本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種有效的低分子量RNA分離純化方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

長度介于10-30nt之間的低分子量RNA，尤其是長度介于20-25nt的miRNAs，miRNAs是一類重要的低分子量RNA，其具有很高的穩(wěn)定性，在反復(fù)凍融、pH改變以及RNA裂解酶的作用下都不易降解?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，低分子量RNA對植物的生長、發(fā)育等起著重要的調(diào)控作用，為了保證研究低分子量RNA生物功能的科學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌拈_展，不受到多糖、多酚等物質(zhì)的影響，有必要分離出高質(zhì)量、高含量的低分子量RNA。

然而，由于低分子量RNA的堿基片段較小，在總RNA中含量甚微，尤其是長度介于10-30nt之間的RNA。由于其分子量極低，在離心時(shí)不易沉淀，按照傳統(tǒng)的從總RNA中回收低分子量RNA的方法，容易導(dǎo)致低分子量RNA跟隨棄掉的上清液流失，無法分離回收低分子量RNA的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種有效的低分子量RNA分離純化方法及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有從總RNA中回收低分子量RNA的方法，容易導(dǎo)致低分子量RNA跟隨棄掉的上清液流失，無法分離回收低分子量RNA的問題。

本發(fā)明提供了一種有效的低分子量RNA分離純化方法，包括以下步驟：

步驟1，按Trizol法提取總RNA，獲得總RNA溶液，用DEPC水將總RNA溶液的濃度調(diào)至1μg/μL；

步驟2，取一定體積的總RNA溶液，分別加入相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的40-60％聚乙二醇和相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的4-6M NaCl溶液，混合均勻，冰浴30min，然后于4℃、15000rmp離心10min，收集上清液；

步驟3，向步驟2的上清液中加入相當(dāng)于上清液2.5倍體積的無水乙醇，然后于-20℃放置2-3h，之后于4℃、15000rpm離心1-1.5h，棄去上清液，得到RNA沉淀物；

步驟4，用體積濃度為75-80％的乙醇清洗RNA沉淀物2次，自然晾干，并將自然晾干后的RNA沉淀物溶于一定體積的DEPC水中，獲得富集的RNA溶液；

步驟5，制備聚丙烯酰氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％變性聚丙烯酰氨凝膠，并在200V電壓下預(yù)電泳15-30min；

步驟6，配制一定體積的RNA樣品點(diǎn)樣溶液，所述RNA樣品點(diǎn)樣溶液按照以下步驟配制：步驟4中富集的RNA溶液和2×上樣緩沖液，按1∶1的體積比渦旋混勻，65℃保溫5-10min，然后放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟7，配制一定體積的marker溶液，所述marker溶液按照以下步驟配制：2×上樣緩沖液和包含10-500nt的DNAmarker，按1∶1的體積比渦旋混勻，65℃保溫5-10min，然后放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟8，將步驟6的RNA樣品點(diǎn)樣溶液和步驟7的marker溶液分別點(diǎn)樣于變性聚丙烯酰氨凝膠中，200V電壓下電泳1h，然后取出變性聚丙烯酰氨凝膠，并用濃度為1μg/μL的EB溶液浸泡染色5min，最后回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA，獲得低分子量RNA溶液。

優(yōu)選的，本發(fā)明提供的一種有效的低分子量RNA分離純化方法，步驟8中，按以下步驟回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA：

步驟1)，切下變性聚丙烯酰氨凝膠上含有低分子量RNA的凝膠塊，放于2mL離心管中，搗碎成凝膠碎粒，然后加入相當(dāng)于凝膠碎粒2倍體積的0.3M NaCl溶液，混勻，室溫靜置12-15h，獲得凝膠溶液；

步驟2)，將凝膠溶液轉(zhuǎn)移至RNA過濾柱中，于4℃、13000-15000rpm離心1min，棄去凝膠碎粒，收集過濾液；

步驟3)，向過濾液中分別加入3μL質(zhì)量濃度為5mg/mL的糖原和相當(dāng)于過濾液2.5倍體積的無水乙醇，混勻，于-80℃靜置2-12h，然后于4℃、15000rpm離心30min，并棄去上清液，得到低分子量RNA沉淀物；

步驟4)，用體積濃度為75-80％的乙醇清洗低分子量RNA沉淀物2次，然后自然晾干，并將晾干后的低分子量RNA沉淀物溶于10μL DEPC水中，獲得低分子量RNA溶液。

優(yōu)選的，上述步驟2中NaCl溶液的濃度為5M，聚乙二醇的體積濃度為50％。

優(yōu)選的，上述步驟3中于-20℃放置時(shí)間為2h，4℃、15000rpm離心時(shí)間為1h。

優(yōu)選的，上述步驟4中乙醇的體積濃度是80％。

優(yōu)選的，上述步驟4)中乙醇的體積濃度是80％。

本發(fā)明還提供了一種有效的低分子量RNA分離純化方法，在提取植物中低分子量RNA的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種有效的低分子量RNA分離純化方法，在提取番茄中低分子量RNA的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種有效的低分子量RNA分離純化方法，克服了傳統(tǒng)方法的缺陷，可以有效的分離出長度介于10-30nt的低分子量RNA，并且由本發(fā)明的方法分離出的低分子量RNA純度和含量均較高。

附圖說明

圖1是利用本發(fā)明的方法提取中低分子量RNA的15％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

本發(fā)明提供的一種有效的小分子RNA分離純化方法，包括以下步驟：

步驟1，按Trizol法提取總RNA，獲得總RNA溶液，用DEPC水將總RNA溶液的濃度調(diào)至1μg/μL；

需要說明的是，Trizol法提取總RNA是本領(lǐng)域的常用方法，故此處不再贅述Trizol法的具體步驟。

步驟2，取一定體積的總RNA溶液，分別加入相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的40-60％聚乙二醇和相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的4-6M NaCl溶液，混合均勻，冰浴30min，然后于4℃、15000rmp離心10min，收集上清液，其中40-60％聚乙二醇指的是聚乙二醇的體積濃度為40-60％。

步驟3，向步驟2的上清液中加入相當(dāng)于上清液2.5倍體積的無水乙醇，然后于-20℃放置2-3h，之后于4℃、15000rpm離心1-1.5h，棄去上清液，得到RNA沉淀物。

步驟4，用體積濃度為75-80％的乙醇清洗RNA沉淀物2次，自然晾干，并將自然晾干后的RNA沉淀物溶于一定體積的DEPC水中，獲得富集的RNA溶液。

步驟5，制備聚丙烯酰氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％變性聚丙烯酰氨凝膠，并在200V電壓下預(yù)電泳15-30min。

需要說明的是，變性聚丙烯酰氨凝膠的具體制備步驟如下：

步驟5.1，按照Bio-Rad垂直電泳玻璃板，1.5mm間隙(Mini-PROTEAN3，USA)，制備聚丙烯酰氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％變性聚丙烯酰氨凝膠，具體包括：9.6克尿素、7.5mL 40％(w/v)聚丙烯酰胺貯存液、2mL 10×TBE緩沖液、DEPC水補(bǔ)至20mL，混合均勻，于37℃加熱溶解尿素，然后用膜孔直徑為0.45μL的硝酸纖維素膜過濾，冷卻至室溫，得到混合液；

步驟5.2，向混合液中加入120μL新鮮配制的10％過硫酸銨溶液，混合均勻，然后再加入9.2μL TEMED(四甲基乙二胺)，渦旋混勻，獲得凝膠溶液，

步驟5.3，向電泳玻璃板縫隙內(nèi)灌入凝膠溶液直至頂部；

步驟5.4，迅速插入梳子，室溫下靜置30min，使凝膠溶液凝固；

步驟5.5，帶凝膠溶液凝固后拔出梳子，膠孔用1×TBE緩沖液充分清洗干凈。

需要說明的是，應(yīng)當(dāng)用1×TBE緩沖液清洗膠孔，其中1×TBE緩沖液為5×TBE儲存液稀釋而得，每升5×TBE儲存液的配制方法為：54g Tris堿、27.5g硼酸、20ml/L EDTA，加入無菌水溶解混勻，NaOH調(diào)pH至8.0，定容至1L。

步驟6，配制一定體積的RNA樣品點(diǎn)樣溶液，所述RNA樣品點(diǎn)樣溶液按照以下步驟配制：步驟4中富集的RNA溶液和2×上樣緩沖液(2×loading buffer)，按1∶1的體積比渦旋混勻，65℃保溫5-10min，然后放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

需要說明的是，2×上樣緩沖液為購自Invitrogen公司的2×loading buffer。

步驟7，配制一定體積的marker溶液，所述marker溶液按照以下步驟配制：2×上樣緩沖液和包含10-500nt的DNAmarker，按1∶1的體積比渦旋混勻，65℃保溫5-10min，然后放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

需要說明的是，本發(fā)明中包含10-500nt的DNA marker為Gene Ruler ULR10-500nt DNA Ladder。

步驟8，將步驟6的RNA樣品點(diǎn)樣溶液和步驟7的marker溶液分別點(diǎn)樣于變性聚丙烯酰氨凝膠中，200V電壓下電泳1h，然后取出變性聚丙烯酰氨凝膠，并用濃度為1μg/μL的EB溶液浸泡染色5min，最后回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA，獲得低分子量RNA溶液。

優(yōu)選的，步驟8中，按以下步驟回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA：

步驟1)，切下變性聚丙烯酰氨凝膠上含有低分子量RNA的凝膠塊，放于2mL離心管中，搗碎成凝膠碎粒，然后加入相當(dāng)于凝膠碎粒2倍體積的0.3M NaCl溶液，混勻，室溫靜置12-15h，獲得凝膠溶液；

步驟2)，將凝膠溶液轉(zhuǎn)移至RNA過濾柱中，于4℃、13000-15000rpm離心1min，棄去凝膠碎粒，收集過濾液；需要說明的是，本發(fā)明采用的為天根生物公司的Spin-X過濾柱。

步驟3)，向過濾液中分別加入3μL質(zhì)量濃度為5mg/mL的糖原和相當(dāng)于過濾液2.5倍體積的無水乙醇，混勻，于-80℃靜置2-12h，然后于4℃、15000rpm離心30min，并棄去上清液，得到低分子量RNA沉淀物。

步驟4)，用體積濃度為75-80％的乙醇清洗低分子量RNA沉淀物2次，然后自然晾干，并將晾干后的低分子量RNA沉淀物溶于10μL DEPC水中，獲得低分子量RNA溶液。

需要說明的是，上述步驟中的“放于冰上保存”是為了防止溶液中DNA的降解，“冰上保存”的溫度在0℃以下。

下面以番茄、大豆、擬南芥為例，對本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

步驟1，按Trizol法提取番茄總RNA，獲得總RNA溶液，用DEPC水將總RNA溶液的濃度調(diào)至1μg/μL；

步驟2，取30μL的總RNA溶液，分別加入相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的50％聚乙二醇和相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的5MNaCl溶液，混合均勻，冰浴30min，然后于4℃、15000rmp離心10min，收集上清液，并且采用的聚乙二醇為PEG8000；

步驟3，向步驟2的上清液中加入相當(dāng)于上清液2.5倍體積的無水乙醇，然后于-20℃放置2h，之后于4℃、15000rpm離心1h，棄去上清液，得到RNA沉淀物；

步驟4，用體積濃度為80％的乙醇清洗RNA沉淀物2次，自然晾干，并將自然晾干后的RNA沉淀物溶于20μL的DEPC水中，獲得富集的RNA溶液；

步驟5，制備聚丙烯酰氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％變性聚丙烯酰氨凝膠，并在200V電壓下預(yù)電泳20min；

步驟6，配制20μL RNA樣品點(diǎn)樣溶液，所述RNA樣品點(diǎn)樣溶液按照以下步驟配制：步驟4中富集的RNA溶液10μL和2×上樣緩沖液10μL，渦旋混勻，65℃保溫5min，然后迅速放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟7，配制6μL marker溶液，所述marker溶液按照以下步驟配制：向3μL Gene Ruler ULR10-500nt DNA Ladder中加入3μL的2×上樣緩沖液，渦旋混勻，65℃保溫5min，然后迅速放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟8，將步驟6的RNA樣品點(diǎn)樣溶液和步驟7的marker溶液分別點(diǎn)樣于變性聚丙烯酰氨凝膠中，200V電壓下電泳1h，然后取出變性聚丙烯酰氨凝膠，并用濃度為1μg/μL的EB溶液浸泡染色5min，最后回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA，獲得低分子量RNA溶液。

優(yōu)選的，步驟8中，按以下步驟回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA：

步驟1)，切下變性聚丙烯酰氨凝膠上含有10-30nt低分子量RNA的凝膠塊，放于2mL離心管中，用玻璃棒搗碎成凝膠碎粒，然后加入相當(dāng)于凝膠塊2倍體積0.3M NaCl溶液，混勻，室溫靜置12h，獲得凝膠溶液；需要說明的是，用干凈刀片切下變性聚丙烯酰氨凝膠的RNA樣品泳道上與marker 10-30nt核苷酸位置對應(yīng)的凝膠塊，即為變性聚丙烯酰氨凝膠上含有10-30nt低分子量RNA的凝膠塊；

步驟2)，將凝膠溶液轉(zhuǎn)移至Spin-X RNA過濾柱中，于4℃、15000rpm離心1min，棄去凝膠碎粒，收集過濾液；

步驟3)，向過濾液中分別加入3μL質(zhì)量濃度為5mg/mL的糖原和相當(dāng)于過濾液2.5倍體積的無水乙醇，混勻，于-80℃靜置2h，然后于4℃、15000rpm離心30min，并棄去上清液，得到低分子量RNA沉淀物；

步驟4)，用體積濃度為80％的乙醇清洗低分子量RNA沉淀物2次，然后自然晾干，并將晾干后的低分子量RNA沉淀物溶于10μL DEPC水中，獲得低分子量RNA溶液。

利用實(shí)施例1的方法提取3個(gè)番茄樣品的總RNA，并進(jìn)行低分子量RNA的富集和分離，然后利用15％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，EB染色，結(jié)果如圖1所示，泳道1、2、3分別對應(yīng)樣品a、樣品b和樣品c，由圖1可知，泳道1、2、3中小于30nt范圍內(nèi)均可見清晰的低分子量RNA條帶。

分別對樣品a、樣品b和樣品c中的對低分子量RNA的純度進(jìn)行分析得出，樣品a中，提取的低分子量RNA含量為9.28ng/μL，且低分子量RNA的OD260/280＝2.08；樣品b中，提取的低分子量RNA含量為9.30ng/μL，且低分子量RNA的OD260/280＝2.09；樣品c中，提取的低分子量RNA含量為9.29ng/μL，且低分子量RNA的OD260/280＝2.10，說明通過本發(fā)明的方法提取的3個(gè)番茄樣品中的低分子量RNA均具有較高的純度和含量。

實(shí)施例2

步驟1，按Trizol法提取大豆總RNA，獲得總RNA溶液，用DEPC水將總RNA溶液的濃度調(diào)至1μg/μL；

步驟2，取20μL的總RNA溶液，分別加入相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的40％聚乙二醇和相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的4M NaCl溶液，混合均勻，冰浴30min，然后于4℃、15000rmp離心10min，收集上清液，并且采用的聚乙二醇為PEG8000；

步驟3，向步驟2的上清液中加入相當(dāng)于上清液2.5倍體積的無水乙醇，然后于-20℃放置2.5h，之后于4℃、15000rpm離心1h，棄去上清液，得到RNA沉淀物；

步驟4，用體積濃度為75％的乙醇清洗RNA沉淀物2次，自然晾干，并將自然晾干后的RNA沉淀物溶于20μL的DEPC水中，獲得富集的RNA溶液；

步驟5，制備聚丙烯酰氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％變性聚丙烯酰氨凝膠，并在200V電壓下預(yù)電泳15min；

步驟6，配制20μL RNA樣品點(diǎn)樣溶液，所述RNA樣品點(diǎn)樣溶液按照以下步驟配制：步驟4中富集的RNA溶液10μL和2×上樣緩沖液10μL，渦旋混勻，65℃保溫7min，然后迅速放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟7，配制6μL marker溶液，所述marker溶液按照以下步驟配制：向3μL Gene Ruler ULR10-500nt DNA Ladder中加入3μL的2×上樣緩沖液，渦旋混勻，65℃保溫7min，然后迅速放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟8，將步驟6的RNA樣品點(diǎn)樣溶液和步驟7的marker溶液分別點(diǎn)樣于變性聚丙烯酰氨凝膠中，200V電壓下電泳1h，然后取出變性聚丙烯酰氨凝膠，并用濃度為1μg/μL的EB溶液浸泡染色5min，最后回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA，獲得低分子量RNA溶液。

優(yōu)選的，步驟8中，按以下步驟回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA：

步驟1)，切下變性聚丙烯酰氨凝膠上含有10-30nt低分子量RNA的凝膠塊，放于2mL離心管中，用玻璃棒搗碎成凝膠碎粒，然后加入相當(dāng)于凝膠塊2倍體積0.3M NaCl溶液，混勻，室溫靜置13h，獲得凝膠溶液；需要說明的是，用干凈刀片切下變性聚丙烯酰氨凝膠的RNA樣品泳道上與marker 10-30nt核苷酸位置對應(yīng)的凝膠塊，即為變性聚丙烯酰氨凝膠上含有10-30nt低分子量RNA的凝膠塊；

步驟2)，將凝膠溶液轉(zhuǎn)移至Spin-X RNA過濾柱中，于4℃、13000rpm離心1min，棄去凝膠碎粒，收集過濾液；

步驟3)，向過濾液中分別加入3μL質(zhì)量濃度為5mg/mL的糖原和相當(dāng)于過濾液2.5倍體積的無水乙醇，混勻，于-80℃靜置6h，然后于4℃、15000rpm離心30min，并棄去上清液，得到低分子量RNA沉淀物；

步驟4)，用體積濃度為75％的乙醇清洗低分子量RNA沉淀物2次，然后自然晾干，并將晾干后的低分子量RNA沉淀物溶于10μL DEPC水中，獲得低分子量RNA溶液。

采用實(shí)施例2的方法提取大豆的低分子量RNA含量為9.10ng/μL，且低分子量RNA的OD260/280＝2.00，提取的低分子量RNA均具有較高的純度和含量。

實(shí)施例3

步驟1，按Trizol法提取擬南芥總RNA，獲得總RNA溶液，用DEPC水將總RNA溶液的濃度調(diào)至1μg/μL；

步驟2，取40μL的總RNA溶液，分別加入相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的60％聚乙二醇和相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的6M NaCl溶液，混合均勻，冰浴30min，然后于4℃、15000rmp離心10min，收集上清液，并且采用的聚乙二醇為PEG8000；

步驟3，向步驟2的上清液中加入相當(dāng)于上清液2.5倍體積的無水乙醇，然后于-20℃放置3h，之后于4℃、15000rpm離心1.5h，棄去上清液，得到RNA沉淀物；

步驟4，用體積濃度為78％的乙醇清洗RNA沉淀物2次，自然晾干，并將自然晾干后的RNA沉淀物溶于20μL的DEPC水中，獲得富集的RNA溶液；

步驟5，制備聚丙烯酰氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％變性聚丙烯酰氨凝膠，并在200V電壓下預(yù)電泳30min；

步驟6，配制20μL RNA樣品點(diǎn)樣溶液，所述RNA樣品點(diǎn)樣溶液按照以下步驟配制：步驟4中富集的RNA溶液10μL和2×上樣緩沖液10μL，渦旋混勻，65℃保溫10min，然后迅速放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟7，配制6μL marker溶液，所述marker溶液按照以下步驟配制：向3μL Gene Ruler ULR10-500nt DNA Ladder中加入3μL的2×上樣緩沖液，渦旋混勻，65℃保溫10min，然后迅速放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟8，將步驟6的RNA樣品點(diǎn)樣溶液和步驟7的marker溶液分別點(diǎn)樣于變性聚丙烯酰氨凝膠中，200V電壓下電泳1h，然后取出變性聚丙烯酰氨凝膠，并用濃度為1μg/μL的EB溶液浸泡染色5min，最后回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA，獲得低分子量RNA溶液。

優(yōu)選的，步驟8中，按以下步驟回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA：

步驟1)，切下變性聚丙烯酰氨凝膠上含有10-30nt低分子量RNA的凝膠塊，放于2mL離心管中，用玻璃棒搗碎成凝膠碎粒，然后加入相當(dāng)于凝膠塊2倍體積0.3M NaCl溶液，混勻，室溫靜置15h，獲得凝膠溶液；需要說明的是，用干凈刀片切下變性聚丙烯酰氨凝膠的RNA樣品泳道上與marker 10-30nt核苷酸位置對應(yīng)的凝膠塊，即為變性聚丙烯酰氨凝膠上含有10-30nt低分子量RNA的凝膠塊；

步驟2)，將凝膠溶液轉(zhuǎn)移至Spin-X RNA過濾柱中，于4℃、14000rpm離心1min，棄去凝膠碎粒，收集過濾液；

步驟3)，向過濾液中分別加入3μL質(zhì)量濃度為5mg/mL的糖原和相當(dāng)于過濾液2.5倍體積的無水乙醇，混勻，于-80℃靜置10h，然后于4℃、15000rpm離心30min，并棄去上清液，得到低分子量RNA沉淀物；

步驟4)，用體積濃度為78％的乙醇清洗低分子量RNA沉淀物2次，然后自然晾干，并將晾干后的低分子量RNA沉淀物溶于10μL DEPC水中，獲得低分子量RNA溶液。

采用實(shí)施例3的方法提取擬南芥的低分子量RNA含量為9.00ng/μL，且低分子量RNA的OD260/280＝2.06，提取的低分子量RNA均具有較高的純度和含量。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。