1.一種有效的低分子量RNA分離純化方法,其特征在于,包括以下步驟:
步驟1,按Trizol法提取總RNA,獲得總RNA溶液,用DEPC水將總RNA溶液的濃度調(diào)至1μg/μL;
步驟2,取一定體積的總RNA溶液,分別加入相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的40-60%聚乙二醇和相當(dāng)于總RNA溶液1/10體積的4-6M NaCl溶液,混合均勻,冰浴30min,然后于4℃、15000rmp離心10min,收集上清液;
步驟3,向步驟2的上清液中加入相當(dāng)于上清液2.5倍體積的無水乙醇,然后于-20℃放置2-3h,之后于4℃、15000rpm離心1-1.5h,棄去上清液,得到RNA沉淀物;
步驟4,用體積濃度為75-80%的乙醇清洗RNA沉淀物2次,自然晾干,并將自然晾干后的RNA沉淀物溶于一定體積的DEPC水中,獲得富集的RNA溶液;
步驟5,制備聚丙烯酰氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%變性聚丙烯酰氨凝膠,并在200V電壓下預(yù)電泳15-30min;
步驟6,配制一定體積的RNA樣品點(diǎn)樣溶液,所述RNA樣品點(diǎn)樣溶液按照以下步驟配制:步驟4中富集的RNA溶液和2×上樣緩沖液,按1∶1的體積比渦旋混勻,65℃保溫5-10min,然后放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟7,配制一定體積的marker溶液,所述marker溶液按照以下步驟配制:2×上樣緩沖液和包含10-500nt的DNA marker,按1∶1的體積比渦旋混勻,65℃保溫5-10min,然后放于冰上保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟8,將步驟6的RNA樣品點(diǎn)樣溶液和步驟7的marker溶液分別點(diǎn)樣于變性聚丙烯酰氨凝膠中,200V電壓下電泳1h,然后取出變性聚丙烯酰氨凝膠,并用濃度為1μg/μL的EB溶液浸泡染色5min,最后回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA,獲得低分子量RNA溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量RNA分離純化方法,其特征在于,步驟8中,按以下步驟回收并純化變性聚丙烯酰氨凝膠中的低分子量RNA:
步驟1),切下變性聚丙烯酰氨凝膠上含有低分子量RNA的凝膠塊,放于2mL離心管中,搗碎成凝膠碎粒,然后加入相當(dāng)于凝膠碎粒2倍體積的0.3M NaCl溶液,混勻,室溫靜置12-15h,獲得凝膠溶液;
步驟2),將凝膠溶液轉(zhuǎn)移至RNA過濾柱中,于4℃、13000-15000rpm離心1min,棄去凝膠碎粒,收集過濾液;
步驟3),向過濾液中分別加入3μL質(zhì)量濃度為5mg/mL的糖原和相當(dāng)于過濾液2.5倍體積的無水乙醇,混勻,于-80℃靜置2-12h,然后于4℃、15000rpm離心30min,并棄去上清液,得到低分子量RNA沉淀物;
步驟4),用體積濃度為75-80%的乙醇清洗低分子量RNA沉淀物2次,然后自然晾干,并將晾干后的低分子量RNA沉淀物溶于10μL DEPC水中,獲得低分子量RNA溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量RNA分離純化方法,其特征在于,步驟2中NaCl溶液的濃度為5M,聚乙二醇的體積濃度為50%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量RNA分離純化方法,其特征在于,步驟3中于-20℃放置時(shí)間為2h,4℃、15000rpm離心時(shí)間為1h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低分子量RNA分離純化方法,其特征在于,步驟4中乙醇的體積濃度是80%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低分子量RNA分離純化方法,其特征在于,步驟4)中乙醇的體積濃度是80%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的低分子量RNA分離純化方法,在提取植物中低分子量RNA的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的低分子量RNA分離純化方法,在提取番茄中低分子量RNA的應(yīng)用。