一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，采用酸液提取和低溫乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品，與傳統(tǒng)方法通過(guò)酸液提取和硫酸銨鹽析制取玻璃酸酶粗品相比，具有更高的收率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)涉及從新鮮動(dòng)物睪丸中提取玻璃酸酶粗品的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，在哺乳動(dòng)物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時(shí)精子進(jìn)入卵子。也存在于精子、頒下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細(xì)胞的溶酶體中。
[0003]玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42°C加熱60分鐘活力不損失；100°C加熱5分鐘，活力可保留80%。受熱失活后進(jìn)行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯膠或0.2%明膠保護(hù)。Fe2+、Cu2+對(duì)酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等對(duì)酶活性沒(méi)有明顯影響。硫酸軟骨素B (皮膚素)、硫酸類(lèi)肝素、硫酸角質(zhì)素、肝素及高濃度玻璃酸酶對(duì)酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化鈉或硫酸魚(yú)精蛋白所逆轉(zhuǎn)。
[0004]藥用玻璃酸酶為白色或微黃色粉末，無(wú)氣味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有機(jī)溶劑。生化制藥主要用牛、羊睪丸為原料進(jìn)行提取制備。
[0005]低溫乙醇法是1940年由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Edwin J.Cohn教授發(fā)明的，因此又稱(chēng)為“孔氏法”。孔氏法最初用來(lái)分離牛血清白蛋白，隨后應(yīng)用于人血漿分離。1944年，白蛋白制品首次進(jìn)行臨床輸注，用于搶救7名在日軍偷襲珍珠港中嚴(yán)重?zé)齻拿绹?guó)水兵，并由此開(kāi)始了血漿蛋白制品的工業(yè)化生產(chǎn)。乙醇作為一種蛋白沉淀劑，具有許多優(yōu)點(diǎn):介電常數(shù)低、與水易混溶、在正常環(huán)境和工作條件下無(wú)易爆性、低分子量、化學(xué)上的相對(duì)惰性、低毒、價(jià)廉、易得和抑菌作用。至今，大規(guī)模血漿蛋白分離仍基本采用低溫乙醇分離法。
[0006]王彥，周淑敏等曾在2002年15卷(I)期的《黑龍江醫(yī)藥》上發(fā)表了一篇名為《透明質(zhì)酸酶提取工藝的研宄》的論文，較詳細(xì)的介紹了工業(yè)生產(chǎn)中從羊睪丸中提取玻璃酸酶的傳統(tǒng)工藝以及在此基礎(chǔ)上由他們改良的新工藝；李丹，郭育濤等曾在2011年8月第40卷第8期的《應(yīng)用化工》上發(fā)表了一篇名為《牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研宄》的論文，介紹了用鹽酸和乙酸的混合液溶解、硫酸銨鹽析方法，從牛睪丸中提取玻璃酸酶的實(shí)驗(yàn)研宄。國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)工藝都是用酸液溶解和硫酸銨鹽析來(lái)提取玻璃酸酶粗品的，本專(zhuān)利采用酸液提取和低溫乙醇沉淀來(lái)提取玻璃酸酶粗品，在國(guó)內(nèi)尚屬首創(chuàng)，國(guó)內(nèi)相關(guān)論文、專(zhuān)利等文獻(xiàn)資料沒(méi)有低溫乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品的相關(guān)介紹。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，采用酸液提取和低溫乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品。具體步驟如下:
I提取:
將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞成糜漿。稱(chēng)取糜漿，按每Ikg糜漿加酸液1.0-1.5L的比例，加酸液攪拌，浸出4小時(shí)后，將浸出液過(guò)濾，濾液調(diào)pH3.2?4.0。
[0008]取濾渣，按每Ikg開(kāi)始加入的糜漿加酸液0.2-0.3L的比例，加酸液攪拌I小時(shí)后，再次過(guò)濾，濾液調(diào)PH3.2?4.0。
[0009]所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液。
[0010]2 粗制:
合并兩次過(guò)濾液，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇，靜置2小時(shí)使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于0.15mol/L的氯化鈉溶液中，調(diào)pH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)pH3.2-4.0，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇，靜置2小時(shí)，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品。
[0011]粗制工序需在2-6°C冷庫(kù)中進(jìn)行，兩次無(wú)水乙醇的添加量均為開(kāi)始時(shí)合并的過(guò)濾液的50%。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
國(guó)內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)是用酸液溶解、硫酸銨鹽析的方法來(lái)制取玻璃酸酶粗品，而本發(fā)明技術(shù)是采用酸液提取和低溫乙醇沉淀來(lái)制取玻璃酸酶粗品，國(guó)內(nèi)相關(guān)論文、專(zhuān)利等文獻(xiàn)資料沒(méi)有低溫乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品的相關(guān)介紹，本發(fā)明首次采用低溫乙醇沉淀來(lái)提取玻璃酸酶粗品，在國(guó)內(nèi)尚屬首創(chuàng)。生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)易、收率高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。該項(xiàng)成果有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，它不但解決國(guó)內(nèi)外醫(yī)療用藥的需求，還為養(yǎng)殖產(chǎn)品的綜合利用開(kāi)拓了新路，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展有積極意義。

【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014]實(shí)施例1 I提取:
稱(chēng)取糜漿5kg加酸液6.3L，攪拌浸出4小時(shí)后，將浸出液過(guò)濾，濾液調(diào)PH3.49。
[0015]取濾渣加酸液1.1L，攪拌I小時(shí)后，再次過(guò)濾，濾液調(diào)pH3.57。
[0016]2 粗制:
在2-6°C冷庫(kù)中合并兩次過(guò)濾液7.5L，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇3.75L，靜置2小時(shí)使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于0.15mol/L的氯化鈉溶液中，調(diào)pH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)PH3.76，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇3.75L，靜置2小時(shí)，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品 651.42go
[0017]實(shí)施例2 I提取:
稱(chēng)取糜漿400g加酸液0.5L，攪拌浸出4小時(shí)后，將浸出液過(guò)濾，濾液調(diào)pH3.83。
[0018]取濾渣加酸液0.1L，攪拌I小時(shí)后，再次過(guò)濾，濾液調(diào)pH3.75。
[0019]2 粗制:
在2-6°C冷庫(kù)中合并兩次過(guò)濾液600mL，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇300mL，靜置2小時(shí)使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于0.15mol/L的氯化鈉溶液中，調(diào)pH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)PH3.67，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇300mL，靜置2小時(shí)，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品 52.14go
[0020]經(jīng)測(cè)算，實(shí)施例1中玻璃酸酶粗品收率13.03% ;實(shí)施例2中玻璃酸酶粗品收率13.04%ο與傳統(tǒng)方法制得的玻璃酸酶粗品收率10%左右相比，新方法的收率更高。
[0021]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，其特征在于，采用酸液提取和低溫乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品，與傳統(tǒng)方法通過(guò)酸液提取和硫酸銨鹽析制取玻璃酸酶粗品相比，具有更高的收率。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: (一)提取: 將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞成糜漿，稱(chēng)取糜漿加酸液，攪拌、浸漬，過(guò)濾，濾液調(diào)PH ;取濾渣再加酸液，攪拌、過(guò)濾，濾液調(diào)pH ;所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液； (二)粗制: 合并兩次過(guò)濾液，在不斷攪拌下，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇，靜置2小時(shí)使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于氯化鈉溶液中，調(diào)PH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)pH3.2-4.0，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇，靜置2小時(shí)，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品。
3.權(quán)利要求書(shū)2所述的方法，其特征在于，在步驟(一)中，第一次每Ikg糜漿加酸液1.0-1.5L，第二次酸液仍根據(jù)開(kāi)始糜漿量加入，每Ikg糜漿加酸液0.2-0.3L。
4.權(quán)利要求書(shū)2所述的方法，其特征在于，在步驟(一)中，酸液提取后調(diào)節(jié)濾液的pH值均為3.2?4.0。
5.權(quán)利要求書(shū)2所述的方法，其特征在于，步驟(二)需在2-6°C冷庫(kù)中進(jìn)行。
6.權(quán)利要求書(shū)2所述的方法，其特征在于，步驟(二)中兩次無(wú)水乙醇的添加量均為開(kāi)始時(shí)合并的過(guò)濾液的50%。
7.權(quán)利要求書(shū)2所述的方法，其特征在于，步驟(二)中氯化鈉溶液的濃度為0.15mol/L0
【文檔編號(hào)】C12N9/26GK104498452SQ201410807799
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】劉乃山, 宋超龍, 劉翠珍 申請(qǐng)人:青島康原藥業(yè)有限公司