玉米蛋白多肽產(chǎn)品的多頻超聲輔助海藻酸鈉固定化酶酶解制備方法，涉及玉米多肽產(chǎn)品的開發(fā)利用，屬于玉米精深加工技術領域。

背景技術：

作為世界三大糧食作物之一，玉米具有較高的單產(chǎn)量和較大的增產(chǎn)潛力。生產(chǎn)玉米淀粉是玉米的主要用途之一。玉米蛋白粉是濕磨法生產(chǎn)玉米淀粉過程中的主要副產(chǎn)物。但是研究報告發(fā)現(xiàn)，玉米蛋白粉缺乏賴氨酸、色氨酸等人體必需氨基酸，使得其營養(yǎng)價值不高，在食品工業(yè)中的難以發(fā)揮主要作用，造成了資源浪費、環(huán)境污染。因此，如何優(yōu)化資源、提高經(jīng)濟效益已成為當今玉米淀粉深加工副產(chǎn)物綜合利用炙手可熱的研究課題。

目前，酶水解法是制備玉米多肽的主要應用方法，但傳統(tǒng)的酶水解法存在酶無法重復利用，酶解時間較長，且蛋白轉化率、酶的利用率、產(chǎn)物的得率和活性較低等缺點。目前超聲輔助酶解技術作為替代傳統(tǒng)酶解技術的應用水平在不斷地提升，在玉米多肽制備方面已有應用。超聲波在酶解反應中的應用主要包括超聲波對蛋白原料預處理、超聲波對酶的作用以及在酶解反應過程中施加超聲處理三個方面。以上大都是單頻超聲的作用，近幾年脈沖、掃頻、雙頻等模式也漸漸被報道出來，如采用脈沖超聲處理黃粉蟲幼蟲水溶性蛋白，蛋白的二級結構中α-螺旋結構的含量降低，β-鏈及無規(guī)則卷曲的含量升高。掃頻超聲處理對玉米醇溶蛋白的特性有顯著改善。雙頻超聲預處理小麥面筋蛋白能加速蛋白水解過程，顯著提高水解度，水解產(chǎn)物的活性也隨之增加。對于復雜的玉米蛋白結構及其較強的疏水特性，上述幾種超聲模式很難取得理想的酶解促進效果和蛋白改性效果。同步多頻超聲是三支超聲探頭分別發(fā)出三種不同頻率的超聲波，且可以實現(xiàn)同步脈沖操作，通過變換超聲頻率組合可以滿足原料變化的需求，即超聲波能與原料的固有頻率產(chǎn)生最大程度的共振，充分發(fā)揮超聲波應有的作用效果，并且目前國內(nèi)外鮮有在酶解反應過程中施加同步多頻超聲處理的研究報道。此外，聯(lián)合固定化酶技術可以實現(xiàn)酶的重復利用，節(jié)省生產(chǎn)成本。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種同步多頻超聲和固定化酶聯(lián)合技術進行玉米蛋白酶解制備玉米多肽的方法，達到提高酶的利用率、回收的酶可重復利用、提高產(chǎn)品得率和品質(zhì)、降低生產(chǎn)成本的目的。

本發(fā)明所述的同步多頻超聲輔助固定化酶酶解制備玉米多肽的方法，按照下述步驟進行：

（1）制備海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶：將質(zhì)量分數(shù)為3%的海藻酸鈉溶液按3:1（體積比）與堿性蛋白酶（11000 U/mL）混合均勻，逐滴滴入質(zhì)量分數(shù)為3%的氯化鈣溶液（這兩個溶液的體積比是1:12.5）中，靜置硬化2 h后形成形狀均勻的海藻酸鈉微球。

（2）將一定濃度的玉米蛋白粉溶液（料液比3%~7%，質(zhì)量體積比）投入多頻超聲輔助酶解設備中，預熱玉米蛋白粉溶液溫度至30~60℃，調(diào)節(jié)pH至8.5，再按照1800 u/g加入步驟（1）的海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶，迅速進行多頻模式超聲處理，酶解時間60~480 min。

（3）酶解反應結束后，先過濾回收固定化堿性蛋白酶，再離心收集上清液，濃縮、冷凍干燥制得玉米多肽產(chǎn)品。

其中所述的多頻超聲模式為：三頻同步超聲處理，超聲功率密度30~150 W/L；超聲脈沖工作時間10 s；脈沖間歇時間5 s。

三頻同步超聲處理的超聲波頻率組合為：A：20/28/40 kHz、B：20/35/50 kHz或者C：20/40/60 kHz。

本發(fā)明的優(yōu)點：

采用同步多頻超聲波和固定化酶聯(lián)合技術對玉米蛋白進行酶解制備多肽產(chǎn)品，較常規(guī)酶解、單頻超聲輔助酶解、雙頻超聲輔助酶解方法相比，產(chǎn)品品質(zhì)更高，更好地達到提高多肽得率和活性的目的；固定化酶可回收，酶的重復利用率更高，更節(jié)約生產(chǎn)成本，為高附加值玉米多肽產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條可行之路。

附圖說明

圖1是超聲輔助酶解設備結構圖，其中1、2、3為超聲振板，4為盛液器，5為水浴鍋，6為溫度探頭，7為循環(huán)泵，8為電腦程序控制器，9、10、11為超聲控制器。

具體實施方式

在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的內(nèi)容相同。

本發(fā)明中以水解度來評價酶解效率，相對酶活力來評價酶的重復利用率，多肽濃度和ACE抑制率來評價玉米多肽產(chǎn)品品質(zhì)。水解度的測定采用pH-stat法；相對酶活力的測定按照國標“GBT 23527-2009 蛋白酶制劑”的方法，用酶解后固定化酶的活力數(shù)值與酶解前的比值表示；多肽濃度的測定采用Folin-酚比色法；人體中過多的血管緊張素轉化酶（ACE）是引起血壓升高的重要原因之一，因此本發(fā)明以多肽對ACE的抑制率評價其降血壓活性。ACE抑制率的測定采用高效液相色譜法，按照文獻“吳瓊英，馬海樂，駱琳等. 高效液相色譜法測定血管緊張素轉化酶抑制劑的活性[J]. 色譜, 2005, 23(1):79-81.”的方法進行，以馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）作為ACE催化的底物，研究其峰面積的變化，計算ACE抑制率。

圖1為本發(fā)明的超聲輔助酶解法采用的超聲輔助酶解設備，該設備配有一臺電腦程序控制器8，可設定超聲工作參數(shù)（超聲功率密度、頻率、脈沖工作時間、間歇時間和處理總時間）分別控制三個超聲控制器9、10、11，分別連接三支不同頻率的超聲振板1、2、3，可實現(xiàn)單一頻率/兩個頻率/三個頻率超聲波處理；將玉米蛋白粉溶液投入盛液器4中進行單頻/雙頻/多頻超聲輔助酶解試驗，啟動循環(huán)泵7對酶解液進行循環(huán)。通過水浴鍋5和溫度探頭6實現(xiàn)酶解液溫度的自動控制。

以海藻酸鈉為載體，制備海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶。先將一定量的堿性蛋白酶用pH 9.5硼酸緩沖液稀釋，稀釋至酶活大約為11000 U/mL，放置4℃冰箱中保存。然后稱取一定量的海藻酸鈉配成3%溶液，沸水加熱至完全溶解，放置室溫冷卻至38℃左右。再稱取一定量的無水氯化鈣配成3%的溶液，放置4℃冰箱保存。將配好的3%海藻酸鈉溶液按3:1（體積比）與堿性蛋白酶混合，充分攪拌均勻后，靜置一段時間使其中的氣泡跑出。用注射器抽取靜置后的混合物，從10~15 cm高度緩慢滴入盛有3%氯化鈣溶液（這兩個溶液的體積比是1:12.5）的燒杯中形成凝膠珠，同時使用電動攪拌器勻速攪拌，滴完后放入4℃冰箱中，進一步靜置硬化2 h，即可得到形狀均勻的海藻酸鈉微球。傾去氯化鈣溶液，除去漂浮的空化珠狀顆粒后，用適量去離子水洗滌2~3次，直至上清液中無酶，取出抽濾、晾干，即制備得到海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

對照例1：常規(guī)酶解

采用不加超聲的常規(guī)酶解法進行固定化酶酶解制備玉米多肽試驗。取125 g玉米粉，按料液比5%（質(zhì)量體積比）加2.5 L水溶解，加熱至60℃，調(diào)節(jié)pH至8.5，加酶量1800 U/g，酶解時間90 min。酶解結束后，先過濾回收固定化堿性蛋白酶，再4000 rpm離心15 min，取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到玉米多肽產(chǎn)品。玉米多肽產(chǎn)品的水解度為18.9%，多肽濃度為9.0 mg/mL，ACE抑制率為59.8%，相對酶活力為12.8%。

對照例2、3、4：單頻超聲輔助酶解

采用單頻超聲輔助固定化酶酶解制備玉米多肽試驗。取125 g玉米粉，按料液比5%（質(zhì)量體積比）加2.5 L水溶解，加熱至60℃，調(diào)節(jié)pH至8.5，加酶量1800 U/g。單頻超聲處理條件為：超聲頻率組合：20kHz單頻超聲（對照例2）、28kHz單頻超聲（對照例3）、40kHz單頻超聲（對照例4），超聲功率密度150 W/L，脈沖工作時間10 s，間歇時間5 s，處理時間90 min。酶解結束后，先過濾回收固定化堿性蛋白酶，再4000 rpm離心15 min，取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到玉米多肽產(chǎn)品。對照例2玉米多肽產(chǎn)品的水解度為19.2%，多肽濃度為9.0 mg/mL，ACE抑制率為60.0%，相對酶活力為12.5%。對照例3玉米多肽產(chǎn)品的水解度為19.1%，多肽濃度為9.2 mg/mL，ACE抑制率為62.0%，相對酶活力為13.0%。對照例4玉米多肽產(chǎn)品的水解度為19.4%，多肽濃度為9.1 mg/mL，ACE抑制率為61.0%，相對酶活力為12.3%。

對照例5、6、7：同步雙頻超聲輔助酶解

采用雙頻超聲輔助固定化酶酶解制備玉米多肽試驗。超聲頻率組合：20、28kHz同步雙頻超聲（對照例5）、20、40kHz同步雙頻超聲（對照例6）、28、40kHz同步雙頻超聲（對照例7），其他參數(shù)同單頻超聲輔助酶解試驗。對照例5玉米多肽產(chǎn)品的水解度為19.5%，多肽濃度為9.3 mg/mL，ACE抑制率為64.0%，相對酶活力為13.5%。對照例6玉米多肽產(chǎn)品的水解度為19.6%，多肽濃度為9.4 mg/mL，ACE抑制率為62.0%，相對酶活力為13.0%。對照例7玉米多肽產(chǎn)品的水解度為19.5%，多肽濃度為9.5 mg/mL，ACE抑制率為63.0%，相對酶活力為14.3%。

實施例1：

采用同步多頻超聲輔助固定化酶酶解制備玉米多肽試驗。取125 g玉米粉，按料液比5%（質(zhì)量體積比）加2.5 L水溶解，加熱至60℃，調(diào)節(jié)pH至8.5，加酶量1800 U/g。同步多頻超聲處理條件為：20、28、40 kHz三頻超聲同步工作、超聲功率密度150 W/L、脈沖工作時間10 s、間歇時間5 s、處理時間60 min。酶解結束后，先過濾回收固定化堿性蛋白酶，再4000 rpm離心15min，取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到玉米多肽產(chǎn)品，測得水解度為18.1%，多肽濃度為10.6 mg/mL，ACE抑制率為69.2%，相對酶活力為18.6%。

實施例2：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于采用20、35、50 kHz三頻超聲同步工作，玉米多肽產(chǎn)品的水解度為18.6%，多肽濃度為9.5 mg/mL，ACE抑制率為64.0%，相對酶活力為11.7%。

實施例3：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于采用20、40、60 kHz三頻超聲同步工作，玉米多肽產(chǎn)品的水解度為19.3%，多肽濃度為10.4 mg/mL，ACE抑制率為68.1%，相對酶活力為16.4%。

實施例4：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于其中超聲功率密度為30 W/L，玉米多肽產(chǎn)品的水解度為16.9%，多肽濃度為10.7，ACE抑制率為54.6%，相對酶活力為19.7%。

實施例5：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于其中超聲功率密度為150 W/L，玉米多肽產(chǎn)品的水解度為17.9%，多肽濃度為10.7，ACE抑制率為63.5%，相對酶活力為16.3%。

實施例6：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于其中料液比為3%（質(zhì)量體積比），玉米多肽產(chǎn)品的水解度為15.4%，多肽濃度為5.3 mg/mL，ACE抑制率為56.6%，相對酶活力為20.2%。

實施例7：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于其中料液比為7%（質(zhì)量體積比），玉米多肽產(chǎn)品的水解度為16.2%，多肽濃度為6.4mg/mL，ACE抑制率為66.0%，相對酶活力為22.3%。

實施例8：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于其中酶解溫度為30℃，玉米多肽產(chǎn)品的水解度為4.5%，多肽濃度為4.4 mg/mL，ACE抑制率為7.1%，相對酶活力為23.8%。

實施例9：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于其中酶解溫度為50℃，玉米多肽產(chǎn)品的水解度為6.8%，多肽濃度為4.8 mg/mL，ACE抑制率為10.3%，相對酶活力為6.7%。

實施例10：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于其中酶解時間為90 min，玉米多肽產(chǎn)品的水解度為21.6%，多肽濃度為10.2 mg/mL，ACE抑制率為75.8%，相對酶活力為16.3%。

實施例11：

試驗處理過程同實施例1，其不同在于其中酶解時間為480 min，玉米多肽產(chǎn)品的水解度為29.5%，多肽濃度為12.9 mg/mL，ACE抑制率為71.9%，相對酶活力為10.3%。

對比實施例1、2、3可以看出，從超聲能耗、酶解效率、酶的重復利用率和產(chǎn)品品質(zhì)綜合考慮，20/28/40 kHz同步超聲優(yōu)于20/35/50 kHz和20/40/60 kHz同步超聲。

根據(jù)上述實驗結果得出，同步多頻超聲輔助固定化酶酶解制備玉米多肽（實施例10）與不加超聲的常規(guī)酶解（對照例1）相比，水解度提高了14.3%，多肽濃度提高了13.3%，ACE抑制率提高了26.8%，相對酶活力提高了27.3%，由此得出，從酶解效率、酶的重復利用率以及多肽產(chǎn)品品質(zhì)來看，同步多頻超聲顯著優(yōu)于常規(guī)酶解。

與單頻超聲輔助酶解（對照例2、3、4）相比，水解度提高了11.3%~13.1%，多肽濃度提高了10.9%~13.3%，ACE抑制率提高了22.3%~26.8%，相對酶活力提高了25.4~32.5%，由此得出，從酶解效率、酶的重復利用率以及多肽產(chǎn)品品質(zhì)來看，同步多頻超聲顯著優(yōu)于單頻超聲。

與雙頻超聲輔助酶解（對照例5、6、7）相比，水解度提高了10.2%~10.8%，多肽濃度提高了7.4%~9.7%，ACE抑制率提高了18.4%~22.3%，相對酶活力提高了14.0%~25.4%，由此得出，從酶解效率、酶的重復利用率以及多肽產(chǎn)品品質(zhì)來看，同步多頻超聲顯著優(yōu)于同步雙頻超聲。