本發(fā)明涉及一種以花粉為載體的固定化酶及其制備方法，屬催化材料與酶固定化技術領域。

背景技術：

游離酶的催化活性、穩(wěn)定性和回收、重復使用和連續(xù)操作可控性等問題制約著實際生產(chǎn)中的應用，為了解決上述問題，固定化技術應運而生。固定化技術就是將酶限定在某個區(qū)域內(nèi)，在不影響其催化活性的基礎上，提高穩(wěn)定性和回收、重復使用率等性能。

固定化酶載體的性能應滿足以下幾點要求：(1)帶有能與酶相結(jié)合的官能團；(2)多孔結(jié)構；(3)水不溶性；(4)良好的機械剛性和穩(wěn)定性。目前固定化酶所使用的載體材料包括無機載體、高分子載體、復合載體及新型載體等。CN103421762A公開了一種明膠交聯(lián)包覆于碳材料和酶表面的固定化酶的方法；CN102382811A公開了以改性凹凸棒土為載體固定化脂肪酶的方法；CN103602655A公開了一種巰基改性二氧化鈦納米纖維固定化酶的方法；CN102649954A公開了一種磁性納米粘土載體固定化酶。

花粉是一種天然多孔材料，安全無毒，來源廣泛且廉價易得，其表面和內(nèi)部含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類、維生素、核酸等活性物質(zhì)以及多種官能團，被稱為“微型營養(yǎng)庫”，易于進行表面改性。目前，花粉多在食品、過敏原檢測等方面應用，CN105285617A公開了一種含低聚半乳糖復合功能型滁菊蜂花粉懸浮飲料的方法；CN105087225A公開了一種用破壁花粉和/或破壁花粉提取液經(jīng)過接種酵母菌發(fā)酵而成的酒及含酒飲料的方法。目前，采用花粉作為固定化酶的載體尚無報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現(xiàn)有技術存在的不足而提供一種以花粉為載體的固定化酶及其制備方法，所得固定化酶具有成本低廉，催化活性高、易回收利用、反復使用性能好、制備過程環(huán)保的特點。

本發(fā)明為解決上述提出的問題所采用的技術方案為：

花粉作為載體在固定化酶中的應用。

一種以花粉為載體的固定化酶。

按上述方案，所述以花粉為載體的固定化酶，它由載體與酶以吸附的方式相結(jié)合所形成，其中，所述載體為花粉或者改性后的花粉。

進一步地，為了提高酶的固載效率，可以對花粉載體進行改性。所述改性的方法為表面修飾(即在花粉表面修飾特定基團)，或者磁性修飾(即在花粉修飾磁性顆粒)，或者兼有表面修飾和磁性修飾。其中，磁性修飾可以更便于固定化酶的回收。

按上述方案，所述的花粉主要包括油菜花粉、玉米花粉、蜂花粉、茶花粉、松花粉、槐花粉、西瓜花粉、棗花粉、菊花花粉、蕎麥花粉、荷花花粉、芝麻花粉等。

按上述方案，所述的酶主要包括豬胰腺酶、皺褶假絲酵母、解脂假絲酵母、南極假絲酵母、洋蔥假單胞菌脂肪酶、米根霉，磷脂酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、果膠酶等。

按上述方案，所述表面修飾采用異丁基三甲(乙)氧基硅烷、辛基三甲(乙)氧基硅烷、巰丙基三甲(乙)氧基硅烷或氨丙基三甲(乙)氧基硅烷等硅烷化試劑。

按上述方案，所述磁性修飾采用四氧化三鐵納米顆粒、三氧化二鐵納米顆?；蜩F合金納米顆粒等磁性納米顆粒。

本發(fā)明所述以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

1)花粉浸泡于反應溶劑中除雜，然后除去反應溶劑，干燥后，得到預處理后的花粉顆粒；

所得預處理后的花粉顆粒作為載體直接用于步驟3)；或者將預處理后的花粉經(jīng)過改性后得到改性花粉顆粒，所得改性花粉顆粒作為載體用于步驟3)；

2)將酶分散于緩沖溶液中，配制得到脂肪酶溶液；

3)酶在載體表面的固定化：將載體浸潤后置于脂肪酶溶液中，于真空條件下進行酶的固定化反應，反應完成后即得到以花粉為載體的固定化酶。

進一步地，所述步驟1)中，花粉與反應溶劑的比例為1g：(5-20)mL。

進一步地，所述步驟1)中，浸泡時間優(yōu)選0.5-4h；干燥優(yōu)選冷凍干燥。

進一步地，所述步驟1)中，改性為磁性吸附改性，其改性方法為：將磁性納米顆粒分散于反應溶劑中，然后加入預處理后的花粉進行吸附反應，反應結(jié)束后經(jīng)洗滌、分離、干燥后，得到磁性吸附改性的花粉顆粒。其中，預處理后的花粉與磁性納米顆粒、反應溶劑的比例為(0.5-5)g：1g：(10-30)mL；分離可以采用離心分離或者磁分離。

進一步地，所述步驟1)中，改性為表面基團改性，其改性方法為：將預處理后的花粉懸浮于反應溶劑中得到懸浮液，然后加入硅烷化試劑在堿性條件下進行硅烷化反應，反應結(jié)束后經(jīng)洗滌、分離、干燥后，得到表面基團改性的花粉顆粒。其中，反應條件為：溫度為35-65℃，惰性氣氛下攪拌反應10-20h，攪拌速度為200-500rpm；懸浮液濃度為10-50mg/mL；硅烷化試劑與反應溶劑的比例為(30-60)mmol：1L；堿性條件可以采用質(zhì)量分數(shù)為25-28％的濃氨水等弱堿性溶液實現(xiàn)，其用量以pH為8～10為宜。

進一步地，所述步驟2)中，所述酶與緩沖溶液的比例為(10-150)mg：1mL。其中，所述緩沖溶液的pH為4.0-8.0，優(yōu)選20-100mmol的磷酸鹽緩沖溶液。

進一步地，所述步驟3)中，浸潤試劑為乙醇、甲醇等。

進一步地，所述步驟3)中，載體與脂肪酶溶液的比例為1g：(5-20)mL。

進一步地，所述步驟3)中，固定化反應的溫度15-37℃，反應時間0.5-3h，振搖速度150-200rpm。

進一步地，所述步驟3)中，固定化反應完成后還可以包括洗滌、分離、干燥等純化步驟。

本發(fā)明中所提及的洗滌均采用緩沖溶液和有機溶劑，緩沖溶液可以選擇pH 4.0-8.0的磷酸鹽緩沖溶液等，有機溶劑可以選自丙酮或異丙醇等；所提及的分離均可以采用離心分離，所提及到干燥均可以采用冷凍干燥。

本發(fā)明中所提及的反應溶劑均為丙酮、乙醇、甲醇、氯仿、二氯甲烷、正己烷、異辛烷等。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明所述的花粉載體具有安全性高、天然易得，表面呈多孔結(jié)構并含有豐富的基團，可為酶提供足夠的空間并易于表面修飾和/或磁性修飾，減少酶分子之間的聚集和使用中的泄露，從而提高酶的穩(wěn)定性與催化活性；

2、本發(fā)明所述固定化酶的制備過程綠色環(huán)保，成本低廉；所制備的固定化酶穩(wěn)定性強，催化活性高(酯化率保持80％以上)，反復使用性能好的特點。

3、本發(fā)明制備的以花粉為載體的固定化酶應用范圍較廣，可以分別催化脂肪酸和植物甾醇的酯化反應、甘油三酯與植物甾醇的轉(zhuǎn)酯化反應、手性化合物的拆分、改性功能磷脂的合成、水解蛋白質(zhì)和分解果膠質(zhì)等，可滿足生產(chǎn)不同產(chǎn)品的需要，制得的產(chǎn)品具有綠色、安全、品質(zhì)高的特點。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不僅僅局限于下面的實施例。

實施例1

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

1)花粉的預處理(花粉先經(jīng)過有機試劑預處理，以除去雜質(zhì))：取10g油菜花粉加入50mL丙酮中，于25℃下浸泡時間0.5h，浸泡完畢后，除去丙酮并冷凍干燥，得到預處理后的花粉；

2)花粉的磁性吸附改性：取20g磁性四氧化三鐵納米顆粒加入200mL丙酮中，超聲分散0.5h，得到磁性納米顆粒懸浮液；按預處理后的花粉和磁性納米顆粒質(zhì)量比為0.5:1，將預處理后的花粉10g加入磁性納米顆粒懸浮液中，于25℃恒溫振蕩器中震蕩1h，反應結(jié)束后，采用磁分離出顆粒狀物，顆粒狀物用20mmol、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液和丙酮交替清洗3次后，得到清洗后的顆粒狀物，冷凍干燥，得到磁性吸附改性的花粉顆粒；

3)酶在載體表面的固定化：按南極假絲酵母脂肪酶與pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液的比例為10mg：1mL，將南極假絲酵母脂肪酶加入到100mmol、pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，得到脂肪酶溶液；按磁性吸附改性的花粉顆粒與脂肪酶溶液的比例為1g：20mL，稱取3g磁性吸附改性的花粉顆粒浸潤后加入60mL酶溶液中抽真空5min，于恒溫振蕩器中進行酶的固定化，反應溫度15℃，振蕩器振搖速度150rpm，反應時間3h，反應結(jié)束后，經(jīng)100mmol、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液和丙酮各清洗3次，磁分離后冷凍干燥，得到以花粉為載體的固定化酶。

應用：脂肪酸和甾醇酯化合成甾醇酯：稱取β-谷甾醇2g，按α-亞麻酸與β-谷甾醇摩爾比為2：1稱取α-亞麻酸，1g以花粉為載體的固定化酶(實施例1)，2g分子篩，加入50mL異辛烷，置于55℃恒溫水浴中反應12h，振蕩速率為200rpm；反應完畢后離心除去固定化酶，減壓蒸出溶劑，酯化率為96.1％。其中，以花粉為載體的固定化酶回收后經(jīng)異辛烷清洗3次后，重復上述反應5次后，酯化率仍大于83％。

實施例2

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

1)花粉的預處理：取10g蜂花粉加入200mL甲醇中，于25℃下浸泡時間4h，浸泡完畢后，除去甲醇并冷凍干燥，得到預處理后的花粉；

2)花粉的磁性吸附改性：取2g磁性三氧化二鐵納米顆粒加入60mL丙酮中，超聲分散0.5h，得到磁性納米顆粒懸浮液；按預處理后的花粉和磁性納米顆粒質(zhì)量比為5:1，將預處理后的花粉10g加入磁性納米顆粒懸浮液中，于25℃恒溫振蕩器中震蕩1h，反應結(jié)束后，采用磁分離出顆粒狀物，顆粒狀物用50mmol、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液和丙酮交替清洗3次后，得到清洗后的顆粒狀物，冷凍干燥，得到磁性吸附改性的花粉顆粒；

3)酶在載體表面的固定化：按酶與pH 4.0的磷酸鹽緩沖溶液比例150mg：1mL，將洋蔥假單胞菌脂肪酶加入到20mmol、pH 4.0的磷酸鹽緩沖溶液中，得到脂肪酶溶液；稱取3g磁性吸附改性的花粉顆粒浸潤后加入15mL脂肪酶溶液中抽真空30min，于恒溫振蕩器中進行酶的固定化，反應溫度37℃，振蕩器振搖速度200rpm，反應時間0.5h，反應結(jié)束后，經(jīng)100mmol、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液和異丙醇各清洗3次，磁分離后冷凍干燥，得到以花粉為載體的固定化酶。

應用：苯乙醇手性拆分：稱取1-苯乙醇1.22g，按乙酸乙烯酯與1-苯乙醇摩爾比為4：1稱取乙酸乙烯酯，0.75g以花粉為載體的固定化酶(實施例2)，加入50mL異辛烷，置于50℃恒溫振蕩器中振蕩6h，振蕩速率為200rpm，反應完畢后離心除去固定化酶，減壓蒸出溶劑，苯乙醇轉(zhuǎn)化率為50％。該固定化酶回收后經(jīng)正己烷清洗3次后，重復上述反應10次后，轉(zhuǎn)化率仍維持在50％左右，重復使用性好。

實施例3

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

1)花粉的預處理：取10g玉米花粉加入100mL氯仿中，于37℃下浸泡時間1h，浸泡完畢后，除去氯仿并冷凍干燥，得到預處理后的花粉。

2)花粉的磁性吸附改性：取5g磁性鐵合金納米顆粒加入80mL二氯甲烷中，超聲分散0.5h，得到磁性納米顆粒懸浮液；按預處理后的花粉和磁性納米顆粒質(zhì)量比為2:1，將預處理后的花粉10g加入磁性納米顆粒懸浮液中，于37℃恒溫振蕩器中震蕩1h，反應結(jié)束后，采用磁分離出顆粒狀物，顆粒狀物用100mmol、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液和丙酮交替清洗3次后，得到清洗后的顆粒狀物，冷凍干燥，得到磁性吸附改性的花粉顆粒；

3)酶在載體表面的固定化：按磁性吸附改性的花粉顆粒與磷脂酶A、pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液的比例為1g：2mL：3mL，將磷脂酶A、乙醇浸潤后的磁性吸附改性的花粉顆粒加入到100mmol、pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液中抽真空，于恒溫振蕩器中進行酶的固定化，反應溫度37℃，振蕩器振搖速度200rpm，反應時間1h；反應結(jié)束后，經(jīng)100mmol、pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液和丙酮各清洗3次，磁分離后冷凍干燥，得到以花粉為載體的固定化酶。

應用：功能磷脂的合成：稱取大豆卵磷脂0.3g，按亞麻酸乙酯與大豆卵磷脂質(zhì)量比為5：1稱取亞麻酸乙酯，0.1g以花粉為載體的固定化酶(實施例3)，加入0.3mL去離子水，加入3mL正己烷，置于55℃恒溫振蕩器中振蕩6h，振蕩速率為200rpm，反應完畢后離心除去固定化酶，減壓蒸出溶劑，酯化率為88.2％。該固定化酶回收后經(jīng)正己烷清洗3次后，重復上述反應5次后，酯化率仍大于80％。

實施例4

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

1)花粉的預處理：取10g茶花粉加入100mL乙醇中，于37℃下浸泡時間1.5h，浸泡完畢后，除去乙醇并冷凍干燥，得到預處理后的花粉。

2)花粉的表面基團改性：將預處理后的花粉懸浮于正己烷中，得到濃度為10mg/mL的懸浮液；按硅烷化試劑異丁基三甲氧基硅烷、正己烷的比例為30mmol：1L，催化劑25％的濃氨水的用量為正己烷體積的3％，將硅烷化試劑和催化劑與上述懸浮液混合，得到混合物；

所得混合物在35℃，氮氣保護下機械攪拌反應10h，機械攪拌速度為200rpm；反應結(jié)束后，采用離心分離出顆粒狀物，顆粒狀物用緩沖試劑和有機試劑交替清洗3次后，冷凍干燥，得到表面基團改性的花粉顆粒；

3)酶在載體表面的固定化：按解脂假絲酵母脂肪酶與pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液的比例為100mg：1mL，將酶加入到100mmol、pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液中，得到脂肪酶溶液；稱取3g表面基團改性的花粉顆粒用乙醇浸潤后，加入到30mL脂肪酶溶液中抽真空，于恒溫振蕩器中進行酶的固定化，反應溫度37℃，振蕩器振搖速度200rpm，反應時間1h，反應結(jié)束后，經(jīng)100mmol、pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液清洗3次，磁分離后冷凍干燥，得到以花粉為載體的固定化酶。

應用：人乳脂替代品的合成：稱取三棕櫚酸甘油酯1g，按三棕櫚酸甘油酯與油酸摩爾比為1：6稱取油酸，0.6g以花粉為載體的固定化酶(實施例4)，加入0.6mL去離子水，加入30mL正己烷，置于55℃恒溫振蕩器中振蕩2h，振蕩速率為200rpm，反應完畢后離心除去固定化酶，減壓蒸出溶劑，酯化率為42.4％。該固定化酶回收后經(jīng)正己烷清洗3次后，重復上述反應5次后，酯化率仍大于35％。

實施例5

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

1)花粉的預處理：取10g槐花粉加入100mL正己烷中，于37℃下浸泡時間1.5h，浸泡完畢后，除去正己烷并冷凍干燥，得到預處理后的花粉。

2)花粉的表面基團改性：將預處理后的花粉懸浮于丙酮中，得到濃度為50mg/mL的懸浮液；按硅烷化試劑異丁基三乙氧基硅烷與丙酮比例為60mmol：1L，催化劑25％的濃氨水的用量為丙酮體積的8％，將硅烷化試劑和催化劑與上述懸浮液混合，得到混合物；所得混合物在65℃，氮氣保護下機械攪拌反應20h，機械攪拌速度為500rpm；反應結(jié)束后，采用離心分離出顆粒狀物，顆粒狀物用緩沖試劑和有機試劑交替清洗3次后，得到清洗后的顆粒狀物，冷凍干燥，得到表面基團改性的花粉顆粒；

表面基團改性花粉的磁性吸附改性：取2g磁性鐵合金納米顆粒加入80mL二氯甲烷中，超聲分散0.5h，得到磁性納米顆粒懸浮液；按預處理后的花粉和磁性納米顆粒質(zhì)量比為5:1，將預處理后的花粉10g加入磁性納米顆粒懸浮液中，于37℃恒溫振蕩器中震蕩1h，反應結(jié)束后，采用磁分離出顆粒狀物，顆粒狀物用100mmol、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液和丙酮交替清洗3次后，得到清洗后的顆粒狀物，冷凍干燥，得到磁性吸附改性的表面基團改性花粉顆粒；

3)酶在載體表面的固定化：按豬胰腺酶與pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液的比例為80mg：1mL，將酶加入到100mmol、pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液中，得到脂肪酶溶液；稱取3g表面基團改性的花粉顆粒用乙醇浸潤后加入30mL脂肪酶溶液中抽真空，于恒溫振蕩器中進行酶的固定化，反應溫度37℃，振蕩器振搖速度200rpm，反應時間1h，反應結(jié)束后，經(jīng)100mmol、pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液清洗3次，磁分離后冷凍干燥，得到以花粉為載體的固定化酶。

實施例6

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

1)花粉的預處理：取10g棗花粉加入120mL異辛烷中，于37℃下浸泡時間2h，浸泡完畢后，除去異辛烷并冷凍干燥，得到預處理后的花粉。

2)花粉的表面基團改性：將預處理后的花粉懸浮于二氯甲烷中，得到濃度為30mg/mL的懸浮液；按硅烷化試劑辛基三甲氧基硅烷與二氯甲烷比例為50mmol：1L，催化劑25％的濃氨水的用量為丙酮體積的5％，將硅烷化試劑和催化劑與上述懸浮液混合，得到混合物；

所得混合物在55℃，氮氣保護下機械攪拌反應15h，機械攪拌速度為300rpm；反應結(jié)束后，采用離心分離出顆粒狀物，顆粒狀物用緩沖試劑和有機試劑交替清洗3次后，得到清洗后的顆粒狀物，冷凍干燥，得到表面基團改性的花粉顆粒；

3)酶在載體表面的固定化：按皺褶假絲酵母脂肪酶與pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液的比例為50mg：1mL，將酶加入到100mmol、pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液中，得到脂肪酶溶液；稱取3g表面基團改性的花粉顆粒用乙醇浸潤后加入30mL脂肪酶溶液中抽真空，于恒溫振蕩器中進行酶的固定化，反應溫度37℃，振蕩器振搖速度200rpm，反應時間1h，反應結(jié)束后，經(jīng)100mmol、pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液清洗3次，磁分離后冷凍干燥，得到以花粉為載體的固定化酶。

實施例7

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

與實施例4基本相同，不同之處在于步驟(1)中茶花粉由松花粉替代；步驟(2)中異丁基三甲氧基硅烷由辛基三乙氧基硅烷替代；步驟(3)中解脂假絲酵母脂肪酶由米根酶替代。

實施例8

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

與實施例5基本相同，不同之處在于步驟(1)中槐花粉由西瓜花粉替代；步驟(2)中異丁基三乙氧基硅烷由巰丙基三甲氧基硅烷替代；步驟(3)中豬胰腺酶由胃蛋白酶替代。

實施例9

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

與實施例6基本相同，不同之處在于步驟(1)中棗花粉由菊花花粉替代；步驟(2)中辛基三甲氧基硅烷由巰丙基三乙氧基硅烷替代；步驟(3)中皺褶假絲酵母脂肪酶由胰蛋白酶替代。

實施例10

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

與實施例6基本相同，不同之處在于步驟(1)中棗花粉由蕎麥花粉替代；步驟(2)中辛基三甲氧基硅烷由氨丙基三甲氧基硅烷替代；步驟(3)中皺褶假絲酵母脂肪酶由組織蛋白酶替代。

實施例11

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

與實施例6基本相同，不同之處在于步驟(1)中棗花粉由荷花花粉替代；步驟(2)中辛基三甲氧基硅烷由氨丙基三甲氧基硅烷替代；步驟(3)中皺褶假絲酵母脂肪酶由木瓜蛋白酶替代。

實施例12

一種以花粉為載體的固定化酶的制備方法，它包括如下步驟：

與實施例6基本相同，不同之處在于步驟(1)中棗花粉由芝麻花粉替代；步驟(2)中辛基三甲氧基硅烷由氨丙基三乙氧基硅烷替代；步驟(3)中皺褶假絲酵母脂肪酶由果膠酶替代。

綜上所述，本發(fā)明所述花粉基固定化酶載體能有效提高酶的固定化穩(wěn)定性與催化活性，重復使用性好，其應用范圍非常廣泛，是一類具有應用前景的固定化酶載體；所制備的固定化酶穩(wěn)定性強，催化活性高(酯化率保持80％以上)，反復使用性能好(重復使用次數(shù)多，可達5次以上)的特點。

本發(fā)明所列舉的各原料(如脂肪酶的各具體原料)，以及本發(fā)明各原料的上下限、區(qū)間取值，以及工藝參數(shù)(如溫度、時間等)的上下限、區(qū)間取值都能實現(xiàn)本發(fā)明，在此不一一列舉實施例。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構思的前提下，還可以做出若干改進和變換，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。