一種提高重組人源膠原蛋白生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高重組人源膠原蛋白生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝。

背景技術(shù)：

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)一類重要的蛋白質(zhì)，廣泛分布于皮膚、軟骨、血管等組織，參與細(xì)胞的遷移、分化和繁殖，對(duì)維護(hù)細(xì)胞、組織、器官的正常生理功能起著重要的作用，在食品、飼料、美容、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用普遍。目前，膠原蛋白原料主要通過酸、堿、加熱等物理化學(xué)方法處理如豬、牛等動(dòng)物皮膚、骨骼等組織后分離純化獲得。但是，上述方法得到的膠原蛋白成分復(fù)雜，水溶性差，并且由于來自動(dòng)物組織，存在病毒隱患，限制了膠原蛋白在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。

隨著DNA重組技術(shù)的迅速發(fā)展，各種宿主細(xì)胞被選為基因工程菌用于表達(dá)膠原蛋白。與傳統(tǒng)工藝相比，膠原蛋白的基因工程菌發(fā)酵工藝具有生產(chǎn)原料易得、環(huán)保、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在著發(fā)酵周期較長，生產(chǎn)效率較低等問題。中國專利201010602214.8公開了一種畢赤酵母表達(dá)重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，采用巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris C13為菌種，重組膠原蛋白表達(dá)量為5g/L，發(fā)酵周期99小時(shí)，發(fā)酵水平為0.051g/L·h，發(fā)酵周期雖短，但蛋白表達(dá)量和發(fā)酵水平過低。中國專利201110327865.5構(gòu)建了一種重組人源膠原蛋白的巴氏畢赤酵母基因工程菌，基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)得到重組人源膠原蛋白，發(fā)酵周期為136小時(shí)，蛋白表達(dá)量為16g/L，發(fā)酵水平為0.118g/L·h，蛋白表達(dá)量雖有提高，但是發(fā)酵周期過長，發(fā)酵水平較低。因此，進(jìn)一步地縮短發(fā)酵時(shí)間，提高蛋白表達(dá)量，進(jìn)而提高發(fā)酵水平，有利于膠原蛋白的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，能夠?yàn)楫a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提高重組人源膠原蛋白生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，通過在發(fā)酵過程中加入0.01g/L-10g/L的丙酮酸鈉，調(diào)節(jié)畢赤酵母菌的生長代謝速度，縮短了發(fā)酵周期，提高了重組人源膠原蛋白的表達(dá)量，進(jìn)一步提升了重組人源膠原蛋白的生產(chǎn)水平。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種提高重組人源膠原蛋白生產(chǎn)水平的發(fā)酵工藝，包括以下步驟：將畢赤酵母菌種液接種到滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)14～18小時(shí)后，開始補(bǔ)加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入丙酮酸鈉，其中丙酮酸鈉的加入量為0.01～10g/L。

本發(fā)明所述的畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5021，并在中國專利201110327865.5中充分公開。

優(yōu)選地，所述的丙酮酸鈉的加入量為0.1g/L～1g/L。

優(yōu)選的，所述的丙酮酸鈉的加入方式為流加。

本發(fā)明所述的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基采用現(xiàn)有配方，可以是：85％H₃PO₄6.6～26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O 0.3～1.175g/L，K₂SO₄ 4.5～18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。

本發(fā)明的發(fā)酵工藝中，畢赤酵母菌種液的接種量為8～12％，發(fā)酵溫度為28～30℃，氨水調(diào)節(jié)pH為5.0～5.2，溶氧不低于20％，甲醇誘導(dǎo)時(shí)間為90～120小時(shí)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的顯著效果如下：本發(fā)明在發(fā)酵過程中，選取在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段加入丙酮酸鈉，提高了重組人源膠原蛋白的生物合成速率，并且采用連續(xù)流加的方式，能夠進(jìn)一步提高重組人源膠原蛋白的生物合成速率，發(fā)酵時(shí)間縮短，同時(shí)重組人源膠原蛋白的表達(dá)量增加，發(fā)酵水平提高了20％以上，節(jié)約了生產(chǎn)成本，特別適用于重組人源膠原蛋白的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，能夠?yàn)楫a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來巨大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，采用的菌株為表達(dá)重組人源膠原蛋白的畢赤酵母，為巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，保藏編號(hào)為CGMCC NO.5021，保藏日期為2011年6月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

本發(fā)明所述的PTM1溶液參照Invitrogen公司的操作手冊(cè)，具體配方為：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO₄·H₂O 3.0g/L；NaMoO₄·2H₂O 0.2g/L；H₃BO₃ 0.02g/L；CoCl₂ 0.5g/L；ZnCl₂ 20.0g/L；FeSO₄·7H₂O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H₂SO₄ 5.0mL/L，用0.22μm的濾膜過濾除菌，室溫保存。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。

實(shí)施例1

發(fā)酵培養(yǎng)基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L。

將種子液按照10％的接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，初始攪拌轉(zhuǎn)速200rpm、罐壓0.05MPa，調(diào)節(jié)空氣流量和轉(zhuǎn)速使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為212g/L，停止補(bǔ)加甘油，此時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為16小時(shí)。甘油耗盡后開始流加甲醇，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，同時(shí)一次性加入丙酮酸鈉，加入量為0.01g/L發(fā)酵培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，誘導(dǎo)發(fā)酵96h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為16.0g/L，發(fā)酵周期112小時(shí)，發(fā)酵生產(chǎn)水平為0.143g/L·h，與對(duì)照組相比提高23.3％。

實(shí)施例2