一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，采用酸液提取和低溫乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品，與傳統(tǒng)方法通過酸液提取和硫酸銨鹽析制取玻璃酸酶粗品相比，具有更高的收率。
【專利說明】一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及從新鮮動物睪丸中提取玻璃酸酶粗品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，在哺乳動物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時精子進入卵子。也存在于精子、頜下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細胞的溶酶體中。
[0003]玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42°C加熱60分鐘活力不損失；100°C加熱5分鐘，活力可保留80%。受熱失活后進行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯膠或0.2%明膠保護。Fe2+、Cu2+對酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等對酶活性沒有明顯影響。硫酸軟骨素B (皮膚素)、硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)素、肝素及高濃度玻璃酸酶對酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化鈉或硫酸魚精蛋白所逆轉(zhuǎn)。
[0004]藥用玻璃酸酶為白色或微黃色粉末，無氣味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有機溶劑。生化制藥主要用牛、羊睪丸為原料進行提取制備。
[0005]低溫乙醇法是1940年由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Edwin J.Cohn教授發(fā)明的，因此又稱為“孔氏法”?？资戏ㄗ畛跤脕矸蛛x牛血清白蛋白，隨后應(yīng)用于人血漿分離。1944年，白蛋白制品首次進行臨床 輸注，用于搶救7名在日軍偷襲珍珠港中嚴重?zé)齻拿绹?，并由此開始了血漿蛋白制品的工業(yè)化生產(chǎn)。乙醇作為一種蛋白沉淀劑，具有許多優(yōu)點:介電常數(shù)低、與水易混溶、在正常環(huán)境和工作條件下無易爆性、低分子量、化學(xué)上的相對惰性、低毒、價廉、易得和抑菌作用。至今，大規(guī)模血漿蛋白分離仍基本采用低溫乙醇分離法。
[0006]王彥，周淑敏等曾在2002年15卷(I)期的《黑龍江醫(yī)藥》上發(fā)表了一篇名為《透明質(zhì)酸酶提取工藝的研究》的論文，較詳細的介紹了工業(yè)生產(chǎn)中從羊睪丸中提取玻璃酸酶的傳統(tǒng)工藝以及在此基礎(chǔ)上由他們改良的新工藝；李丹，郭育濤等曾在2011年8月第40卷第8期的《應(yīng)用化工》上發(fā)表了一篇名為《牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研究》的論文，介紹了用鹽酸和乙酸的混合液溶解、硫酸銨鹽析方法，從牛睪丸中提取玻璃酸酶的實驗研究。國內(nèi)傳統(tǒng)工藝都是用酸液溶解和硫酸銨鹽析來提取玻璃酸酶粗品的，本專利采用酸液提取和低溫乙醇沉淀來提取玻璃酸酶粗品，在國內(nèi)尚屬首創(chuàng)，國內(nèi)相關(guān)論文、專利等文獻資料沒有低溫乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品的相關(guān)介紹。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，采用酸液提取和低溫乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品。具體步驟如下:
[0008]I 提取:
[0009]將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞成糜漿。稱取糜漿，按每Ikg糜漿加酸液1.0-l.5L的比例，加酸液攪拌，浸出4小時后，將浸出液過濾，濾液調(diào)PH3.2~4.0。
[0010]取濾渣，按每Ikg開始加入的糜漿加酸液0.2-0.3L的比例，加酸液攪拌I小時后，再次過濾，濾液調(diào)PH3.2~4.0。
[0011]所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液。
[0012]2 粗制:
[0013]合并兩次過濾液，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無水乙醇，靜置2小時使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于0.15mol/L的氯化鈉溶液中，調(diào)pH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)PH3.2-4.0，加入預(yù)冷的無水乙醇，靜置2小時，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品。
[0014]粗制工序需在2_6°C冷庫中進行，兩次無水乙醇的添加量均為開始時合并的過濾液的50%。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
[0016]國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)是用酸液溶解、硫酸銨鹽析的方法來制取玻璃酸酶粗品，而本發(fā)明技術(shù)是采用酸液提取和低溫乙醇沉淀來制取玻璃酸酶粗品，國內(nèi)相關(guān)論文、專利等文獻資料沒有低溫乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品的相關(guān)介紹，本發(fā)明首次采用低溫乙醇沉淀來提取玻璃酸酶粗品，在國內(nèi)尚屬首創(chuàng)。生產(chǎn)工藝簡易、收率高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。該項成果有良好的經(jīng)濟效益和社會效益，它不但解決國內(nèi)外醫(yī)療用藥的需求，還為養(yǎng)殖產(chǎn)品的綜合利用開拓了新路，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展有積極意義。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0018]實施例1
[0019]I 提取:
[0020]稱取糜漿5kg加酸液6.3L，攪拌浸出4小時后，將浸出液過濾，濾液調(diào)pH3.49。
[0021]取濾渣加酸液1.1L，攪拌I小時后，再次過濾，濾液調(diào)pH3.57。
[0022]2 粗制:
[0023]在2-6 °C冷庫中合并兩次過濾液7.5L，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無水乙醇
3.75L，靜置2小時使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于0.15mol/L的氯化鈉溶液中，調(diào)pH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)PH3.76，加入預(yù)冷的無水乙醇3.75L，靜置2小時，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品651.42g。
[0024]實施例2
[0025]I 提取:
[0026]稱取糜漿400g加酸液0.5L，攪拌浸出4小時后，將浸出液過濾，濾液調(diào)pH3.83。
[0027]取濾渣加酸液0.1L，攪拌I小時后，再次過濾，濾液調(diào)pH3.75。
[0028]2 粗制:
[0029]在2-6 °C冷庫中合并兩次過濾液600mL，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無水乙醇300mL，靜置2小時使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于0.15mol/L的氯化鈉溶液中，調(diào)pH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)PH3.67，加入預(yù)冷的無水乙醇300mL，靜置2小時，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品52.14g?！?br> [0030]經(jīng)測算，實施例1中玻璃酸酶粗品收率13.03% ;實施例2中玻璃酸酶粗品收率13.04%。與傳統(tǒng)方法制得的玻璃酸酶粗品收率10%左右相比，新方法的收率更高。
[0031]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等 同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，其特征在于，采用酸液提取和低溫乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品，與傳統(tǒng)方法通過酸液提取和硫酸銨鹽析制取玻璃酸酶粗品相比，具有更高的收率。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: (一)提取: 將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞成糜漿，稱取糜漿加酸液，攪拌、浸潰，過濾，濾液調(diào)PH ;取濾渣再加酸液，攪拌、過濾，濾液調(diào)pH ;所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液； (二)粗制: 合并兩次過濾液，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無水乙醇，靜置2小時使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于氯化鈉溶液中，調(diào)PH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)pH3.2-4.0，加入預(yù)冷的無水乙醇，靜置2小時，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品。
3.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，步驟(二)需在2-6°C冷庫中進行。
4.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，步驟(二)中兩次無水乙醇的添加量均為開始時合并的過濾液的50%。
5.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，步驟(二)中氯化鈉溶液的濃度為0.15mol/L0
【文檔編號】C12N9/26GK103667210SQ201310647955
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】劉乃山, 宋超龍, 劉振海, 劉翠珍 申請人:青島康原藥業(yè)有限公司