)-PIPLC的構建過程；圖4為重組大腸桿菌中的單菌落；圖5為重組大腸桿菌的菌落PCR結果圖；圖6為重組蛋白SDS-PAGE電泳鑒定結果；M：標準蛋白Maker；1：pET28a(+)/BL21對照菌破碎上清；2：誘導后的pET28a(+)-PIPLC/BL21破碎上清；圖7為PI-PLC酶活性驗證結果(PI顯色平板)；1：重組菌pET28a(+)-PIPLC/BL21破碎上清；2：重組菌pET28a(+)/BL21破碎上清(CK)；圖8為酶聯(lián)反應分析測定酶含量結果圖；圖9為不同實驗組小雞體重變化比較；圖10為每克糞便蟲球蟲數(shù)(22天OPG計數(shù))比較；圖11為不同實驗組抗球蟲指數(shù)ACI對比。(五)具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：實施例1：1、目的基因的優(yōu)化與合成從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到的一段蠟狀芽胞桿菌PI-PLC基因(Genbank:M30809.1)，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，在保證氨基酸序列不變的前提下，優(yōu)化設計并合成的PI-PLC目的基因(SEQIDNo.1)，由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。2、目的基因片段的獲得與鑒定具體步驟：根據(jù)合成的已知序列，進行引物設計。正向引物P1：5’-CCCGGTCTCCCATGGGCTCTAACAAAAAACTTATCCTGAAA-3’，反向引物P2：5’-CCCGGTCTCGAATTCTTATTCTTTGATTAAGGATT-3’，下劃線代表含有BsaI酶切位點。以合成基因PI-PLC為模板，以p1/p2為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為：模板1μL，上下游引物各1μL，2×superHIFI-MIXⅡ25μL，滅菌的雙蒸水20μL。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，32個循環(huán)后72℃延伸10min。PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。經過內切酶BsaI酶切后產生NcoI酶切位點和EcoRI酶切位點的粘性末端，對PCR產物進行回收，獲得目的基因。目的基因擴增結果參見圖1，質粒pET28a(+)結構圖譜參見圖2。3、重組質粒pET28a(+)-PIPLC的構建具體步驟：經PCR回收含有目的基因用BsaI酶切，與EcoRI和NcoII酶切的pET28a進行連接轉化到克隆宿主菌，隨后再選PIPLC引物進行擴增，挑出陽性克隆進行測序，正確的重組質粒命名為pET28a(+)-PIPLC，將獲得的重組大腸桿菌命名為Trans1-T1-PIPLC/Trans1-T1，并進行甘油管保藏。重組質粒pET28a(+)-PIPLC的構建過程參見圖3。4、重組質粒pET28a(+)-PIPLC在大腸桿菌中的克隆具體步驟：提取正確的重組質粒pET28a(+)-PIPLC，通過化學普轉的方法轉到表達宿主菌BL21(DE3)，挑取轉化子用P1、P2引物進行菌落PCR，挑取擴增出目的大小片段的轉化子接種于LB(含有卡那霉素50μg/mL)液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜。將獲得的重組菌命名為pET28a-PIPLC/BL21(DE3)，并將其進行甘油管保藏。重組大腸桿菌中的單菌落圖參見圖4，重組大腸桿菌的菌落PCR結果圖參見圖5。5、SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白具體步驟：挑取陽性重組菌pET28a-PIPLC/BL21(DE3)單菌落接種于5mlLB(含有卡那霉素1μg/mL)液體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)20h后，按1:50的比例進行擴大培養(yǎng)至OD值＝0.3-0.6加入終濃度0.75mM的誘導劑IPTG進行4個小時誘導。收集菌體，加入1/20體積的細胞緩沖液NTA-0Buffer(20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl，10％Glycerol)取50ul的菌液加入加樣緩沖液混合后煮沸10min，冷卻后，取20μL進行SDS-PAGE(12％分離膠，5％濃縮膠)電泳分析，以蛋白質標準分子量為參考，并以同樣方法處理不加誘導物的pET28a-PIPLC/BL21(DE3)菌作為對照。電泳結果參見圖6，由圖可見，在誘導后的重組菌pET28a(+)-PIPLC/BL21破碎上清中出現(xiàn)了大小約為35kDa的片段，與PI-PLC大小一致。6、PI-PLC酶活性驗證具體步驟：取10μL培養(yǎng)12小時的重組菌pET28a-PIPLC/BL21(DE3)的菌液于PI-李斯特氏菌顯色平板，并以同樣方法處理pET28a/BL21(DE3)空白菌作為對照，37℃溫育12h。結果：重組菌pET28a-PIPLC/BL21(DE3)點板處出現(xiàn)透明圈，而對照沒有透明圈。結果如圖參見圖7，顯示重組菌pET28a(+)-PIPLC/BL21具有磷脂酶活性。7、酶聯(lián)反應定量測定菌液中PI-PLC的含量具體步驟：①待測樣品的處理：將誘導表達后的重組大腸桿菌菌液，置于冰上超聲波破碎至澄清8000r/min離心10min，收集上清；②標準品的稀釋：試劑盒提供原倍PI-PLC標準品一支，按照下列圖表在1.5mL離心管中進行稀釋。③加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。④溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。⑤配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。⑥洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復5次，拍干。⑦加酶：每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外。⑧溫育：操作同3。⑨洗滌：操作同5。⑩顯色：每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。終止：每孔加終止液50μL，終止反應(此時藍色立轉黃色)。測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15min以內進行。計算以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。結果參見圖8，顯示按上述方法誘導大腸桿菌表達PI-PLC，最終測得誘導后培養(yǎng)液(上清液)中PI-PLC的濃度為10mg/L。實施例2：為了研究細菌PI-PLC對雛雞抗球蟲及促進增重效果的影響，選擇致病性最強的柔嫩艾美耳球蟲對正常雛雞進行感染，并對分組雛雞進行不同的給藥處理，通過觀察記錄雛雞臨床病理學變化、存活率，體重變化、盲腸病變情況、卵囊值，從而計算出PI-PLC的抗球蟲指數(shù)。一、實驗分組檢測指標：(1)小雞體重(2)盲腸病變計分(3)卵囊值(4)抗球蟲指數(shù)(ACI)二、實驗結果1、病理學觀察正常小雞感染球蟲4天后，精神萎靡、食欲下降、羽毛蓬松，部分小雞離群呆立或臥伏不動，出現(xiàn)血便(參見圖9)；正常小雞感染球蟲第5天，嚴重者死亡，解剖，盲腸充血腫大，屬典型球蟲致死。2、體重變化各實驗組體重變化數(shù)據(jù)參見圖9。由圖可見：陰性對照組生長最慢，且有一只雛雞死亡，說明球蟲病嚴重影響雞的正常生長發(fā)育，嚴重者可導致死亡；地克珠利組體重最高，22日平均體重比不攻擊球蟲的空白對照組還高，相對增重率達到102.32％，這也很好的解釋了目前地克珠利作為抗球蟲藥被廣泛的用在養(yǎng)殖業(yè)中的原因；PI-PLC實驗組對小雞的相對增重率高于陰性對照組和PI-PLC對照組，說明PI-PLC對感染了球蟲的雛雞的增重有一定的效果。3、盲腸病變計分各實驗組盲腸病變計分數(shù)據(jù)見下表：分組盲腸病變計分病變值空白對照組0.00陰性對照組3.2532.5地克珠利組1.515PI-PLC實驗組1.7517.5PI-PLC對照組2.8528.5注：盲腸病變計分分0,1,2,3,4五個等級，分數(shù)越高，盲腸病變越嚴重。由表可知：地克珠利組和PI-PLC實驗組雛雞的盲腸病變計分明顯低于陰性對照組和PI-PLC對照組，說明這兩組對抗球蟲有顯著效果。4、每克糞便蟲球蟲數(shù)(OPG計數(shù))各實驗組每克糞便蟲球蟲數(shù)結果參見圖10，由圖可知：PI-PLC組卵囊比數(shù)雖然比地克珠利組高出很多，但是依然明顯的低于兩個對照組，說明PI-PLC和地克珠利一樣對球蟲生長繁殖有明顯的抑制作用。5、抗球蟲(ACI)指數(shù)各實驗組抗球蟲(ACI)指數(shù)數(shù)據(jù)結果參見圖11。抗球蟲指數(shù)ACI＝(小雞成活率+相對增重率)×100－(卵囊值+病變值)。ACI指數(shù)顯示：地克珠利組的抗球蟲指數(shù)最高，達到180以上，可以有效的促進雛雞增重，且抑制雛雞盲腸中球蟲的生長，抗球蟲效果屬于優(yōu)秀水平；PI-PLC組ACI指數(shù)雖低于地克珠利組，但是明顯高于陰性對照組和PI-PLC對照組，ACI指數(shù)接近160，說明PI-PLC有抗球蟲效果，且抗球蟲效果接近良好。三、結論實驗結果表明，細菌PI-PLC抗球蟲指數(shù)ACI接近160，說明PI-PLC有抗球蟲效果，且抗球蟲效果接近良好。當前第1頁1 2 3