專(zhuān)利名稱(chēng)：分泌型高產(chǎn)戊二酰－7－氨基頭孢烷酸?；傅男戮甑闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及頭孢菌素?；?，尤其是關(guān)于一種重組戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富蚝秃性摶虻闹亟M表達(dá)質(zhì)粒以及該基因在大腸桿菌中的分泌表達(dá)。
7-氨基頭孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid，7-ACA)是醫(yī)藥工業(yè)合成大多數(shù)頭孢菌素衍生物的起始原料。7-ACA可以通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)物頭孢菌索C(cephalosporin C，CPC)的化學(xué)去氨酰化得到。由于化學(xué)方法諸如亞胺醚和亞硝酰氯法包括多個(gè)造價(jià)昂貴的步驟，所以人們一直試圖探索用酶法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題[Vandamme E J，Voets J P.Adv Appl Micrbiol，1974，17311]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)頭孢菌素?；?cephalosporin acylase，CA)，分別為戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?glutaryl-7-ACA acylase，GL-7ACA?；?和頭孢菌素C?；?cephalosporin C acylase，CPC?；?，它們分別催化GL-7ACA和CPC的水解反應(yīng)，又因?yàn)镃PC可以在D-氨基酸氧化酶催化下(D-AAO)很容易地生成GL-7ACA[Isogai T et al J Biochem，1990，1081063]。所以GL-7ACA?；负虲PC酰化酶一樣，在酶法合成7-ACA上具有重要的應(yīng)用價(jià)值(見(jiàn)圖1)。
根據(jù)已有的報(bào)道，現(xiàn)已有10個(gè)頭孢菌素?；傅幕虮豢寺見(jiàn)MatsudaA，Komatsu KI.JBacteriol，1985，1631222；Yang Y et al.Chin JBiotech，1991，799；Ishii Y et al.JFerment Bioeng，1994，77591；Matsuda A et al，JBacteriol，1987，1695815；Matsuda A et al.JBacteriol，1987，1695821；Ishiye M，Niwa M.Biochim Biophys Acta，1992，1132233；Aramori I et al.，J Ferment Bioeng，1991，72232；Aramori I et al.J Bacteriol，1991，1737848]。楊蘊(yùn)劉等從假單胞菌中克隆到GL-7-ACA?；傅幕騕YangY et al.JBacteriol，1991，799]，并測(cè)定了其全序列。該?；概cGK16?；竅MatsudaA，Komatsu K I.J Bacteriol，1985，1631222]和C430?；竅Ishii Y et al.JFerment Bioeng，1994，77591]很相似，這三個(gè)酶基因具有95％左右的同源性。酶分子量均為70千道爾頓，由兩個(gè)亞基組成，β-亞基分子量為54千道爾頓、α-基為16千道爾頓；它們最引人注目的特點(diǎn)是在很寬的pH值范圍內(nèi)(pH6.5-9.0)對(duì)GL-7ACA都有很高的水解活力；這一點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)上是十分有利的，因?yàn)镚L-7ACA水解過(guò)程中生成戊二酸，反應(yīng)液的pH值變化較大。
GK16?；富蜃钕缺灰患胰毡竟究寺Tsuzuki K et al.NipponNougeikagaku Kaishi，1989，631847]，但是該基因只有公開(kāi)報(bào)道的α-亞基的全部序列和β-亞基的部分序列。隨后日本另一家公司克隆了C430?；富?，并公開(kāi)發(fā)表了全基因序列[Ishii Y et al.J Ferment Bioeng，1994，77591]。由于酶基因在假單胞菌中表達(dá)量極低，這兩家日本公司都對(duì)酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行了不同程度的高表達(dá)工作，得到的高表達(dá)菌株產(chǎn)酶量比原宿主菌(假單胞菌)高出許多倍。楊蘊(yùn)劉等從假單胞菌克隆的酰化酶基因片段約為3.5kb(kb表示DNA的長(zhǎng)度為1000個(gè)堿基對(duì))，該基因在假單胞菌中表達(dá)極低，即使在大腸桿菌中表達(dá)量也很低，粗抽液比活力僅為每毫克蛋白0.42單位(0.42u/mg)[周宏偉等.微生物學(xué)報(bào)，1997，37196]，需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的五步才能純化。李勇等采用基因工程方法改造此酶基因，改造后的基因在大腸桿菌中得到高表達(dá)，菌株產(chǎn)酶量達(dá)到每克濕菌2040單位酶，粗抽液?；副然盍槊亢量说鞍?.5單位，而且粗抽液經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的兩步層析柱純化后比活力就已達(dá)到每毫克蛋白12單位[Yong Li et al.ProteinExpression and Purification，1998，12233-238]。
但以上高表達(dá)基因的方法都采用了非分泌型的表達(dá)菌株，不可避免的要涉及到酶的分離純化以及固定化酶等一系列生產(chǎn)上難以應(yīng)付的問(wèn)題，其結(jié)果是對(duì)技術(shù)、儀器設(shè)備要求很高，使生產(chǎn)成本大大提高。為此，陳劍峰等借助Pseudomonas sp.130表達(dá)元件以及信號(hào)肽構(gòu)建了GL-7ACA的分泌型表達(dá)質(zhì)粒pTrcCAlS和pKKCAlS，該表達(dá)元件介導(dǎo)GL-7ACA酰化酶基因在大腸桿菌中獲得了高表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物在信號(hào)肽的引導(dǎo)下被轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間，測(cè)得完整細(xì)胞的?；副然盍Ψ謩e為每克菌體23.9單位和每克菌體18.3單位[陳劍峰等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1998，30(4)393-396]。由于GL-7ACA?；傅牡孜颎L-7ACA和產(chǎn)物7-ACA都可以自由進(jìn)出周質(zhì)空間，可以通過(guò)在培養(yǎng)基中加入底物而獲得產(chǎn)物，從而有可能簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本。但這兩個(gè)質(zhì)粒有一個(gè)共同缺點(diǎn)，即它們帶有氨芐青霉素抗性，具有β-內(nèi)酰氨酶基因。盡管β-內(nèi)酰氨酶對(duì)GL-7ACA和CPC水解活力極低，但在大批量的工業(yè)生產(chǎn)中，還是有可能破壞底物(GL-7ACA和CPC)。因此本發(fā)明特構(gòu)建了不帶β-內(nèi)酰氨酶基因的分泌表達(dá)質(zhì)粒，使其在大腸桿菌中獲得高表達(dá)，以便在7-ACA的酶法生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
本發(fā)明目的是提供一種重組GL-7ACA?；富蚣捌浔磉_(dá)元件和信號(hào)肽，和含有該重組基因及其表達(dá)元件和信號(hào)肽的帶卡那霉素抗性分泌型高表達(dá)重組質(zhì)粒，以及將該重組分泌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到特定大腸桿菌中成為能高分泌表達(dá)該?；傅幕蚬こ叹?。
本發(fā)明提供一種從假單胞菌中克隆的并經(jīng)基因工程方法改造的長(zhǎng)為2.5kb的重組GL-7ACA?；富蚣捌浔磉_(dá)元件和信號(hào)肽，它們的全序列見(jiàn)圖3以及圖6、圖7。用該重組GL-7ACA酰化酶基因切成的兩個(gè)片段與NcoⅠ和HindⅢ酶切后大腸桿菌帶卡那霉素抗性的表達(dá)載體pET-28a(+)連接成為重組分泌表達(dá)質(zhì)粒pETCAlS，再將該重組分泌表達(dá)質(zhì)粒pETCAlS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中得到分泌型高表達(dá)基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS。
1．重組GL-7ACA?；富蛞约捌浔磉_(dá)元件、信號(hào)肽的克隆GL-7ACA?；富蛞约捌浔磉_(dá)元件、信號(hào)肽由楊蘊(yùn)劉等克隆[楊蘊(yùn)劉等，生物工程學(xué)報(bào)，1991，7(2)99-107]，但未公開(kāi)發(fā)表它們的序列。楊蘊(yùn)劉等構(gòu)建的質(zhì)粒pMR24，它帶有來(lái)自假單胞菌長(zhǎng)為3.5kb片段的GL-7ACA?；富?。將pMR24以限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ酶切后，得到0.7kb的片段，它包含有GL-7ACA?；甫?亞基的相應(yīng)核苷酸序列以及該酶的表達(dá)原件、信號(hào)肽。表達(dá)元件介導(dǎo)GL-7ACA酰化酶基因在大腸桿菌中獲得高表達(dá)，信號(hào)肽引導(dǎo)GL-7ACA?；阜置诘街苜|(zhì)空間。將該0.7kb片段與經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ酶切后的載體pBluescript SKⅡ連接成重組質(zhì)粒pBlue3。陳劍峰等利用pBlue3以及pKKCAl[Yong Li al.Protein Expression and Purification，1998，12233-238]構(gòu)建了重組分泌表達(dá)質(zhì)粒pKKCA1S[陳劍峰等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1998，30(4)393-396]，它包含有長(zhǎng)為2.5kb的重組GL-7ACA酰化酶基因，但未公開(kāi)發(fā)表其序列。
2．重組分泌型表達(dá)質(zhì)粒pETCAlS的構(gòu)建將上述表達(dá)質(zhì)粒pKKCAlS用限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后，可以將該質(zhì)粒中包含的重組GL-7ACA?；富蚯谐砷L(zhǎng)度分別為1.0kb和1.5kb的兩個(gè)片段。將1.5kb的片段與經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后的大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)連接成過(guò)渡性質(zhì)粒pETCAlS-B。pETCAlS-B依次經(jīng)NcoⅠ酶切和牛腸堿性磷酸酶去磷酸化后，與1.0kb的片段連接成重組分泌型表達(dá)質(zhì)粒pETCAlS(如圖2所示)。在該質(zhì)粒中，酰化酶基因依靠大腸桿菌表達(dá)載體pET28-a(+)的T7啟動(dòng)子、自身的表達(dá)元件以及轉(zhuǎn)錄終止子和終止密碼子而表達(dá)，然后依靠信號(hào)肽引導(dǎo)GL-7ACA?；阜置诘街苜|(zhì)空間。
3．基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS的獲得將pETCAlS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3){遺傳特征為hsdSgal(λcIts857indl Sam7 nin5 lacUV5-T7 genel)}中，得到的轉(zhuǎn)化子BL21(DE3)/pETCAlS即為本發(fā)明的基因工程菌株(菌種保藏號(hào)CGMCC NO.0473，日期2000年7月11日，保藏地北京，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)。雖然質(zhì)粒pETCAlS具有l(wèi)acⅠ基因，但由于T7啟動(dòng)子的特異性及宿主菌BL21(DE3)能高表達(dá)T7RNA聚合酶，在不加IPTG誘導(dǎo)的條件下也能高表達(dá)。
4．完整細(xì)胞GL-7ACA?；富盍y(cè)定完整細(xì)胞GL-7ACA?；富盍Φ臏y(cè)定參照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981，45(10)，2225-2229.]進(jìn)行。酶活力單位(unit)定義為37℃、pH7.0時(shí)每分鐘水解GL-7ACA產(chǎn)生1微摩爾的7-ACA所需要的酶量。酶的比活力定義為每克菌體所具有的酶活力單位。該菌株在普通TB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，測(cè)得比活力為每克菌體82個(gè)單位(這個(gè)數(shù)據(jù)是八次實(shí)驗(yàn)的平均值)，高于TGl／pTrcCAlS(每克菌體23.9個(gè)單位)和TGl/pKKCAlS(每克菌體18.3個(gè)單位)。
5．周質(zhì)空間蛋白質(zhì)的初分級(jí)、SDS-PAGE及粗酶的酶活力測(cè)定周質(zhì)空間蛋白的初分級(jí)根據(jù)Molecular CloningA Laboratory Manual介紹的方法進(jìn)行(Sambrook，J et al.1989，Molecular CloningA LaboratoryManual.Cold Spring Harbor， New York843)。得到的粗抽液濃縮5倍后，再進(jìn)行SDS-PAGE和測(cè)定粗抽液的酶活力。粗抽液的酶活力測(cè)定參照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981；45773]進(jìn)行，測(cè)得每毫升粗抽液的酶活力為1.35單位。
6．穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在含卡那霉素濃度達(dá)到10微克/毫升的LB平板上劃線培養(yǎng)，連續(xù)傳代達(dá)50次，測(cè)定第10、20、30、40、50的比活力，活力穩(wěn)定，可見(jiàn)該基因在大腸桿菌中很穩(wěn)定(見(jiàn)圖5)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明是一種高產(chǎn)GL-7ACA?；福置谛图皫в锌敲顾乜剐缘男滦突蚬こ叹?。從假單胞菌中克隆并經(jīng)基因工程方法改造的長(zhǎng)度為2.5kb的重組GL-7ACA?；富蚣捌浞置诒磉_(dá)元件。用該重組GL-7ACA?；富蚺cNcoⅠ和HindⅢ酶切后的帶有卡那霉素抗性的大腸桿菌表達(dá)載體pET-28(+)連接成為重組表達(dá)質(zhì)粒pETCAlS，再將該質(zhì)粒pETCAlS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中得到高表達(dá)GL-7ACA?；傅幕蚬こ叹闎L21(DE3)/pETCAlS。與JMl09/pKKCA1，TGl/pKKCAlS及TGl/pTrcCAlS相比，它有以下優(yōu)點(diǎn)1．分泌表達(dá)相比JM109/pKKCAl[Yong Li et al.Protein Expression and Purification，1998，12233-238]，由于它是非分泌表達(dá)菌株，一旦用于生產(chǎn)就不可避免要涉及到酶的分離純化以及固定化酶等復(fù)雜的技術(shù)問(wèn)題，生產(chǎn)成本大大提高。而由于本發(fā)明使用了GL-7ACA?；傅男盘?hào)肽，得到的基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS是分泌表達(dá)菌株，表達(dá)的GL-7ACA?；冈谛盘?hào)肽的引導(dǎo)下直接分泌到周質(zhì)空間，而且GL-7ACA及7-ACA都能自由進(jìn)出周質(zhì)空間，所以完全可以采用傳統(tǒng)發(fā)酵法生產(chǎn)，從而大大降低生產(chǎn)成本。
2．不帶β-內(nèi)氨酰酶基因雖然TGl/pTrcCAlS及TGl/pKKCAlS[陳劍峰等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1998，30(4)393-396]都是分泌表達(dá)菌株，由于質(zhì)粒為氨芐青霉素抗性，都帶有β-內(nèi)氨酰酶基因，盡管β-內(nèi)酰氨酶對(duì)GL-7ACA和CPC水解活力極低，但在大批量的工業(yè)生產(chǎn)中，仍有可能破壞底物(GL-7ACA和CPC)。本發(fā)明菌株用卡那霉素抗性取代了氨芐青霉素抗性，克服了這一缺點(diǎn)。
3．不需要使用誘導(dǎo)劑TGl/pTrcCAlS雖然可以分泌高表達(dá)GL-7ACA?；?，但需要昂貴而有毒的IPTG誘導(dǎo)。本發(fā)明菌株不需要添加任何誘導(dǎo)劑，降低了成本，避開(kāi)了導(dǎo)入有毒物質(zhì)。
4．分泌表達(dá)產(chǎn)量有很大提高李勇和陳劍鋒構(gòu)建的基因工程菌株的表達(dá)產(chǎn)量比起始構(gòu)建的基因工程菌已提高很多[Yong Li et al.Protein Expression and Purification，1998，12233-238；陳劍峰等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1998，30(4)393-396]。但本發(fā)明中構(gòu)建的BL21(DE3)/pETCAlS具有特異的T7啟動(dòng)子，使含該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子中GL-7ACA?；傅谋磉_(dá)量大大提高，完整細(xì)胞的比活力可達(dá)到每克菌體82單位，約為T(mén)Gl/pTrcCAlS(每克菌體23.9個(gè)單位)的3.4倍、TGl/pKKCAlS(每克菌體18.3個(gè)單位)的4.5倍。
5．本發(fā)明菌株易培養(yǎng)且表達(dá)穩(wěn)定本發(fā)明菌株在普通TB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)24小時(shí)即可。本發(fā)明菌株表達(dá)GL-7ACA?；笜O穩(wěn)定，傳代50代未見(jiàn)表達(dá)產(chǎn)量下降和酶活喪失。
通過(guò)以下附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。


圖1是GL-7ACA?；负虲PC?；杆呋姆磻?yīng)示意圖。CPC頭孢菌素C；D-AAOD-氨基酸氧化酶；7-ACA7-氨基頭孢烷酸；GL-7ACA戊二酰-7-氨基頭孢烷酸。
圖2是重組分泌表達(dá)質(zhì)粒pETCAlS的構(gòu)建示意圖。
圖3是本發(fā)明2.5kb的重組GL-7ACA?；富虻暮塑账嵝蛄泻拖鄳?yīng)的氨基酸序列。
圖4是周質(zhì)空間蛋白的SDS-PAGE圖。
圖中1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，分子量分別為66、43、31、20千道爾頓(kD)；2.周質(zhì)空間粗抽液；3.BL21(DE3)/pETCAlS菌株的完整細(xì)胞裂解液；4.BL21(DE3)菌株完整細(xì)胞裂解液對(duì)照。
圖5是穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)第1、10、20、30、40、50代GL-7ACA?；富盍?。
圖6是表達(dá)元件核苷酸序列。
圖7是信號(hào)肽的核苷酸序列以及相應(yīng)的氨基酸序列。
實(shí)施例1重組分泌型表達(dá)質(zhì)粒pETCAlS的構(gòu)建質(zhì)粒pKKCAlS[陳劍峰等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1998，30(4)393-396]經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后，重組GL-7ACA酰化酶基因被切成兩段，其中1.5kb的長(zhǎng)片段具有NcoⅠ和HindⅢ粘性末端，1.0kb的短片段兩端都帶有NcoⅠ粘性末端。大腸桿菌表達(dá)載體pET28-a(+)[為Novagen公司產(chǎn)品]長(zhǎng)度為5369bp，它包含有一個(gè)特異性的強(qiáng)T7啟動(dòng)子、NcoⅠ到XhoⅠ的多克隆位點(diǎn)、lacI操縱子，lacZ核糖體結(jié)合位點(diǎn)AGGA和起始密碼子ATG；為了避免不穩(wěn)定的復(fù)制，在多克隆位點(diǎn)的下游緊接著一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子即T7終止子；該載體帶有一個(gè)卡那霉素抗性基因，因此具有卡那霉素抗性；該質(zhì)粒具有ColE1和fl兩個(gè)復(fù)制子。用T4DNA連接酶將1.5kb片段與NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后的表達(dá)載體pET28-a(+)連接，得到過(guò)渡性質(zhì)粒pETCAlS-B。pETCAlS-B依次經(jīng)NcoⅠ單酶切和牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理后，與1.0kb的小片段連接成分泌表達(dá)質(zhì)粒pETCAlS(見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例2基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS的獲得將大腸桿菌BL21(DE3){遺傳特征為hsdSgal(λcIts857 indl Sam7 nin5lacUV5-T7 genel)}用氯化鈣法(Sambrook，J et al.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual.Cold Spring Harbor，New York)制備成感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化率為106pfu)。將pETCAlS轉(zhuǎn)化到該細(xì)胞中，得到的轉(zhuǎn)化子命名為BL21(DE3)/pETCAlS，即為本發(fā)明的基因工程菌株。在普通TB培養(yǎng)基(超級(jí)肉湯培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基的配制在900毫升去離子水中加入12克細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨、24克細(xì)菌培養(yǎng)用酵母抽提物、4毫升甘油，在1.034×105帕斯卡高壓下蒸汽滅菌20分鐘，然后使該溶液降溫至60℃或60℃以下，再加入100毫升經(jīng)滅菌的017摩爾/升磷酸二氫鉀、0.72摩爾/升磷酸氫二鉀溶液而成)于30℃培養(yǎng)24小時(shí)后，離心收集菌體并測(cè)GL-7ACA酰化酶活力，測(cè)得比活力為每克菌體82個(gè)單位。
實(shí)施例3完整細(xì)胞的酶活力測(cè)定完整細(xì)胞的GL-7ACA?；富盍Φ臏y(cè)定參照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981，45(10)，2225-2229.]進(jìn)行。酶活力單位(unit)定義為37℃、pH7.0時(shí)每分鐘水解GL-7ACA產(chǎn)生1微摩爾的7-ACA所需要的酶量。酶的比活力定義為每克菌體所具有的酶活力單位。在普通TB培養(yǎng)基(同實(shí)施例2)中于30℃培養(yǎng)24小時(shí)后，取4毫升菌液，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集菌體，沉淀懸浮于3毫升pH7.0、0.1摩爾每升的磷酸鈉緩沖液中。取100微升菌液于37℃預(yù)熱5分鐘，加入100微升已同時(shí)于37℃預(yù)熱了5分鐘的16毫摩爾/升的GL-7ACA，于37℃混合保溫30分鐘；加入600微升終止液(20％的醋酸和50毫摩爾每升的NaOH以2∶1的體積比混合)混合，15000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘，取上清；最后加入100微升0.5％的對(duì)二甲氨基苯甲醛(Merk公司，美國(guó))顯色；測(cè)定最終混合液在415納米處的光吸收值，即可算出水解產(chǎn)物7-ACA的量。此外，取菌液作適當(dāng)稀釋?zhuān)瑴y(cè)在600納米處的光吸收值。以7-ACA產(chǎn)量對(duì)菌質(zhì)量即可算出比活力。
實(shí)施例4周質(zhì)空間?；复痔帷DS-PAGE及粗酶的酶活力測(cè)定周質(zhì)空間蛋白的初分級(jí)根據(jù)Molecular CloningA Laboratory Manual介紹的方法進(jìn)行(Sambrook，J et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor，New York843)。取50毫升菌液，4℃時(shí)13000轉(zhuǎn)每分鐘離心3分鐘沉淀細(xì)胞；沉淀懸浮于5毫升溶菌酶裂解液中(溶菌酶1毫克每毫升、質(zhì)量體積比為20％的蔗糖、30毫摩爾pH8.0的Tris.Cl、1毫摩爾pH8.0的EDTA)，冰浴10分鐘；然后于4℃時(shí)13000轉(zhuǎn)每分鐘離心3分鐘沉淀細(xì)胞，收集上清；上清裝入透析袋中對(duì)聚乙二醇濃縮5倍后，再進(jìn)行SDS-PAGE(見(jiàn)圖4)和測(cè)粗活。周質(zhì)空間粗抽液和完整細(xì)胞裂解液都可見(jiàn)到54kD的β-亞基條帶；α-亞基由于分子量過(guò)小，只在周質(zhì)空間粗抽液有模糊條帶16KD可見(jiàn)。粗活測(cè)定參照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981；45773]進(jìn)行。酶活力定義為37℃、pH7.0時(shí)每分鐘水解GL-7ACA產(chǎn)生1微摩爾的7-ACA所需要的酶量。測(cè)活體系為600微升，反應(yīng)緩沖液為100毫摩爾/升、pH7.0的磷酸鈉緩沖液，底物濃度為16毫摩爾/升；加入適量的酶，于37℃保溫20分鐘；加入1.8毫升的終止液(20％的醋酸與50毫摩爾每升的NaOH以2∶1的體積比混合)終止反應(yīng)；最后加入100微升0.5％的對(duì)二甲氨基苯甲醛(Merk公司，美國(guó))顯色；測(cè)定最終混合液在415納米處的光吸收值，即可算出水解產(chǎn)物7-ACA的量。測(cè)得每毫升粗抽液的酶活力為1.35單位。
權(quán)利要求
1.一種重組戊二酰-7-氨基頭胞烷酸?；富颍涮卣髟谟谒幋aGL-7ACA?；傅暮塑账嵝蛄幸约跋鄳?yīng)的氨基酸序列如下1CTGGCCGAGCCGACCTCGACGCCGCAGGCGCCGATTGCGGCCTATAAACCGAGAAGCAATGAGATCCTG 691LeuAlaGluProThrSerThrProGlnAlaProIleAlaAlaTyrLysProArgSerAsnGluIleLeu 2370 TGGGACGGCTACGGCGTCCCGCACATCTACGGGGTCGACGCGCCCTCAGCCTTCTACGGCTACGGCTGG 13824 TrpAspGlyTyrGlyValProHisIleTyrGlyValAspAlaProSerAlaPheTyrGlyTyrGlyTrp 46139 GCCCAGGCGCGCAGCCACGGCGACAATATCCTGCGCCTGTATGGAGAAGCGCGGGGCAAGGGGGCCGAA 20747 AlaGlnAlaArgSerHisGlyAspAsnIleLeuArgLeuTyrGlyGluAlaArgGlyLysGlyAlaGlu 69208 TACTGGGGCCGGATGACGAACAGACGACCGTCTGGCGTCTGACCAACGGCGTGCCGGAG CGTGCCCAG 27670 TyrTrpGlyProAspAspGluGlnThrThrValTrpArgLeuThrAsnGlyValProGluArgAlaGln 138277 CAGTGGTATGCGCAGCAGTCGCCTGATTTCCGCGCCAACCTCGACGCCTTCGCGGCGGGCATCAACGCC 345139 GlnTrpTyrAlaGlnGlnSerProAspPheArgAlaAsnLeuAspAlaPheAlaAlaGlyIleAsnAla 207346 TATGCGCAGCAGAACCCCGACGACATCTCGCCCTGACTGCGGCAGGTGCTGCCGGTCGCCGGCGCCGAC 414208 TyrAlaGlnGlnAsnProAspAspIleSerProAspValArgGlnValLeuProValAlaGlyAlaAsp 276415 GTGGTGGCCCACGCCCATCGCCTGATGAACTTCCTCTATGTCGCGTCGCCCGGCCGCACCCTGGGCGAG 483277 ValValAlaHisAlaHisArgLeuMetAsnPheLeuTyrValAlaSerProGlyArgThrLeuGlyGlu 345484 GGCGACCCGCCGGACCTGGCCGATCAGGGATCCAACTCCTGGGCTGTGGCGCCGGGCAAGACGGCCAAT 552346 GlyAspProProAspLeuAlaAspGlnGlySerAsnSerTrpAlaValAlaProGlyLysThrAlaAsn 414553 GGGAACGCCCTGCTGCTGCAGAACCCGCACCTGTCCTGGACGACGGACTACTTCACCTACTACGAGGCG 621415 GlyAsnAlaLeuLeuLeuGlnAsnProHisLeuSerTrpThrThrAspTyrPheThrTyrTyrGluAla 483622 CATCTCTTCACGCCGGACTTCGAAATCTATGGCGCGACCCAGATCGGCCTGCCGGTCATCCGCTTCGCC 690484 HisLeuPheThrProAspPheGluIleTyrGlyAlaThrGlnIleGlyLeuProValIleArgPheAla 552691 TTCAATCAGCGGATGGGCATCACCAATACCGTCAACGGCATGGTGGGGGCCACCAACTATCGGCTGACG 759553 PheAsnGlnArgMetGlyIleThrAsnThrValAsnGlyMetValGlyAlaThrAsnTyrArgLeuThr 621760 CTTCAGGGCGACGGCTATCTGTATGACGGTCAGGTGCGGCCGTTCGAGCGGCGTCAGGCTTCGCATCGC 828622 LeuGlnGlyAspGlyTyrLeuTyrAspGlyGlnValArgProPheGluArgArgGlnAlaSerHisArg 690829 CTGCGTCAGGCGGACGGGTCGACGGTCGACAAGCCGTTGGAGATCCGTTCCAGCGTCCATGGCCCGGTC 897691 LeuArgGlnAlaAspGlySerThrValAspLysProLeuGluIleArgSerSerValHisGlyProVal 759898 TTCGAGCGCGCGGACGGCACGGCCGTCGCCGTTCGGGTCGCCGGTCTGGATCGGCCGGGCATGCTCGAG 966760 PheGluArgAlaAspGlyThrAlaValAlaValArgValAlaGlyLeuAspArgProGlyMetLeuGlu 828967 CAGTATTTCGACATGATCACGGCGGACAGCTTCGACGACTACGAAGCCGCTATGGCGCGGATGCATGTG 1035829 GlnTyrPheAspMetIleThrAlaAspSerPheAspAspTyrGluAlaAlaMetAlaArgMetHisVal1036 CCGACCTTCAACATCGTCTACGCCGACCGCGAAGGGACCATCAACTACAGCTTCACGGCGTGGCGCCCA 1104ProThrPheAsnIleValTyrAlaAspArgGluGlyThrIleAsnTyrSerPheThrAlaTrpArgPro1105 AACGGGCCGAGGGCGACATCGCCTTCTGGCAGGGGCTCGGCCGGGCCATTCCTCGCGTTACTGTGGACT 1173AsnGlyProArgAlaThrSerProSerGlyArgGlySerAlaGlyProPheLeuAlaLeuLeuTrpThr1174 GAGACACACCCCTGGACGATCTGCCGCGCGTCACCAATCCGCCGGCCCGCTTCGTGCAGAACTCCAATG 1242GluThrHisProTrpThrIleCysArgAlaSerProIleArgArgProAlaSerCysArgThrProMet1243 ATCCGCCGTGGACGCCGACCTGGCCCGTCACCTACACGCCCAGGGACTTCCCCTCCTATCTGGCGCCCC 1311IleArgArgGlyArgArgProGlyProSerPROThrArgProGlyThrSerProProIleTrpArgPro1312 AGACGCGCACTCCCTGCGCGCTCAGCAAAGCGTGCGTCTGATGTCGAGAACGACGACCTGAGGCTGGAA 1380ArgArgAlaLeuProAlaArgSerAlaLysArgAlaSerAspValGluAsnAspAspLeuArgLeuGlu1381 CGCTTCATGGCGCTGCAGTTGAGCCACCGCGCCGTCATGGCCGACCGCACCTTGCCGGACCTGATCCCG 1449ArgPheMetAlaLeuGlnLeuSerHisArgAlaValMetAlaAspArgThrLeuProAspLeuIlePro1450 GCCGCCCTGATCGACCCCGATCCCGAGGTCCAGGCGGCGGCGCGCCTGCTGGCGGCGTGGGATCGTGAG 1518AlaAlaLeuIleAspProAspProGluValGlnAlaAlaAlaArgLeuLeuAlaAlaTrpAspArgGlu1519 TTCACCAGCGACAGCCGCGCCGCCCTGCTGTTCGAGGAATGGGCGCGTCTGTTCGCCGGCCAGAATTTC 1587PheThrSerAspSerArgAlaAlaLeuLeuPheGluGluTrpAlaArgLeuPheAlaGlyGlnAsnPhe1588 GCCGGCCAGGCGGGTTTCGCCACGCCCTGGTCGCTGGATAAGCCGGTCAGCACCCCCACGGCGTCCGCT 1656AlaGlyGlnAlaGlyPheAlaThrProTrpSerLeuAspLysProValSerThrProTyrGlyValArg1657 GACCCCAAGGCCGCCGTCGATCAACTGCGGACCGCCATCGCCAACACCAAGCGCAAATACGGCGCGATC 1725AspProLysAlaAlaValAspGlnLeuArgThrAlaIleAlaAsnThrLysArgLysTyrGlyAlaIle1726 GACCGCCCGTTCGGCGACGCCTCGCGCATGATCCTGAACGATGTGATTGTTCCGGGCGCCGCCGGCTAC 1794AspArgProPheGlyAspAlaSerArgMetIleLeuAsnAspValIleValProGlyAlaAlaGlyTyr1795 GGCAACCTGGGTTCCTTCCGGGTCTTCACCTGGTCCGATCCTGACGAAAACGGGGTTCGCACGCCCGTC 1863GlyAsnLeuGlySerPheArgValPheThrTrpSerAspProAspGluAsnGlyValArgThrProVal1864 CACGGCGAGACGTGGGTGGCGATGATCGAGTTCTCCACCCCGGTGCGGGCCTATGGCCTGATGAGCTAC 1932HisGlyGluThrTrpValAlaMetIleGluPheSerThrProValArgAlaTyrGlyLeuMetSerTyr1933 GGCAATTCTCGCCAGCCGGGCACGACGCACTACAGCGATCAGATCGAACGCGTGTCGCGGGCCGACTTC 2001GlyAsnSerArgGlnProGlyThrThrHisTyrSerAspGlnIleGluArgValSerArgAlaAspPhe2002 CGCGAGCTGTTGCTGCGGCGAGAGCAGGTCGAGGCCGCCGTCCAGGAACGCACGCCCTTCAACTTCAAG 2070ArgGluLeuLeuLeuArgArgGluGlnValGluAlaAlaValGlnGluArgThrProPheAsnpheLys2071 CCATGAAAGGCCTGACCATGACACGACGGATTGGGTATTCGGCGGGCGCGGCGTCTCTGGCGCTGATGG 2139ProTCGCCGCCTCTGGAGCGGCGGCGGGCGAGCCGGCCTTCACTTCGGTTCAGGTCGAGGGCTTTTCGGTACCGGGCGCGCTGTCGAAGGCCTGGGCCGACTTCGACAACGACGGCGACCTGGACCTGGCCGTCTCCTGGAAGAGCGGCGAAGTTCGCCTCTATCTCAACGACGGCGGCGCTTTCGTCAACATCGGCCCGGAGATGGGCTGCCTACCTCGGGCATCGAGATTCGCGGGTTGAGCTGGGGCGACTTCGACGGCGATGGGTTCGTCGAC
2．權(quán)利要求1所述重組GL-7ACA酰化酶基因的表達(dá)元件，其特征在于該表達(dá)元件的核苷酸序列如下ATCCGTGGTTCGTACGCGCCGCCTACAAGTGGTGATCTAGGGGAACGTTCCGGGGGCGTCGCTTCAACGGCGTCTCCGGATCTGGGTGAGAGGGGAAATCC
3．權(quán)利要求1所述重組GL-7ACA酰化酶基因的信號(hào)肽，其特征在于該信號(hào)肽的核苷酸序列以及相應(yīng)的氨基酸序列如下ATGCTGAGAGTTCTGCACCGGGCGACGTCCGCCCTGGTTATGGCGACTGCGATCGGCCTTGCGCCCGGCMetLeuArgValLeuHisArgAlaThrSerAlaLeuValMetAlaThrAlaIleGlyLeuAlaProGlyGTCGCCCTTGCGValAlaLeuAla
4．含有權(quán)利要求1，2和3所述的重組GL-7ACA?；富蛞约捌浔磉_(dá)元件、信號(hào)肽的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于該表達(dá)質(zhì)粒是由所述的帶表達(dá)元件、以及信號(hào)肽的相應(yīng)核苷酸序列的重組GL-7ACA?；富蚺cNcoⅠ和HindⅢ酶切后的大腸桿菌表達(dá)載體pET28-a(+)構(gòu)建而成的帶卡那霉素抗性的重組分泌表達(dá)質(zhì)粒pETCAlS。
5．含有權(quán)利4所述的重組分泌表達(dá)質(zhì)粒pETCA1S的基因工程菌株，其特征在于該菌株是將重組分泌表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒pETCA1S轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中得到的保藏號(hào)為CGMCC No.0473的基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從假單胞菌中克隆并經(jīng)基因工程改造得到的長(zhǎng)為2.5kb的重組GL－7ACA?；富蚣捌浔磉_(dá)元件和信號(hào)肽的序列。構(gòu)建了該基因的高分泌表達(dá)重組質(zhì)粒pETCA1S,該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21(DE3),得到的基因工程菌株BL21(DE3)/pETCA1S在普通的TB培養(yǎng)基中,無(wú)需添加誘導(dǎo)劑即能高效分泌表達(dá)GL－7ACA?；?比活力可達(dá)到每克菌體82個(gè)單位。
文檔編號(hào)C12N15/55GK1283696SQ0012510
公開(kāi)日2001年2月14日 申請(qǐng)日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者王恩多, 鄭勇剛, 陳劍峰, 姜衛(wèi)紅, 趙國(guó)屏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所