玻璃酸酶的仿生親和純化方法
玻璃酸酶的仿生親和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種玻璃酸酶仿生親和純化方法，包括下列步驟：(1)基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪反應(yīng)活化后，分別與2-氨基對(duì)苯二甲酸以及二鹽酸組胺反應(yīng)，合成仿生親和分離材料；(2)用制備的仿生親和分離材料純化玻璃酸酶，將含有玻璃酸酶的樣品流過(guò)該親和層析柱，玻璃酸酶吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，將結(jié)合的玻璃酸酶洗脫下來(lái)。本發(fā)明能夠高效率、低成本的大規(guī)模生產(chǎn)高酶活的玻璃酸酶。
【專利說(shuō)明】玻璃酸酶的仿生親和純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及的是一種生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】的純化方法。特別是一種玻璃酸酶的仿生親和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玻璃酸酶(EC3.3.1.35)，又稱透明質(zhì)酸酶，是一種堿性糖蛋白，屬內(nèi)切糖苷酶。能催化玻璃酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C的β-N-乙酰氨基己糖糖苷鍵水解。它在哺乳動(dòng)物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時(shí)精子進(jìn)入卵子。也存在于精子、頜下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細(xì)胞的溶酶體中。臨床用于局部注射，可加速皮下、肌內(nèi)注射藥液的吸收，促進(jìn)局麻藥的浸潤(rùn)，促進(jìn)手術(shù)及創(chuàng)傷后局部水腫或血腫的擴(kuò)散，也用于腸粘連。我國(guó)1965年正式投入生產(chǎn)，從羊睪丸中提取，收入1977版中國(guó)藥典。
[0003]玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42°C加熱60min活力不損失；100°C加熱5min，活力可保留80%。受熱失活后進(jìn)行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中輕易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯膠或0.2%明膠保護(hù)。
[0004]目前玻璃酸酶大多是從哺乳動(dòng)物睪丸中提取的，通用工藝為睪丸絞成糜漿后，用冰醋酸溶液浸取，然后通過(guò)鹽析、吊濾得到粗制品，再經(jīng)硫酸銨鹽析、透析、去熱源、干燥等得到玻璃酸酶精品。該工藝步驟繁瑣，周期長(zhǎng)，收率低，酶活不高。
[0005]經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，從動(dòng)物胰臟中制備玻璃酸酶的方法有多種，多為硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠層析、切向流超濾等，如中國(guó)專利103060291A—種玻璃酸酶的提取方法；中國(guó)專利103060288A —種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法；中國(guó)專利102851265A一種牛睪丸制備玻璃酸酶的方法；由于采用多步提取純化，導(dǎo)致玻璃酸酶的回收率低，酶活性不高，周期長(zhǎng)，尚未有專利報(bào)道采用仿生親和層析技術(shù)進(jìn)行玻璃酸酶的純化，因此，有必要開(kāi)發(fā)效率高、成本低、生產(chǎn)步驟更簡(jiǎn)便的玻璃酸酶分離材料和和生產(chǎn)工藝。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種玻璃酸酶的仿生親和純化方法，使其克服玻璃酸酶大規(guī)模純化中的缺點(diǎn)，在大規(guī)模分離純化時(shí)步驟少、成本低、效率高，利用玻璃酸酶專一的親和配位體，可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化玻璃酸酶。
[0007]因此本發(fā)明的目的在于提供玻璃酸酶特異性的親和配基；
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于建立玻璃酸酶層析純化方法，保證在大規(guī)模分離純化時(shí)，高效的提取玻璃酸酶。
[0009]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明以基礎(chǔ)層析介質(zhì)為原料制備仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化玻璃酸酶。
[0010]本發(fā)明包括以下步驟
[0011](I)在基礎(chǔ)層析介質(zhì)上進(jìn)行固相合成，制備仿生親和分離材料；
[0012]合成玻璃酸酶專一的親和分離材料，首先以帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)，或用常規(guī)化學(xué)方法對(duì)基礎(chǔ)層析介質(zhì)進(jìn)行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應(yīng)活化，然后與2-氨基對(duì)苯二甲酸和二鹽酸組胺反應(yīng)，合成親和分離材料。
[0013](2)用制備的仿生親和分離材料純化玻璃酸酶；
[0014]用上述合成的親和層析介質(zhì)制備成親和層析柱，將睪丸提取液上清流過(guò)該親和層析柱，玻璃酸酶吸附在親和層析柱上，未結(jié)合的其它蛋白被洗去，改變換緩沖液條件將結(jié)合的玻璃酸酶洗脫下來(lái)，得到玻璃酸酶。
[0015]在步驟(I)中，基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
[0016]在步驟(2)中，親和介質(zhì)吸附玻璃酸酶的條件為為PH6-7，離子強(qiáng)度為0.0-0.15M的緩沖液；洗脫條件為PH3，離子強(qiáng)度為0.1M的緩沖液。
[0017]所述的仿生親和分離材料，其結(jié)構(gòu)是通過(guò)三氮嗪結(jié)構(gòu)骨架作為間臂固定2-氨基對(duì)苯二甲酸及組胺基團(tuán)。
[0018]所述的玻璃酸酶，其原料為哺乳動(dòng)物睪丸。
[0019]本發(fā)明克服了玻璃酸酶生產(chǎn)技術(shù)中的缺點(diǎn)，使玻璃酸酶生產(chǎn)分離達(dá)到純化時(shí)步驟少，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率高的目的。利用玻璃酸酶專一的親和分離材料，可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化玻璃酸酶。玻璃酸酶回收率>10%，酶活高達(dá)1800U / mg。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1:1_氨基-Sepharose-3-氨基對(duì)苯二甲酸-5-組胺-2,4,6-三氮嗪純化玻璃酸酶10% SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)例做進(jìn)一步的闡述:
[0022]實(shí)施例一
[0023]一分離材料制備
[0024]取NH2-Sepharose (50mL),依次用5倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸懼水充分洗漆后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(I?5g)，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6?7之間，反應(yīng)3小時(shí)后取出，依次用3X 10倍體積的水/丙酮(O:1,1:3,1:1,3:1,1:0)洗滌，得到1-氨基-S印harose-3，5- _■氣 _2，4,6- 二氣嚷。
[0025]稱取2-氨基對(duì)苯二甲酸(3?1g)用去離子水溶解，與1-氨基-Sepharose-3,
5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6?7之間，置于溫度50°C中攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1-氨基-S印harose-3-氨基對(duì)苯二甲酸_5_氯_2，4，6-三氮嗪，用20%乙醇儲(chǔ)存待用。
[0026]取1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4,6_三氮嗪,然后稱取二鹽酸組胺(3?1g)，用二甲亞砜和去離子水混合溶解，將溶液的pH調(diào)至5?8左右，較佳的pH7，倒入反應(yīng)器與1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4,6-三氮嗪混合,放于溫度為95°C的恒溫環(huán)境下反應(yīng)60h。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，用4倍體積的NaCl，3倍體積二甲亞砜洗滌，然后用10倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基S印harose-3-氨基苯二甲酸-5-組胺_2，4，6-三氮嗪親和分離材料，用20%乙醇儲(chǔ)存待用。
[0027]二用親和分離材料純化玻璃酸酶
[0028]將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞碎成勻漿狀，按固液比1:1的比例加入冷凍的鹽酸與醋酸混合酸液，4°C攪拌提取4h。浸取結(jié)束后9800rpm，4°C離心lOmin，然后4°C靜置lh，過(guò)濾除脂；得睪丸提取液上清液。離心后沉淀物中，加入一半體積的冷硫酸再提取一次，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液。將1-氨基S印harose-3-氨基苯二甲酸-5-組胺_2，4，
6-三氮嗪親和分離材料(ImL),裝入層析柱(1*2.5cm)中。用1mL磷酸鹽緩沖液(1mM,PH7)平衡后，把5mL上述上清液(調(diào)pH和電導(dǎo)率與磷酸鹽緩沖液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7)洗去未吸附的物質(zhì)后，再用1mL甘氨酸緩沖液(0.1M，pH3)洗脫，收集洗脫組分。用10%的變性還原SDS-PAGE檢測(cè)玻璃酸酶的純度，然后根據(jù)2010版《中華人民共和國(guó)藥典》第二部玻璃酸酶活性測(cè)定方法測(cè)定玻璃酸酶活性最高可達(dá)1800U /
mg ο
[0029]實(shí)驗(yàn)結(jié)果及【專利附圖】
/[文檔編號(hào)].gif)
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1說(shuō)明，I =Marker從上之下分子量依次為116KD，66.2KD, 45KD, 35KD ；2:洗脫液(pH3，10mM Gly-HCl緩沖體系);3_7:流穿液(pH7，1mM PB緩沖體系)；8:羊睪丸提取液上清
[0031]實(shí)施例二
[0032]一分離材料制備
[0033]取NH2_Sepharose (50mL),依次用5倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸懼水充分洗漆后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(l_5g)，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6?7之間，反應(yīng)3小時(shí)后取出，依次用3X10倍體積的水/丙酮(O:1，1:3，1:1，3:1，1:0)洗滌，得到1-氨基-S印harose-3，5- _■氣 _2，4,6- 二氣嚷。
[0034]稱取2-氨基對(duì)苯二甲酸(3-10g)用去離子水溶解，與1-氨基-S印harose-3，5- 二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6?7之間，置于溫度50 V中攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1_氨基-S印harose-3-氨基對(duì)苯二甲酸_5_氯_2，4，6-三氮嗪，用20%乙醇儲(chǔ)存待用。
[0035]取1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4,6_三氮嗪,稱取稱取二鹽酸組胺(3 — 1g)，用二甲亞砜和去離子水混合溶解，將溶液的pH調(diào)至5?8左右，較佳的pH7，倒入反應(yīng)器與1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4, 6_三氮嗪混合,放于溫度為95°C的恒溫環(huán)境下反應(yīng)60h。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，用4倍體積的NaCl，3體積二甲亞砜洗漆，然后用10倍體積的去離子水洗漆。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-組胺_2，4，6-三氮嗪親和分離材料，用20%乙醇儲(chǔ)存待用。
[0036]二用親和分離材料純化玻璃酸酶
[0037]將牛睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞碎成勻漿狀，按固液比1:1的比例加入冷凍的鹽酸與醋酸混合酸液，4°C攪拌提取4h。浸取結(jié)束后9800rpm，4°C離心lOmin，然后4°C靜置lh，過(guò)濾除脂；得睪丸提取液上清液。離心后沉淀物中，加入一半體積的酸液再提取一次，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液。將1-氨基S印harose-3-氨基苯二甲酸_5_組胺_2，4，6_三氮嗪親和分離材料(ImL),裝入層析柱(1*2.5cm)中。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH7)平衡后，把5mL上述上清液(調(diào)pH和電導(dǎo)率與磷酸鹽緩沖液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7)洗去未吸附的物質(zhì)后，再用1mL甘氨酸緩沖液(0.1M，pH3)洗脫，收集洗脫組分。用10%的變性還原SDS-PAGE檢測(cè)玻璃酸酶的純度，然后根據(jù)2010版《中華人民共和國(guó)藥典》第二部玻璃酸酶活性測(cè)定方法測(cè)定玻璃酸酶活性最高可達(dá)1000U / mg。
[0038]實(shí)施例三
[0039]將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞碎成勻漿狀，按固液比1:1的比例加入冷凍的酸液，4°C攪拌提取4h。浸取結(jié)束后9800rpm，4°C離心lOmin，然后4°C靜置lh，過(guò)濾除脂；得睪丸提取液上清液。離心后沉淀物中，加入一半體積的冷酸液再提取一次，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液。將1-氨基3印1^1'0%-3-氨基苯二甲酸-5-組胺-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(ImL)，裝入層析柱(1*2.5em)中。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH6)平衡后，把5mL上述上清液(調(diào)pH和電導(dǎo)率與磷酸鹽緩沖液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH6)洗去未吸附的物質(zhì)后，再用1mL甘氨酸緩沖液(0.1M，pH3)洗脫，收集洗脫組分。用10%的變性還原SDS-PAGE檢測(cè)玻璃酸酶的純度，然后根據(jù)2010版《中華人民共和國(guó)藥典》第二部玻璃酸酶活性測(cè)定方法測(cè)定玻璃酸酶活性為1000U / mg。
【權(quán)利要求】
1.一種玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征在于，包括下列步驟: 1)仿生親和分離材料結(jié)構(gòu)是在基礎(chǔ)層析介質(zhì)上通過(guò)三氮嗪骨架作為間臂固定2-氨基對(duì)苯二甲酸及二鹽酸組胺； 2)用制備的仿生親和分離材料純化睪丸提取液上清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是，步驟(1)中，基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和I V -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是，在步驟(2)中，親和介質(zhì)吸附玻璃酸酶的條件為邱6—7，離子強(qiáng)度為0.0-0.15的緩沖液；洗脫條件為邱3—4，離子強(qiáng)度為0.1I的緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是，所述的仿生親和分離材料，其合成的配體中含有三氮嗪；其合成的配體中含有氨基對(duì)苯二甲酸的結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是所述的仿生親和分離材料，其合成的配體中含有三氮嗪；其合成的配體中含有組胺的結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是，所述的玻璃酸酶，其原料來(lái)源為哺乳動(dòng)物睪丸。
【文檔編號(hào)】C12N9/26GK104419689SQ201310369641
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】李榮秀, 馬貴軍, 翟東改, 陽(yáng)成成 申請(qǐng)人:上海亨臻實(shí)業(yè)有限公司
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種玻璃酸酶仿生親和純化方法，包括下列步驟：(1)基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪反應(yīng)活化后，分別與2-氨基對(duì)苯二甲酸以及二鹽酸組胺反應(yīng)，合成仿生親和分離材料；(2)用制備的仿生親和分離材料純化玻璃酸酶，將含有玻璃酸酶的樣品流過(guò)該親和層析柱，玻璃酸酶吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，將結(jié)合的玻璃酸酶洗脫下來(lái)。本發(fā)明能夠高效率、低成本的大規(guī)模生產(chǎn)高酶活的玻璃酸酶。
【專利說(shuō)明】玻璃酸酶的仿生親和純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及的是一種生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】的純化方法。特別是一種玻璃酸酶的仿生親和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玻璃酸酶(EC3.3.1.35)，又稱透明質(zhì)酸酶，是一種堿性糖蛋白，屬內(nèi)切糖苷酶。能催化玻璃酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C的β-N-乙酰氨基己糖糖苷鍵水解。它在哺乳動(dòng)物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時(shí)精子進(jìn)入卵子。也存在于精子、頜下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細(xì)胞的溶酶體中。臨床用于局部注射，可加速皮下、肌內(nèi)注射藥液的吸收，促進(jìn)局麻藥的浸潤(rùn)，促進(jìn)手術(shù)及創(chuàng)傷后局部水腫或血腫的擴(kuò)散，也用于腸粘連。我國(guó)1965年正式投入生產(chǎn)，從羊睪丸中提取，收入1977版中國(guó)藥典。
[0003]玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42°C加熱60min活力不損失；100°C加熱5min，活力可保留80%。受熱失活后進(jìn)行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中輕易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯膠或0.2%明膠保護(hù)。
[0004]目前玻璃酸酶大多是從哺乳動(dòng)物睪丸中提取的，通用工藝為睪丸絞成糜漿后，用冰醋酸溶液浸取，然后通過(guò)鹽析、吊濾得到粗制品，再經(jīng)硫酸銨鹽析、透析、去熱源、干燥等得到玻璃酸酶精品。該工藝步驟繁瑣，周期長(zhǎng)，收率低，酶活不高。
[0005]經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，從動(dòng)物胰臟中制備玻璃酸酶的方法有多種，多為硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠層析、切向流超濾等，如中國(guó)專利103060291A—種玻璃酸酶的提取方法；中國(guó)專利103060288A —種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法；中國(guó)專利102851265A一種牛睪丸制備玻璃酸酶的方法；由于采用多步提取純化，導(dǎo)致玻璃酸酶的回收率低，酶活性不高，周期長(zhǎng)，尚未有專利報(bào)道采用仿生親和層析技術(shù)進(jìn)行玻璃酸酶的純化，因此，有必要開(kāi)發(fā)效率高、成本低、生產(chǎn)步驟更簡(jiǎn)便的玻璃酸酶分離材料和和生產(chǎn)工藝。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種玻璃酸酶的仿生親和純化方法，使其克服玻璃酸酶大規(guī)模純化中的缺點(diǎn)，在大規(guī)模分離純化時(shí)步驟少、成本低、效率高，利用玻璃酸酶專一的親和配位體，可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化玻璃酸酶。
[0007]因此本發(fā)明的目的在于提供玻璃酸酶特異性的親和配基；
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于建立玻璃酸酶層析純化方法，保證在大規(guī)模分離純化時(shí)，高效的提取玻璃酸酶。
[0009]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明以基礎(chǔ)層析介質(zhì)為原料制備仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化玻璃酸酶。
[0010]本發(fā)明包括以下步驟
[0011](I)在基礎(chǔ)層析介質(zhì)上進(jìn)行固相合成，制備仿生親和分離材料；
[0012]合成玻璃酸酶專一的親和分離材料，首先以帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)，或用常規(guī)化學(xué)方法對(duì)基礎(chǔ)層析介質(zhì)進(jìn)行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應(yīng)活化，然后與2-氨基對(duì)苯二甲酸和二鹽酸組胺反應(yīng)，合成親和分離材料。
[0013](2)用制備的仿生親和分離材料純化玻璃酸酶；
[0014]用上述合成的親和層析介質(zhì)制備成親和層析柱，將睪丸提取液上清流過(guò)該親和層析柱，玻璃酸酶吸附在親和層析柱上，未結(jié)合的其它蛋白被洗去，改變換緩沖液條件將結(jié)合的玻璃酸酶洗脫下來(lái)，得到玻璃酸酶。
[0015]在步驟(I)中，基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
[0016]在步驟(2)中，親和介質(zhì)吸附玻璃酸酶的條件為為PH6-7，離子強(qiáng)度為0.0-0.15M的緩沖液；洗脫條件為PH3，離子強(qiáng)度為0.1M的緩沖液。
[0017]所述的仿生親和分離材料，其結(jié)構(gòu)是通過(guò)三氮嗪結(jié)構(gòu)骨架作為間臂固定2-氨基對(duì)苯二甲酸及組胺基團(tuán)。
[0018]所述的玻璃酸酶，其原料為哺乳動(dòng)物睪丸。
[0019]本發(fā)明克服了玻璃酸酶生產(chǎn)技術(shù)中的缺點(diǎn)，使玻璃酸酶生產(chǎn)分離達(dá)到純化時(shí)步驟少，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率高的目的。利用玻璃酸酶專一的親和分離材料，可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化玻璃酸酶。玻璃酸酶回收率>10%，酶活高達(dá)1800U / mg。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1:1_氨基-Sepharose-3-氨基對(duì)苯二甲酸-5-組胺-2,4,6-三氮嗪純化玻璃酸酶10% SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)例做進(jìn)一步的闡述:
[0022]實(shí)施例一
[0023]一分離材料制備
[0024]取NH2-Sepharose (50mL),依次用5倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸懼水充分洗漆后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(I?5g)，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6?7之間，反應(yīng)3小時(shí)后取出，依次用3X 10倍體積的水/丙酮(O:1,1:3,1:1,3:1,1:0)洗滌，得到1-氨基-S印harose-3，5- _■氣 _2，4,6- 二氣嚷。
[0025]稱取2-氨基對(duì)苯二甲酸(3?1g)用去離子水溶解，與1-氨基-Sepharose-3,
5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6?7之間，置于溫度50°C中攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1-氨基-S印harose-3-氨基對(duì)苯二甲酸_5_氯_2，4，6-三氮嗪，用20%乙醇儲(chǔ)存待用。
[0026]取1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4,6_三氮嗪,然后稱取二鹽酸組胺(3?1g)，用二甲亞砜和去離子水混合溶解，將溶液的pH調(diào)至5?8左右，較佳的pH7，倒入反應(yīng)器與1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4,6-三氮嗪混合,放于溫度為95°C的恒溫環(huán)境下反應(yīng)60h。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，用4倍體積的NaCl，3倍體積二甲亞砜洗滌，然后用10倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基S印harose-3-氨基苯二甲酸-5-組胺_2，4，6-三氮嗪親和分離材料，用20%乙醇儲(chǔ)存待用。
[0027]二用親和分離材料純化玻璃酸酶
[0028]將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞碎成勻漿狀，按固液比1:1的比例加入冷凍的鹽酸與醋酸混合酸液，4°C攪拌提取4h。浸取結(jié)束后9800rpm，4°C離心lOmin，然后4°C靜置lh，過(guò)濾除脂；得睪丸提取液上清液。離心后沉淀物中，加入一半體積的冷硫酸再提取一次，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液。將1-氨基S印harose-3-氨基苯二甲酸-5-組胺_2，4，
6-三氮嗪親和分離材料(ImL),裝入層析柱(1*2.5cm)中。用1mL磷酸鹽緩沖液(1mM,PH7)平衡后，把5mL上述上清液(調(diào)pH和電導(dǎo)率與磷酸鹽緩沖液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7)洗去未吸附的物質(zhì)后，再用1mL甘氨酸緩沖液(0.1M，pH3)洗脫，收集洗脫組分。用10%的變性還原SDS-PAGE檢測(cè)玻璃酸酶的純度，然后根據(jù)2010版《中華人民共和國(guó)藥典》第二部玻璃酸酶活性測(cè)定方法測(cè)定玻璃酸酶活性最高可達(dá)1800U /
mg ο
[0029]實(shí)驗(yàn)結(jié)果及【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1說(shuō)明，I =Marker從上之下分子量依次為116KD，66.2KD, 45KD, 35KD ；2:洗脫液(pH3，10mM Gly-HCl緩沖體系);3_7:流穿液(pH7，1mM PB緩沖體系)；8:羊睪丸提取液上清
[0031]實(shí)施例二
[0032]一分離材料制備
[0033]取NH2_Sepharose (50mL),依次用5倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸懼水充分洗漆后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(l_5g)，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6?7之間，反應(yīng)3小時(shí)后取出，依次用3X10倍體積的水/丙酮(O:1，1:3，1:1，3:1，1:0)洗滌，得到1-氨基-S印harose-3，5- _■氣 _2，4,6- 二氣嚷。
[0034]稱取2-氨基對(duì)苯二甲酸(3-10g)用去離子水溶解，與1-氨基-S印harose-3，5- 二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6?7之間，置于溫度50 V中攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1_氨基-S印harose-3-氨基對(duì)苯二甲酸_5_氯_2，4，6-三氮嗪，用20%乙醇儲(chǔ)存待用。
[0035]取1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4,6_三氮嗪,稱取稱取二鹽酸組胺(3 — 1g)，用二甲亞砜和去離子水混合溶解，將溶液的pH調(diào)至5?8左右，較佳的pH7，倒入反應(yīng)器與1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4, 6_三氮嗪混合,放于溫度為95°C的恒溫環(huán)境下反應(yīng)60h。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，用4倍體積的NaCl，3體積二甲亞砜洗漆，然后用10倍體積的去離子水洗漆。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-組胺_2，4，6-三氮嗪親和分離材料，用20%乙醇儲(chǔ)存待用。
[0036]二用親和分離材料純化玻璃酸酶
[0037]將牛睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞碎成勻漿狀，按固液比1:1的比例加入冷凍的鹽酸與醋酸混合酸液，4°C攪拌提取4h。浸取結(jié)束后9800rpm，4°C離心lOmin，然后4°C靜置lh，過(guò)濾除脂；得睪丸提取液上清液。離心后沉淀物中，加入一半體積的酸液再提取一次，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液。將1-氨基S印harose-3-氨基苯二甲酸_5_組胺_2，4，6_三氮嗪親和分離材料(ImL),裝入層析柱(1*2.5cm)中。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM,pH7)平衡后，把5mL上述上清液(調(diào)pH和電導(dǎo)率與磷酸鹽緩沖液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH7)洗去未吸附的物質(zhì)后，再用1mL甘氨酸緩沖液(0.1M，pH3)洗脫，收集洗脫組分。用10%的變性還原SDS-PAGE檢測(cè)玻璃酸酶的純度，然后根據(jù)2010版《中華人民共和國(guó)藥典》第二部玻璃酸酶活性測(cè)定方法測(cè)定玻璃酸酶活性最高可達(dá)1000U / mg。
[0038]實(shí)施例三
[0039]將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞碎成勻漿狀，按固液比1:1的比例加入冷凍的酸液，4°C攪拌提取4h。浸取結(jié)束后9800rpm，4°C離心lOmin，然后4°C靜置lh，過(guò)濾除脂；得睪丸提取液上清液。離心后沉淀物中，加入一半體積的冷酸液再提取一次，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液。將1-氨基3印1^1'0%-3-氨基苯二甲酸-5-組胺-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(ImL)，裝入層析柱(1*2.5em)中。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH6)平衡后，把5mL上述上清液(調(diào)pH和電導(dǎo)率與磷酸鹽緩沖液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩沖液(10mM，pH6)洗去未吸附的物質(zhì)后，再用1mL甘氨酸緩沖液(0.1M，pH3)洗脫，收集洗脫組分。用10%的變性還原SDS-PAGE檢測(cè)玻璃酸酶的純度，然后根據(jù)2010版《中華人民共和國(guó)藥典》第二部玻璃酸酶活性測(cè)定方法測(cè)定玻璃酸酶活性為1000U / mg。
【權(quán)利要求】
1.一種玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征在于，包括下列步驟: 1)仿生親和分離材料結(jié)構(gòu)是在基礎(chǔ)層析介質(zhì)上通過(guò)三氮嗪骨架作為間臂固定2-氨基對(duì)苯二甲酸及二鹽酸組胺； 2)用制備的仿生親和分離材料純化睪丸提取液上清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是，步驟(1)中，基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和I V -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是，在步驟(2)中，親和介質(zhì)吸附玻璃酸酶的條件為邱6—7，離子強(qiáng)度為0.0-0.15的緩沖液；洗脫條件為邱3—4，離子強(qiáng)度為0.1I的緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是，所述的仿生親和分離材料，其合成的配體中含有三氮嗪；其合成的配體中含有氨基對(duì)苯二甲酸的結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是所述的仿生親和分離材料，其合成的配體中含有三氮嗪；其合成的配體中含有組胺的結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特征是，所述的玻璃酸酶，其原料來(lái)源為哺乳動(dòng)物睪丸。
【文檔編號(hào)】C12N9/26GK104419689SQ201310369641
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】李榮秀, 馬貴軍, 翟東改, 陽(yáng)成成 申請(qǐng)人:上海亨臻實(shí)業(yè)有限公司
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