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螯合淀粉樣蛋白β肽的人源化抗體的制作方法

文檔序號:1151357閱讀:317來源:國知局
專利名稱:螯合淀粉樣蛋白β肽的人源化抗體的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請要求對2000年2月24日申請的美國臨時申請60/184,601、2000年12月8日申請的60/254,465和2000年12月8日申請的60/254,498的優(yōu)先權(quán),所述每項臨時申請的內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中。
證據(jù)顯示Aβ能夠在腦和血液之間來回轉(zhuǎn)運(Ghersi-Egea,J-F.等,J.Neurochem.(1996)67880-883;Zlokovic,B.V.等,Biochem.Biophys.Res.Comm.(1993)671034-1040;Shibata M等,J.Clin.Invest.(2000)1061489-1499)。此外,斑內(nèi)的Aβ與腦和血液中的溶解性Aβ形成平衡(Kawarabayashi T等,J.Neurosci.(2001)372-381)。
如PCT申請US00/35681和美國序號09/153,130所述,CSF中Aβ肽的總循環(huán)水平在正常個體和傾向于呈現(xiàn)阿耳茨海默氏病的個體中相似,這兩份文獻都通過引用結(jié)合到本文中。然而,在患有阿耳茨海默氏病的個體中,平均Aβ42水平要更低(Nitsch,R.M.等,Ann.Neurol.(1995)37512-518)。已知Aβ42比Aβ40更易聚集,當(dāng)發(fā)生聚集時,隨后就出現(xiàn)不利后果,例如AB在淀粉樣斑中沉積、Aβ轉(zhuǎn)化成毒性溶解型、神經(jīng)細胞損傷和行為障礙如癡呆(Golde,T.E.等,Biochem.Biophys.Acta.(2000)1502172-187)。
在1999年6月10日公開的PCT公開號WO99/27944中,描述了誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以減少淀粉樣蛋白沉積的方法。該說明書假設(shè)全長聚集Aβ肽可能是有用的免疫原。給予與綿羊抗小鼠IgG綴合的Aβ片段(氨基酸13-28)并不導(dǎo)致大腦皮質(zhì)淀粉樣蛋白量發(fā)生變化,并且在接受Aβ13-28片段綴合物注射的動物中,僅有九分之一顯示Aβ40作用下的淋巴增殖。該申請還指出可以使用特異性結(jié)合Aβ肽的抗體作為治療劑。然而,這看起來是推測性的,因為支持數(shù)據(jù)反映涉及使用例如Aβ42主動免疫的方法。使用佐劑提供所述肽,并確定免疫形成的抗體滴度和Aβ肽及前體肽的水平。該出版物明顯提示為緩解阿耳茨海默氏病癥狀,必須減少Aβ斑,并且成功減少Aβ斑需要細胞介導(dǎo)的過程。
1999年11月25日公開的WO 99/60024涉及利用抗淀粉樣蛋白抗體去除淀粉樣蛋白的方法。然而根據(jù)陳述,該機制利用抗Aβ抗體結(jié)合預(yù)形成淀粉樣沉積(即淀粉樣斑)的能力,導(dǎo)致隨后局部小神經(jīng)膠質(zhì)細胞清除局部斑。沒有在體內(nèi)證明該機制。該出版物進一步陳述為有效對抗Aβ斑,抗AB抗體必需到達腦實質(zhì)并穿過血腦屏障。
在2000年12月7日公開了幾份涉及嘗試控制淀粉樣斑的PCT申請。WO 00/72880描述在阿耳茨海默氏病的轉(zhuǎn)基因鼠模型中,當(dāng)用Aβ肽的N末端片段以及結(jié)合它們的抗體進行治療時,在皮質(zhì)和海馬內(nèi)的淀粉樣斑顯著減少,而用綴合綿羊抗鼠IgG的Aβ13-28片段進行治療或用對抗所述13-28片段的抗體即抗體266進行治療時,則沒有這種情況。人們斷言所述N末端定向抗體在體外研究中穿過血腦屏障,并誘導(dǎo)對淀粉樣斑的吞噬作用。
WO 00/72876公開內(nèi)容事實上與WO 00/72880相同,涉及用淀粉樣蛋白原纖維成分本身進行免疫。
WO 00/77178描述設(shè)計用于催化β-淀粉樣蛋白水解的抗體,包括針對苯丙氨酸statine轉(zhuǎn)換化合物Cys-Aβ10-25、statine Phe19-Phe20和Cys-Aβ10-25statine Phe20-Ala21的混合物產(chǎn)生的抗體,以及針對在Phe19和Phe20之間具有還原性酰胺鍵的Aβ10-25產(chǎn)生的抗體。該文件提到螯合Aβ,但這是猜測,因為它沒有給出這種螯合的證據(jù)。此外,該文件沒有提供體內(nèi)證據(jù)證明給予抗體導(dǎo)致Aβ從中樞神經(jīng)系統(tǒng)流出、干擾斑形成、減少淀粉樣斑負荷、在所述抗體和組織樣品中的Aβ之間形成復(fù)合物、或影響認知。
已經(jīng)顯示Aβ代謝的一條途徑是從CNS轉(zhuǎn)運到血漿(Zlokovic,B.V.等,Proc.Natl.Acad.Sci(USA)(1996)934229-4234;Ghersi-Egea,J-F.等,J.Neurochem.(1996)67880-883)。此外,已經(jīng)顯示血漿中的Aβ能夠穿過血腦屏障并進入腦內(nèi)(Zlokovic,B.V.等,Biochem.Biophys.Res.Comm.(1993)671034-1040)。已經(jīng)顯示在阿耳茨海默氏病的APpV717F轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,給予某些多克隆和單克隆Aβ抗體降低淀粉樣斑內(nèi)的Aβ沉積(Bard,F(xiàn).等,Nature Med.(2000)6916-919);然而,據(jù)說這是由于某些抗Aβ抗體穿過血腦屏障,刺激小膠質(zhì)細胞吞噬淀粉樣斑。在Bard的試驗中,對來自體內(nèi)的腦切片的測定顯示加入的Aβ抗體與外源加入的小膠質(zhì)細胞一起誘導(dǎo)對Aβ的吞噬,導(dǎo)致除去Aβ沉積。
使用標(biāo)準化測試可以容易地檢測CSF和血液中溶解性Aβ40和Aβ42的水平,所述標(biāo)準化測試使用針對Aβ鏈上表位的抗體。在例如美國專利5,766,846、美國專利5,837,672和美國專利5,593,846中已經(jīng)詳細報道了所述測定。這些專利描述產(chǎn)生針對Aβ肽中心域的鼠單克隆抗體,據(jù)報道這些抗體在位置16和17周圍、包括位置16和17上具有表位。還描述了針對N-末端區(qū)的抗體。據(jù)稱幾種單克隆抗體與Aβ肽的位置13-28發(fā)生免疫反應(yīng);它們不結(jié)合代表位置17-28的肽,因此根據(jù)所引用的專利,這證明包括位置16-17(α-分泌酶位點)在內(nèi)的該區(qū)是這些抗體的靶。在已知結(jié)合Aβ氨基酸13到28的抗體中包括小鼠抗體266、4G8和1C2。
我們目前意外地發(fā)現(xiàn)對24月齡半合子轉(zhuǎn)基因小鼠(APPV717F)給予266抗體非常快速并且?guī)缀跬耆鼗謴?fù)認知(目標(biāo)記憶(obiectmemory))。然而,所述抗體并不具有本領(lǐng)域教導(dǎo)的有效治療下列疾病和病癥的抗體所需的特性阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征和其它涉及Aβ肽的病癥。更令我們驚奇的是,我們觀察到結(jié)合Aβ位置13到28之間的抗體(266和4G8)能夠螯合血液中結(jié)合的循環(huán)形式Aβ肽中的溶解型Aβ,并且外周給予抗體266導(dǎo)致相當(dāng)大量的Aβ肽從CNS快速流出到血漿。這導(dǎo)致溶解性Aβ的清除增加,防止斑淀粉樣形成,最驚人的是改善認知,甚至不一定降低Aβ淀粉樣斑負荷、穿過血腦屏障達到任何顯著的程度、修飾斑、激活細胞機制或以強親和力與聚集的Aβ結(jié)合。
本發(fā)明的公開本發(fā)明提供人源化抗體或其片段,所述抗體或其片段積極地影響涉及Aβ的疾病和病癥中的認知,所述疾病和病癥如臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征以及臨床或臨床前腦淀粉樣血管病。所述抗體或其片段不必穿過血腦屏障、修飾淀粉樣斑、激活細胞反應(yīng)或甚至不必降低淀粉樣斑負荷。另一方面,本發(fā)明提供提供人源化抗體及其片段,所述抗體或其片段螯合血液中結(jié)合的循環(huán)形式Aβ肽中的Aβ肽,改變?nèi)芙庑虯β和結(jié)合型Aβ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血漿中的清除。又一方面,本發(fā)明提供人源化抗體及其片段,其中所述人源化抗體特異性結(jié)合Aβ氨基酸13到28之間的表位。再一方面,本發(fā)明提供人源化抗體及其片段,其中CDR源自小鼠單克隆抗體266,并且其中所述抗體大致保留所述小鼠抗體的結(jié)合特性,具有與所述小鼠抗體在功能上等同的體外和體內(nèi)特性(序列SEQ ID NO1到SEQ ID NO6)。另一方面,本發(fā)明提供人源化抗體及其片段,其中所述可變區(qū)具有包括以下的序列來自小鼠抗體266的CDR和特異性人構(gòu)架序列(序列SEQ ID NO7-SEQ ID NO10),其中所述抗體大致保留所述小鼠抗體的結(jié)合特性,具有與所述小鼠抗體266在功能上等同的體外和體內(nèi)特性。再一方面,本發(fā)明提供人源化抗體及其片段,其中輕鏈是SEQ ID NO11,重鏈是SEQ ID NO12。
本發(fā)明的另一部分是編碼上文所公開的人源化抗體或其片段的多核苷酸序列、包含編碼所述人源化抗體或其片段的多核苷酸序列的載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞或摻入表達所述人源化抗體或其片段的多核苷酸的宿主細胞、本文所公開的人源化抗體及其片段的藥用制劑、以及制造和使用上述物質(zhì)的方法。
所述人源化抗體及其片段可用于螯合人體內(nèi)的Aβ;用于治療和預(yù)防特征在于腦內(nèi)有Aβ斑或Aβ毒性的疾病和病癥,例如人類阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征和腦淀粉樣血管??;用于診斷人體內(nèi)的這些疾病;以及用于確認人體是否會對使用針對Aβ的人類抗體的治療有反應(yīng)。
體內(nèi)給予合適的人源化抗體以螯合在生物學(xué)液體中循環(huán)的Aβ肽可用于預(yù)防性治療以及治療性治療涉及腦內(nèi)形成包含Aβ的彌散斑(diffuse Plaque)、神經(jīng)斑和腦血管斑的病癥。所述人源化抗體(包括其免疫反應(yīng)性片段)導(dǎo)致從大分子復(fù)合物中去除Aβ肽,所述大分子復(fù)合物在正常情況下涉及在體液和形成斑的位點或所述Aβ肽有毒性的位點之間轉(zhuǎn)運所述Aβ肽。此外,用所述抗體或其片段螯合血漿Aβ肽的作用象是一個“接受器(sink)”,有效螯合血漿區(qū)室中的溶解性Aβ肽,并誘導(dǎo)Aβ從中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的各位置進入血漿。通過螯合血液中的Aβ,增強從腦的凈流出,防止溶解性Aβ沉積在不溶性斑內(nèi),并防止溶解性Aβ在腦內(nèi)形成有毒性的溶解性種類。此外,斑內(nèi)的不溶性Aβ與溶解性Aβ形成平衡,通過血液中的螯合效應(yīng),可以從腦內(nèi)除去斑內(nèi)不溶性Aβ。用所述抗體螯合Aβ肽也增強從體內(nèi)去除所述Aβ肽,抑制溶解性Aβ在腦內(nèi)的毒性效應(yīng),并抑制不溶性Aβ發(fā)展并進一步積累成為斑內(nèi)的淀粉樣蛋白。用于本發(fā)明的抗體并不大量穿過血腦屏障(≤0.1%血漿水平)。此外,當(dāng)外周給予用于本發(fā)明的人源化抗體時,所述抗體不必在結(jié)合Aβ肽后或自由循環(huán)時在腦內(nèi)引發(fā)細胞免疫應(yīng)答以發(fā)揮它們的有益作用。此外,當(dāng)外周給予時,所述抗體不必可觀地結(jié)合腦內(nèi)聚集的Aβ肽以發(fā)揮它們的有益作用。
因此,一方面,本發(fā)明涉及治療和預(yù)防特征在于在人體內(nèi)形成包含β-淀粉樣蛋白的斑的病癥,該方法包括給予(最好是外周給予)需要所述治療的人治療有效量或預(yù)防有效量的人源化單克隆抗體或其免疫反應(yīng)性片段,所述抗體特異性結(jié)合Aβ肽的中心區(qū)。又一方面,本發(fā)明涉及抑制人體內(nèi)淀粉樣斑形成和清除人體內(nèi)淀粉樣斑的方法,所述方法包括給予需要所述抑制作用的人類個體有效量的人源化抗體,所述抗體螯合其血液循環(huán)形式中的Aβ肽,誘導(dǎo)Aβ肽流出腦,并改變血漿和腦中的Aβ清除。再一方面,本發(fā)明涉及所述人源化抗體(包括其免疫有效部分)以及制備它們的方法。
本發(fā)明還包括對診斷患有臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征或臨床或臨床前腦淀粉樣血管病的患者逆轉(zhuǎn)認知下降、改善認知、治療認知下降和預(yù)防認知下降的方法,所述方法包括給予所述個體有效量本發(fā)明的人源化抗體。
本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的人源化抗體生產(chǎn)藥物,包括延長所述抗體或抗體片段的重組序列在人體組織內(nèi)的表達,以治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征或大腦血管淀粉樣樣變性;以治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征或臨床或臨床前大腦血管淀粉樣樣變性的認知下降;或抑制淀粉樣斑的形成或抑制毒性溶解性Aβ在人體內(nèi)的效應(yīng)。
本發(fā)明涉及驚人的觀察結(jié)果在給予本發(fā)明抗體后短時間內(nèi),相當(dāng)大量的Aβ從中樞神經(jīng)系統(tǒng)流出到血液。因此,本發(fā)明包括評價方法,評價人類個體對于用結(jié)合Aβ或其片段的抗體治療的反應(yīng),該方法包括a)給予所述個體所述抗體或其片段;然后b)測量Aβ在所述個體血液中的濃度。
本發(fā)明還包括用結(jié)合Aβ或其片段的抗體治療人類個體的方法,該方法包括a)給予所述個體首次量的所述抗體或其片段;b)給予第一次劑量后3小時到2周內(nèi),測量Aβ在所述個體體內(nèi)的濃度;c)如果需要,根據(jù)步驟b)的結(jié)果計算抗體或其片段第二次的量,其中第二次的量與第一次的量相同或不同;然后d)給予第二次劑量的所述抗體或其片段。
本發(fā)明還包括評價方法,評價在人類個體中抗體結(jié)合Aβ或其片段以抑制或預(yù)防Aβ淀粉樣斑形成、減少Aβ淀粉樣斑、降低毒性溶解性Aβ的作用或治療與Aβ斑有關(guān)的病癥或疾病的效能,該方法包括a)獲取所述個體血漿或CSF的第一份樣品;b)測量第一份樣品中Aβ的基線濃度;c)給予所述個體所述抗體或其片段;d)給予所述抗體或其片段后3小時到2周,獲取所述個體血漿或CSF的第二份樣品;然后e)測量第二份樣品中Aβ的濃度;其中,效能與血液中結(jié)合所述抗體的Aβ的量以及CSF中Aβ的濃度有關(guān)。
附圖簡述

圖1顯示通過Mab 266用透析膜從人腦脊髓液回收Aβ肽的百分率與透析膜截止分子量的函數(shù)。
圖2顯示在注射200μg或600μg Mab 266后APPV717F轉(zhuǎn)基因小鼠血漿內(nèi)存在的AβTotal濃度與時間的函數(shù)。
圖3A顯示在用鹽水、小鼠IgG或Mab 266治療的APPV717F轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)內(nèi)Aβ肽沉積的量。圖3B顯示這些結(jié)果與親代來源的相關(guān)性。
圖4顯示用于從質(zhì)粒pVk-Hu266表達人源化266輕鏈的多核苷酸序列以及所表達的人源化266輕鏈的單氨基酸編碼(成熟時對應(yīng)于SEQ ID NO11)。
圖5顯示用于從質(zhì)粒pVg1-Hu266表達人源化266重鏈的多核苷酸序列和所表達的人源化266重鏈的單氨基酸編碼(成熟時對應(yīng)于SEQ ID NO12)。
圖6是pVk-Hu266的質(zhì)粒圖。
圖7是pVg1-Hu266的質(zhì)粒圖。
發(fā)明實施方式在人類生物學(xué)液體內(nèi)循環(huán)的Aβ肽代表染色體21編碼的前體蛋白的羧基末端區(qū)。根據(jù)體外實驗的結(jié)果,已經(jīng)報道Aβ肽在生理溶液內(nèi)溶解度很小,因為它包含一段疏水氨基酸,該段氨基酸構(gòu)成將其更長的前體錨定到細胞脂質(zhì)膜的區(qū)段的一部分。因此,并不奇怪循環(huán)Aβ肽通常與其它部分結(jié)合,防止其聚集。這導(dǎo)致難以檢測生物學(xué)液體中循環(huán)Aβ肽。
上面提到的專利文件(美國專利5,766,846、美國專利5,837,672和美國專利5,593,846)描述抗體制備,包括單克隆抗體,由于所述抗體針對克隆266,因此將其命名為克隆266,已經(jīng)顯示該抗體特異性結(jié)合包含Aβ肽氨基酸13-28的肽。本發(fā)明申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)合該區(qū)的抗體與結(jié)合Aβ氨基酸序列中其它位點的抗體不同,能夠非常有效地從大分子復(fù)合物中螯合溶解性Aβ肽。該螯合將實現(xiàn)Aβ肽從CNS的凈流出,改變其在CNS和血漿中的清除,降低其用于形成斑的有效性。因此,具有該特異性的抗體提供預(yù)防性治療和治療性治療與形成β-淀粉樣蛋白斑有關(guān)的病癥的機會,其中將所述抗體轉(zhuǎn)化為人源化形式以降低它們的免疫原性。如上文提到的,這些病癥包括臨床前和臨床阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征以及臨床前和臨床腦淀粉樣血管病。
本文所用的術(shù)語“治療”包括治療性治療(已知存在需要治療的病癥)、預(yù)防(即防止)或改善未來可能發(fā)生的病癥。
“結(jié)合Aβ肽中區(qū)的單克隆抗體”指結(jié)合氨基酸序列的單克隆抗體(Mab或Mabs),所述氨基酸序列代表Aβ位置13到28之間所包含的表位。不一定針對整個區(qū)。只要所述抗體結(jié)合該區(qū)內(nèi)的至少一個表位(例如,尤其是包括α分泌酶位點16-17或抗體266結(jié)合的位點),所述抗體就可以有效用于本發(fā)明的方法。
“抗體”本質(zhì)上指單克隆抗體或其免疫有效片段,例如其Fab、Fab′或F(ab′)2片段。在本文的一些地方,將特別強調(diào)片段;然而,應(yīng)當(dāng)知道不論是否特定指出是片段,術(shù)語“抗體”包括這樣的片段以及單鏈形式。只要所述蛋白保持特異性結(jié)合其既定靶的能力,在結(jié)合后螯合分離Aβ肽與其血液中的載體蛋白,它就在術(shù)語“抗體”的范圍內(nèi)。定義“抗體”還包括,例如,具有該特異性的抗體的單鏈形式,該形式一般情況下名為FV區(qū)。用于本發(fā)明的抗體最好但不一定是重組產(chǎn)生,因為需要操作具有合適特異性的抗體,所述抗體一般情況下是小鼠抗體或其它非人類抗體,將它們轉(zhuǎn)化為人源化形式??贵w可以是糖基化的或未糖基化的,而優(yōu)選糖基化抗體。眾所周知,抗體通過二硫鍵適當(dāng)交聯(lián)。
已知基本抗體結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成,每對鏈包含一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括一個約100到110個氨基酸或更長的可變區(qū),該可變區(qū)負責(zé)抗原識別。每條鏈的羧基末端部分定義一個恒定區(qū),該區(qū)主要負責(zé)效應(yīng)子功能。
輕鏈分為γ、μ、α和λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε,分別將抗體同種型定義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi),可變區(qū)和恒定區(qū)通過一個約12個氨基酸或更長的“J”區(qū)連接,重鏈還包括一個約10多個氨基酸長的“D”區(qū)。
每個輕鏈/重鏈對的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點。因此,完整的抗體具有兩個結(jié)合位點。所有鏈都呈現(xiàn)同樣的通用結(jié)構(gòu),其中三個高變區(qū)連接相對保守的構(gòu)架區(qū)(FR),所述通用結(jié)構(gòu)也稱為互補決定區(qū)或CDR。所述構(gòu)架區(qū)使來自每一對兩條鏈的CDR平行排列,使其能夠結(jié)合特異性表位。從N末端到C末端,輕鏈和重鏈都包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照眾所周知的慣例劃分每個域的氨基酸[Kabat“具有免疫價值的蛋白質(zhì)序列”NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991;Chothia等,J. Mol.Biol.,196901-917(1987);Chothia等,Nature 342878-883(1989)]。
本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知,通過標(biāo)準技術(shù)可以容易地產(chǎn)生具有合適特異性的單克隆抗體接種哺乳動物,從所述哺乳動物的抗體生成細胞形成雜交瘤,或用其它方法使所述細胞無限增殖化,然后培養(yǎng)所述雜交瘤或無限增殖化細胞,評價它們的合適特異性。在本發(fā)明的情況下,可以如下產(chǎn)生所述抗體例如,用代表一個表位的肽免疫人、兔、大鼠或小鼠,所述表位包括Aβ肽的13-28區(qū)或其合適亞區(qū)。從產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤或其它細胞回收所述核苷酸序列,獲得用于重組操作的材料。然后操作這些核苷酸序列,以人源化形式提供它們。
“人源化抗體”指這樣的抗體通過改變具有非人類互補決定區(qū)(CDR)的抗體的序列,使所述抗體部分或全部由來自人抗體種系的氨基酸序列組成。最簡單的所述改變包括僅僅用人抗體的恒定區(qū)取代小鼠恒定區(qū),產(chǎn)生人/小鼠嵌合體,該嵌合體具有藥物應(yīng)用可接受的足夠低的免疫原性。然而,最好也用目前本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的技術(shù)人源化所述抗體的可變區(qū)甚至CDR。用對應(yīng)的人構(gòu)架區(qū)取代所述可變區(qū)的構(gòu)架區(qū),保持所述非人類CDR基本完整,或甚至用來自人類基因組的序列取代所述CDR。在遺傳改造小鼠體內(nèi)產(chǎn)生完全的人抗體,其中已經(jīng)改變所述小鼠的免疫系統(tǒng)使其對應(yīng)于人免疫系統(tǒng)。如上文所提到的,使用所述抗體的免疫特異性片段、包括代表單鏈形式的片段足以應(yīng)用于本發(fā)明方法。
人源化抗體還指這樣的抗體所述抗體包含人類構(gòu)架區(qū)、至少一個來自非人類抗體的CDR,其中存在的任何恒定區(qū)與人免疫球蛋白恒定區(qū)基本相同,即至少約85-90%相同,優(yōu)選至少95%相同。因此,人源化抗體的所有部分,可能除CDR外,都與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的對應(yīng)部分基本相同。例如,人源化免疫球蛋白一般不包括嵌合型小鼠可變區(qū)/人恒定區(qū)抗體。
當(dāng)用于人類治療時,人源化抗體與非人類和嵌合抗體相比至少有三個潛在的優(yōu)勢1)因為效應(yīng)部分來自人類,因此它可以與人類免疫系統(tǒng)的其它部分更好地相互作用(如通過依賴補體的細胞毒性(CDC)或依賴抗體的細胞毒性(ADCC)更有效地破壞靶細胞)。
2)人類免疫系統(tǒng)不會將所述人源化抗體的構(gòu)架區(qū)或C區(qū)識別為外源成分,因此針對所述注射抗體的抗體應(yīng)答應(yīng)該比針對完全外源的非人類抗體或部分外源的嵌合抗體的抗體應(yīng)答更小。
3)已經(jīng)報道注射非人類抗體在人體循環(huán)中的半壽期比人抗體的半壽期短得多。注射人源化抗體將具有與天然存在的人抗體基本相同的半壽期,使得可以使用更少和更低頻率的劑量。
可以如下設(shè)計人源化免疫球蛋白。當(dāng)氨基酸屬于下面類別時,用來自提供CDR的非人類免疫球蛋白(供體免疫球蛋白)的構(gòu)架氨基酸取代需要使用的人免疫球蛋白(接受者免疫球蛋白)的構(gòu)架氨基酸
(a)所述接受者免疫球蛋白人構(gòu)架區(qū)內(nèi)的氨基酸在該位置對于人免疫球蛋白是不常見的,而所述供體免疫球蛋白中的對應(yīng)氨基酸在該位置對于人免疫球蛋白是常見的;(b)所述氨基酸的位置緊接其中一個CDR;或(c)在三維免疫球蛋白模型中,構(gòu)架氨基酸中的任何側(cè)鏈原子與CDR氨基酸任一原子的距離在約5-6埃之內(nèi)(中心到中心)[Queen等,同前,和Co等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,2869(1991)]。當(dāng)所述接受者免疫球蛋白人構(gòu)架區(qū)內(nèi)的每一個氨基酸以及所述供體免疫球蛋白內(nèi)的對應(yīng)氨基酸在該位置對于人免疫球蛋白是不常見的,那么就用在該位置對于人免疫球蛋白是常見的氨基酸取代所述氨基酸。
優(yōu)選的人源化抗體是小鼠抗體266的人源化形式。人源化266的CDR具有如下氨基酸序列輕鏈CDR11 5 10 15Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His(SEQ ID NO1)輕鏈CDR21 5Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO2)輕鏈CDR315Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO3)重鏈CDR11 5Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO4)
重鏈CDR21 5 10 15Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQID NO5)和重鏈CDR31Gly Asp Tyr (SEQ ID NO6)本發(fā)明人源化抗體的優(yōu)選輕鏈可變區(qū)具有如下氨基酸序列,其中所述構(gòu)架來自人種系Vk區(qū)段DPK18和J區(qū)段Jk1,并且在同一人V亞組的共有氨基酸發(fā)生幾個氨基酸取代以減少潛在的免疫原性15 10 15Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa20 25 30Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa35 40 45Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe65 70 75Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp80 85 90Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val95 100 105Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa110Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys Arg (SEQ ID NO7)其中在位置2的Xaa是Val或Ile;在位置7的Xaa是Ser或Thr;在位置14的Xaa是Thr或Ser;在位置15的Xaa是Leu或Pro;
在位置30的Xaa是Ile或Val;在位置50的Xaa是Arg、Gln或Lys;在位置88的Xaa是Val或Leu;在位置105的Xaa是Gln或Gly;在位置108的Xaa是Lys或Arg;和在位置109的Xaa是Val或Leu。
本發(fā)明人源化抗體的優(yōu)選重鏈可變區(qū)具有如下氨基酸序列,其中所述構(gòu)架來自人種系VH區(qū)段DP53和J區(qū)段JH4,并且在同一人亞組的共有氨基酸發(fā)生幾個氨基酸取代以減少潛在的免疫原性1 5 10 15Xaa Val Gln Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly20 25 30Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser35 40 45Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Xaa Leu Val Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr65 70 75Pro Asp Xaa Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa80 85 90Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp95 100 105Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly110Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO8)其中在位置1的Xaa是Glu或Gln;在位置7的Xaa是Ser或Leu;在位置46的Xaa是Glu、Val、Asp或Ser;在位置63的Xaa是Thr或Ser;在位置75的Xaa是Ala、Ser、Val或Thr;在位置76的Xaa是Lys或Arg;
在位置89的Xaa是Glu或Asp;和在位置107的Xaa是Leu或Thr。
本發(fā)明人源化抗體尤其優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)具有如下氨基酸序列,其中所述構(gòu)架來自人種系Vk區(qū)段DPK18和J區(qū)段JKl,并且在同一人V亞組的共有氨基酸發(fā)生幾個氨基酸取代以減少潛在的免疫原性15 10 15Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu20 25 30Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu I1e35 40 45Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Aan Arg Phe65 70 75Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp80 85 90Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val95 100 105Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln110Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg(SEQ ID NO9)
本發(fā)明人源化抗體特別優(yōu)選的重鏈可變區(qū)具有如下氨基酸序列,其中所述構(gòu)架來自人種系VH區(qū)段DP53和J區(qū)段JH41 5 10 15Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly20 25 30Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser35 40 45Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Leu Val Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr65 70 75Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala80 85 90Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp95 100 105Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO10)
本發(fā)明人源化抗體優(yōu)選的輕鏈具有如下氨基酸序列1 5 10 15Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu20 25 30Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile35 40 45Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe65 70 75Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp80 85 90Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val95 100 105Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln110 115 120Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val125 130 135Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala140 145 150Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys155 160 165Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln170 175 180Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu185 190 195Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys200 205 210Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val215Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO11)本發(fā)明人源化抗體優(yōu)選的重鏈具有如下氨基酸序列1 5 10 15Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
20 25 30Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser35 40 45Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Leu Val Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr65 70 75Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala80 85 90Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Mer Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp95 100 105Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly110 115 120Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val125 130 135Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala140 145 150Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr155 160 165Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe170 175 180Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val185 190 195Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys200 205 210Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val215 220 225Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro230 235 240Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro245 250 255Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr260 265 270Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe275 280 285Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys290 295 300Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val305 310 315Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
320 325 330Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr335 340 345Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr350 355 360Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu365 370 375Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu380 385 390Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro395 400 405Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu410 415 420Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys425 430 435Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser440Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys (SEQ ID NO12)還有其它可能可以作為本發(fā)明人源化抗體和人源化266的輕鏈和重鏈的序列。所述免疫球蛋白具有兩對輕鏈/重鏈復(fù)合物,至少一條鏈包含與人構(gòu)架區(qū)段功能性連接的一個或多個互補決定區(qū)。
另一方面,本發(fā)明涉及編碼抗體的重組多核苷酸,當(dāng)所述抗體得到表達時,其包含本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈CDR。至于人構(gòu)架區(qū),將提供CDR的非人類免疫球蛋白構(gòu)架區(qū)或可變區(qū)氨基酸序列與人免疫球蛋白可變區(qū)序列集合中的對應(yīng)序列相比較,選擇相同氨基酸百分率高的序列。圖4和圖5給出代表性多核苷酸,當(dāng)所述多核苷酸表達時編碼包含單克隆抗體266重鏈和輕鏈CDR的多肽鏈。由于密碼子簡并性和非關(guān)鍵氨基酸取代,可以使用其它多核苷酸序列容易地取代那些序列。本發(fā)明尤其優(yōu)選的多核苷酸編碼抗體,當(dāng)所述抗體得到表達時,其包含SEQ ID NO1-SEQ ID NO6的CDR、或SEQID NO7-SEQ ID NO10的任何可變區(qū)、或SEQ ID NO11和SEQ IDNO12的輕鏈和重鏈。
所述多核苷酸一般還包括有效連接人源化免疫球蛋白編碼序列的表達控制多核苷酸序列,包括天然連接或異源的啟動子區(qū)。所述表達控制序列最好是處于能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng),但也可以使用針對原核宿主的控制序列。一旦將所述載體摻入合適的宿主細胞系,就在適于高水平表達所述核苷酸序列的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞,然后根據(jù)需要收集和純化輕鏈、重鏈、輕鏈/重鏈二聚體或完整抗體、結(jié)合片段或其它免疫球蛋白形式。
可以從多種不同多核苷酸(基因組或cDNA、RNA、合成寡核苷酸等等)和成分(如V、J、D和C區(qū)),并通過多種不同技術(shù)形成能夠最終表達所需人源化抗體的本發(fā)明核苷酸序列。連接合適的基因組序列和合成序列是生產(chǎn)的通用方法,但也可以利用cDNA序列。
可以按照眾所周知的程序,從多種人類細胞(優(yōu)選無限增殖化的B細胞)分離人恒定區(qū)DNA序列。相似地,可以從能夠結(jié)合Aβ肽氨基酸13到28之間表位的非人類單克隆抗體獲得用于生產(chǎn)本發(fā)明免疫球蛋白的CDR,所述單克隆抗體如上文所述,通過眾所周知的方法在任何方便的哺乳動物來源中生產(chǎn),包括小鼠、大鼠、兔或能夠產(chǎn)生抗體的其它脊椎動物。可以從本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的多種來源獲取適合所述多核苷酸序列的來源細胞以及用于表達和分泌免疫球蛋白的宿主細胞。
除本文專門描述的人源化免疫球蛋白外,利用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的各種重組DNA技術(shù)可以容易地設(shè)計和生產(chǎn)其它“基本同源”的修飾免疫球蛋白。例如,所述構(gòu)架區(qū)可能因為幾個氨基酸取代、末端和中間添加和缺失等等,在一級結(jié)構(gòu)水平上與天然序列有所不同。此外,可以單獨使用或組合使用多種不同的人構(gòu)架區(qū)作為本發(fā)明人源化免疫球蛋白的基礎(chǔ)。一般地說,通過各種眾所周知的技術(shù)可以容易地進行基因修飾,所述技術(shù)例如定點誘變。
或者,可以產(chǎn)生僅包含部分一級抗體結(jié)構(gòu)的多肽片段,所述片段具有一種或多種免疫球蛋白活性(如補體結(jié)合活性)。如下產(chǎn)生這些多肽片段通過本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法蛋白水解切割完整的抗體,或使用定點誘變在載體中所需位點插入終止密碼子,如在CH1后插入以產(chǎn)生Fab片段或在鉸鏈區(qū)后插入以產(chǎn)生F(ab′)2片段。通過用DNA接頭連接VL和VH,可以產(chǎn)生單鏈抗體。
如以前所述,當(dāng)將所述序列有效連接表達控制序列(即定位以保證表達控制序列發(fā)揮作用)后,在宿主中表達所述編碼核苷酸序列。這些表達載體一般在宿主生物中或者作為附加體、或者作為宿主染色體DNA的整合部分復(fù)制。表達載體一般包含選擇標(biāo)記(如四環(huán)素或新霉素),以便可以檢測出那些受到所需DNA序列轉(zhuǎn)化的細胞。
大腸桿菌(E.coli)是尤其適用于克隆本發(fā)明多核苷酸的原核宿主。適用的其它微生物宿主包括桿菌,如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus),以及其它腸桿菌科,如沙門氏菌屬、沙雷菌屬(Serratia)和各種假單胞菌屬菌。也可以制造在這些原核宿主中的表達載體,所述表達載體一般將包含適合所述宿主細胞的表達控制序列(如復(fù)制原點)。此外,可以利用多種眾所周知的啟動子中的任何一種,例如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)或來自λ噬菌體的啟動子系統(tǒng)。所述啟動子一般控制表達,可選地與操縱基因一起控制表達,并且具有核糖體結(jié)合位點序列等等,以起始和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。
其它微生物如酵母也可用于表達。酵母屬是優(yōu)選宿主,根據(jù)需要,合適的載體具有表達控制序列,如啟動子(包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶)和復(fù)制原點、終止序列等等(根據(jù)需要)。
除微生物外,也可使用哺乳動物組織細胞培養(yǎng)物表達和產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。事實上優(yōu)選真核細胞,因為本領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)展出多種能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系,包括CHO細胞系、各種COS細胞系、金黃倉鼠卵巢細胞系、HeLa細胞,最好是骨髓瘤細胞系、轉(zhuǎn)化B細胞、人胚胎腎細胞系或雜交瘤。用于這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列,例如復(fù)制原點、啟動子、增強子和必需的加工信息位點如核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達控制序列是來自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等等的啟動子。
可以通過眾所周知的方法將包含目標(biāo)核苷酸序列(如重鏈和輕鏈編碼序列以及表達控制序列)的載體轉(zhuǎn)移進宿主細胞,所使用的方法根據(jù)細胞宿主類型而不同。例如,氯化鈣轉(zhuǎn)染一般用于原核細胞,而磷酸鈣處理或電穿孔可用于其它細胞宿主。
一旦表達本發(fā)明的完整抗體、其二聚體、各個輕鏈和重鏈或其它免疫球蛋白形式后,就可以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準程序純化它們,所述程序包括硫酸銨沉淀、離子交換、親和層析、反相層析、疏水相互作用柱層析、凝膠電泳等等。對于藥物應(yīng)用,優(yōu)選具有至少約90到95%同質(zhì)性的基本純免疫球蛋白、最優(yōu)選具有98到99%或更高同質(zhì)性。一旦根據(jù)需要部分純化所述多肽或純化所述多肽至同質(zhì)性后,可以如本文所述將所述多肽用于治療或預(yù)防。
使用標(biāo)準給藥技術(shù),將所述抗體(包括免疫反應(yīng)性片段)給予表現(xiàn)Aβ相關(guān)癥狀或疾病或受到所述癥狀或疾病威脅的個體,所述癥狀或疾病例如臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征、或臨床或臨床前淀粉樣血管病,所述標(biāo)準給藥技術(shù)最好是通過靜脈內(nèi)給予、腹膜內(nèi)給予、皮下給予、肺部給予、經(jīng)皮給予、肌內(nèi)給予、鼻內(nèi)給予、口腔含化給藥法、舌下給予或栓劑給予(suppository administration)進行外周給藥(即不給予中樞神經(jīng)系統(tǒng))。雖然可以將所述抗體直接給予腦室系統(tǒng)、脊髓液或腦實質(zhì),并且對這些位置給藥的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的,但不必利用這些更困難的程序。當(dāng)通過依賴于外周循環(huán)系統(tǒng)的更簡單技術(shù)給予時,本發(fā)明抗體是有效的。本發(fā)明的優(yōu)點包括所述抗體能夠在甚至不直接提供給中樞神經(jīng)系統(tǒng)本身的情況下發(fā)揮其有益的效果。而本文確實已經(jīng)證明穿過血腦屏障的抗體量低于血漿水平的0.1%,而本發(fā)明抗體表現(xiàn)出能夠螯合外周循環(huán)中的Aβ,并且改變CNS和血漿中溶解性Aβ的清除。
設(shè)計用于給藥的藥用組合物,使其適于選定的給藥模式,合適地使用藥學(xué)上可接受的賦形劑如分散劑、緩沖劑、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等張劑、穩(wěn)定劑等等。Remington’s Pharmaceutical ScienceMack Publishing Co.,Easton PA,最新版,通過引用結(jié)合到本文中,提供醫(yī)師眾所周知的制劑技術(shù)綱要。改變本發(fā)明抗體的溶解度特性是特別有用的,例如通過將它們包囊在脂質(zhì)體中,或通過封閉極性基團而使它們更加親脂。
優(yōu)選通過靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射或皮下注射進行的外周系統(tǒng)性傳遞。用于所述注射劑的合適媒介是簡單的。然而,此外,可以采用鼻氣霧劑或栓劑的方法通過粘膜進行給藥。用于所述給藥模式的合適制劑是眾所周知的,所述制劑一般包括便利跨膜轉(zhuǎn)運的表面活性劑。所述表面活性劑常常是類固醇衍生物或者是陽離子脂類,例如N-[1-(2,3-二油?;?丙基-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)或各種化合物如半琥珀酸膽固醇酯、磷脂酰甘油等等。
制劑中人源化抗體的濃度低至約0.1%重量比,高至15或20%重量比,該濃度主要根據(jù)液體體積、粘度等等,按照選定的具體給藥模式選擇。因此,典型的注射用藥用組合物將包含1mL磷酸緩沖鹽水的無菌緩沖水和1-100mg本發(fā)明人源化抗體。制造所述制劑后,無菌過濾,或用其它方法處理使其在微生物學(xué)上可接受。典型的用于靜脈內(nèi)輸注的組合物可包括高至250mL液體體積,如無菌Ringer氏溶液,以及1-100mg/mL或更高的抗體濃度。
本發(fā)明的治療劑可以冷凍或凍干保存,然后使用前用合適的無菌載體重建。凍干和重建會導(dǎo)致不同程度的抗體活性喪失(如對于常規(guī)免疫球蛋白,IgM抗體的活性喪失比IgG抗體更嚴重)。可能需要調(diào)整劑量以進行補償。選擇所述制劑的pH以平衡抗體穩(wěn)定性(化學(xué)和物理穩(wěn)定性)并使其在給予患者時更舒服。一般地說,4到8之間的pH是可以接受的。
雖然前述方法看起來對于給予蛋白如人源化抗體是最方便和最合適的,但其它給藥技術(shù)(如經(jīng)皮給藥和口服給藥)經(jīng)過改進后,只要設(shè)計合適的制劑,也可以使用。
此外,比較理想的是采用控釋制劑,所述控釋制劑使用生物可降解膜和基質(zhì)、或滲透性微型泵、或基于葡聚糖珠、藻酸鹽或膠原蛋白的傳遞系統(tǒng)。
總的來說,可以獲得用于給予本發(fā)明抗體的制劑,所述制劑是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的,可以從多種選擇中選出合適的制劑。
可以使用標(biāo)準臨床技術(shù)最優(yōu)化一般劑量水平,并且一般劑量水平取決于給藥模式和患者的狀況。
下面的實施例將舉例說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
其中下文的實施例使用名為“266”的小鼠單克隆抗體,該抗體最初通過用包含人Aβ肽殘基13-28的肽接種而制備。已經(jīng)證實該抗體與所述肽發(fā)生免疫反應(yīng),但以前報道該抗體不與僅包含人Aβ肽殘基17-28的肽、或在所述Aβ肽內(nèi)其它任何表位上反應(yīng)。美國專利5,766,846描述了該抗體的制備,通過引用結(jié)合到本文中。由于本文的實施例描述在小鼠系統(tǒng)內(nèi)進行的實驗,使用小鼠單克隆抗體是令人滿意的。然而,在本發(fā)明應(yīng)用于人類的治療方法中,優(yōu)選具有對應(yīng)于抗體266的免疫特異性的人源化形式抗體。
實施例1螯合人類體液中加入的Aβ肽如下在室溫下溫育人腦脊髓液(CSF)樣品(50μl)和人血漿樣品1小時1.單獨溫育;2.與5ngAβ40肽一起溫育;或3.5ngAβ40肽和1mg單克隆抗體266(在例如美國專利5,766,846中描述,通過引用結(jié)合到本文中)。
所述樣品隨后在4-25%非變性梯度膠上電泳(即非變性梯度電泳(NDGGE)),然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。所述印跡隨后用Ponceau S染色或者用針對Aβ肽頭五個氨基酸的生物素標(biāo)記單克隆抗體(3D6)探測(蛋白質(zhì)印跡分析),用鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶顯象,然后通過增強化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測。根據(jù)Pharmacia分子量標(biāo)記估計所述印跡帶中所包含材料的水合直徑。因此,假如所述Aβ肽結(jié)合其它分子,它將按照所得復(fù)合物的大小遷移。
用或不用5ngAβ肽對CSF進行的蛋白質(zhì)印跡顯示沒有證據(jù)表明Aβ肽響應(yīng)由抗體3D6介導(dǎo)的檢測。對于人血漿獲得相似的結(jié)果。盡管對于同樣的CSF樣品,使用同樣技術(shù)通過SDS-PAGE以及隨后的蛋白質(zhì)印跡可以檢測到Aβ肽,但這是事實。大概是該肽與所檢測液體中其它因子的相互作用阻止對Aβ肽的檢測。然而,當(dāng)在溫育物中加入Mab266,代表與所述抗體復(fù)合的螯合Aβ肽的特征帶在血漿和CSF中同時存在。主要帶約11nm水合直徑,對應(yīng)于抗體單體,另有一個13nm的小帶,對應(yīng)于抗體二聚體。
實施例2螯合抗體的特異性使用含50μl人CSF或10μl APPV717FCSF的樣品。APPV717F是轉(zhuǎn)基因小鼠,代表阿耳茨海默氏病的小鼠模型,在該模型中表達帶有家族性阿耳茨海默氏病突變的人淀粉樣蛋白前體轉(zhuǎn)基因,從而導(dǎo)致在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生人Aβ肽。
如實施例1所述,將所述樣品在存在或不存在各種Mab(1μg)的情況下于室溫下溫育1小時,然后在4-25%NDGGE上電泳,隨后在硝酸纖維素上形成印跡。所述抗體如下Mab266(結(jié)合位置13-28);Mab4G8(結(jié)合位置17-24);QCBpan(針對位置1-40的兔多克隆抗體);
小鼠IgG(非特異性);Mab3D6(結(jié)合位置1-5);Mab21F12(結(jié)合位置33-42);Mab6E10(結(jié)合位置1-17);和QCB40,42(針對Aβ40和Aβ42的兔多克隆抗體)。
如實施例1所述檢測Aβ肽抗體復(fù)合物首先使用生物素標(biāo)記的3D6(針對Aβ肽N-末端),隨后使用鏈霉抗生物素蛋白-HRP和ECL。在人CSF中的相似檢測與Mab 266一起溫育,在某些情況下用結(jié)合Aβ肽羧基末端的QCB40,42取代3D6。
結(jié)果顯示在測試的抗體中,只有在Mab4G8和Mab266的情況下檢測到Aβ肽。
結(jié)果顯示對于人CSF,只有Mab266和Mab4G8能夠以可檢測到的量螯合抗體Aβ復(fù)合物(同樣,在沒有抗體存在的情況下,檢測不到Aβ)。Mab266也能夠?qū)τ谑褂萌薈SF、APPV717F轉(zhuǎn)基因小鼠CSF的實驗產(chǎn)生相似結(jié)果。不論是否使用3D6或QCB40,42抗體顯影蛋白質(zhì)印跡,使用Mab266都能夠螯合人CSF中的Aβ肽。
實施例3通過雙向電泳顯示Aβ肽-266復(fù)合物包含50ng Aβ40肽的樣品與2μg Mab266在37℃溫育3小時。對應(yīng)地單獨溫育Mab266作為對照。
然后對所述樣品進行雙向凝膠電泳。
在第一向,如實施例1所述對所溫育的樣品進行NDGGE。將聚丙烯酰胺凝膠以垂直于第一向的方向切成單獨的泳道,然后在變性/還原條件下,通過SDS-PAGE(Tricine尿素凝膠)在第二向進行凝膠分離。通過Ponceau-S染色(任何蛋白),或通過在基于HRP的檢測系統(tǒng)中使用6E10Mab(Senetek,Inc.)和生物素化抗小鼠Aβ進行特異性顯影,檢測帶的存在。
轉(zhuǎn)移后對硝酸纖維素印跡進行Ponceau-S染色,使Mab266的重鏈和輕鏈可見。經(jīng)證實,Aβ肽與Mab266形成復(fù)合物,表現(xiàn)為一條4kD的帶,該帶與第一向NDGGE后看到的全長Mab266的大小對齊。
實施例4證明在結(jié)合與螯合之間沒有對等性人們認為當(dāng)Aβ肽在血漿和CSF中循環(huán)時,它與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,所述蛋白質(zhì)包括載脂蛋白E。本實施例證明針對apoE的抗體雖然能夠結(jié)合所述復(fù)合物,但不能螯合分離apoE與所述復(fù)合物的其它部分。
將ApoE復(fù)合物(500ng)與針對apoE的Mab或多克隆抗體(2μg)在37℃溫育1小時。然后使用在實施例1中描述的技術(shù),對所溫育的樣品進行NDGGE。NDGGE后,用親和純化的山羊抗apoE抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析,通過ECL檢測。當(dāng)不存在抗體時,檢測到apoE處在8-13nm,該直徑與其以脂蛋白顆粒存在一致。針對apoE的單克隆抗體或多克隆抗體的存在導(dǎo)致apoE群體漂移到更大的分子,即“超級漂移(super shift)”。這證明針對apoE的抗體并不螯合分開apoE與脂蛋白顆粒(即從脂蛋白顆粒去除apoE),而是結(jié)合于脂蛋白上的apoE,產(chǎn)生更大的分子。
實施例5抗apoE抗體并不干擾對Aβ的螯合100μl人CSF樣品或者僅與Mab266、或者與多克隆抗apo-E、或者與這兩種抗體一起在37℃溫育60分鐘。隨后如實施例1所述通過NDGGE分析所述樣品,如實施例1所述檢測帶。
結(jié)果顯示只要Mab266加入所述樣品中,螯合的266-Aβ肽復(fù)合物約11nm直徑的特征帶是可見的。不論抗apoE存在與否,情況都是如此。在Mab266存在的情況下,假如在所述溫育混合物中加入50ngAβ肽,仍然出現(xiàn)代表受螯合Aβ的該帶。因此,抗apoE抗體的存在對apoE分子量的改變并不干擾Mab266螯合Aβ肽。
實施例6體內(nèi)螯合Aβ肽A.轉(zhuǎn)基因APPV717F小鼠也稱為PDAPP小鼠,該小鼠過度表達人APP蛋白的突變體形式。這些小鼠在CNS中產(chǎn)生人Aβ,在CSF和血漿中循環(huán)的人Aβ肽水平提高。對八月齡小鼠靜脈內(nèi)注射鹽水或100μg Mab266。所述小鼠在初次注射10分鐘后取血,初次注射20小時后再次取血。
如實施例1所述,通過NDGGE和使用抗體3D6的蛋白質(zhì)印跡,分析來自每只動物的20μl血漿樣品。注射鹽水的動物在10分鐘或20小時后都不顯示螯合Aβ肽特征性11nm帶的存在。然而,注射Mab266的兩只動物在20小時后確實顯示該帶的存在。
B.該研究使用兩月齡APPV717F小鼠。第0天,小鼠或者不接受Mab266、或者接受1mg Mab266、或者接受100μg該抗體。在給予所述抗體前兩天以及在第1、3、5和7天取血漿樣品。如實施例1所述,所述血漿樣品進行NDGGE,然后用3D6進行蛋白質(zhì)印跡分析和檢測。在給予Mab266后的所有時間點,除非血漿樣品已經(jīng)用蛋白G處理,否則都檢測到266/Aβ復(fù)合物,蛋白G結(jié)合免疫球蛋白,因此有效去除Mab266。復(fù)合物水平在測試時間內(nèi)保持穩(wěn)定,只是在注射100μg Mab266的動物中在第7天有輕微下降;一般地說,給予100μg該抗體的動物體內(nèi)的水平總是比給予1mg該抗體的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的水平低。
C.靜脈內(nèi)給予兩月齡APPV717F小鼠1mg Mab266,從每只小鼠取25μl血漿樣品。如上文所述對所述血漿樣品進行NDGGE,然后進行蛋白質(zhì)印跡分析,不同之處是生物素化3D6結(jié)合后用鏈霉抗生物素125I(Amersham)檢測,然后暴露于熒光成像屏。根據(jù)與標(biāo)準曲線的比較估計復(fù)合物水平,標(biāo)準曲線如下制備用已知量Aβ與飽和水平Mab266結(jié)合并相似檢測。據(jù)估計,結(jié)合Mab266的Aβ肽的量是約100ng/ml,比以前測定的這些小鼠中的內(nèi)源Aβ肽水平約100pg/ml增加約1000倍。這也與APPV717F腦中Aβ沉積前的Aβ肽水平(50-100ng/g)相似;APPV717FTg小鼠中的人APP和人Aβ幾乎僅在腦中產(chǎn)生。因此,看起來Mab266在血漿中的存在象是Aβ肽接受器,便利Aβ肽從CNS到血漿的凈流出。所述增加的凈流出可能是由于Aβ從CNS到血漿的流出增加,同時防止血漿中的Aβ再次進入腦。
如下確認螯合Aβ肽的正確大小APPV717F小鼠注射1mg Mab266后24小時獲得的20μL血漿樣品在TRIS-tricine SDS-PAGE凝膠上電泳,在使用結(jié)合蛋白G的珠暴露于蛋白G之前或之后,用抗Aβ抗體6E10進行蛋白質(zhì)印跡分析。檢測到蛋白G除去的帶位于4-8kD,與Aβ肽單體、可能有二聚體的存在一致。
D.用PBS(n=7)或者500μg生物素化Mab266(即m266B)(n=9)腹膜內(nèi)處理兩月齡APPV717F小鼠。在注射前和注射后24小時,使用Johnson-Wood,K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)941550-1555;和Bales,K.R.等,Nature Genet(1997)17263-264的ELISA方法的改進形式,分析血漿中的總Aβ肽。通過用m3D6包被的96孔Optiplate(Packard,Inc.)測量結(jié)合m266B的總Aβ。稀釋的血漿樣品和標(biāo)準品(各種濃度的Aβ40和m266B)在所述包被的板中溫育過夜,應(yīng)用125I-鏈霉抗生物素測定總Aβ/m266B復(fù)合物的量。此外,在24小時的時間點,首先用蛋白G處理血漿樣品以定量未結(jié)合Mab266的Aβ肽,然后通過ELISA測定CSF中的AβTotal和Aβ42。在注射PBS的動物中,注射前后血漿Aβ肽水平都是140pg/ml。注射Mab266的小鼠體內(nèi)血漿水平在注射前相似,但未結(jié)合Mab266的Aβ肽的水平在注射后24小時檢測不到。
還測量了CSF中的水平,CSF代表CNS內(nèi)的細胞外區(qū)室,CSF中的分子濃度在某種程度上反映腦內(nèi)細胞外空間中的物質(zhì)濃度。從小腦延髓池區(qū)室分離CSF。用戊巴比妥麻醉小鼠,取出從頭顱骨基部到第一椎骨的肌肉系統(tǒng)。如下收集CSF在解剖顯微鏡下,用微量針小心刺穿覆蓋延髓池的蛛網(wǎng)膜,吸取CSF到聚丙烯微量移液管中。注射24小時后,發(fā)現(xiàn)注射Mab266的小鼠的CSF中總Aβ肽增加,與注射PBS的小鼠相比,在CSF中獲得的Aβ42增加約兩倍。使用變性凝膠電泳以及隨后使用Aβ42特異性抗體21F12的蛋白質(zhì)印跡分析確認了這一點。
在另一個實驗中,三月齡APPV717FTg小鼠靜脈內(nèi)注射PBS或者Mab266,如下評價CSF中的Aβ40水平和Aβ42水平為測量Aβ40,使用特異性針對Aβ40的單克隆抗體m2G3。用125I-鏈霉抗生物素取代鏈霉抗生物素-HRP試劑,改變文獻所述ELISA方法(Johnson-Wood,K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)941550-1555)成為RIA。對于血漿樣品和CSF樣品,在緩沖液中缺乏胍的非變性條件下進行所述程序。為評價腦勻漿中碳酸鹽可溶和不溶性Aβ,樣品與100mM碳酸鹽,40mM NaCl,pH11.5(4℃)勻漿,10,000xg離心15分鐘,如文獻所述(Johnson-Wood,K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)941550-1555)和上文列出的程序,評價上清液(可溶)和沉淀(不溶性)中的Aβ。通過改良的RIA測量血漿中的Aβ/Mab266復(fù)合物。對小鼠注射生物素化Mab266(Mab266B),在多個時間點分離血漿。通過用m3D6包被的96孔Optiplate(Packard,Inc.)測量結(jié)合Mab266的總Aβ。稀釋的血漿樣品和標(biāo)準品(各種濃度的Aβ40和Mab266B)在所述包被的板中溫育過夜,應(yīng)用125I-鏈霉抗生物素測定總Aβ/Mab266B復(fù)合物的量。
靜脈內(nèi)注射Mab266三小時后,CSF中Aβ40水平增加兩倍,Aβ42沒有顯著增加。然而,在24小時和72小時,CSF中的Aβ40和Aβ42都增加兩到三倍。使用變性凝膠分析和隨后對匯集的CSF的Aβ蛋白質(zhì)印跡分析獲得相似結(jié)果。Aβ通過腦間隙液的流出(CSF水平在某種程度上反映出這種流出)可能引起所觀察到的CSF Aβ增加。
意義重大的是,CSF Aβ肽水平的變化并不是由于Mab266進入CSF引起的,因為在注射后24小時測量到的水平低于Mab266血漿水平的0.1%,不足以引起這些變化。這些結(jié)果提示抗體在血流中的存在引起Aβ肽流出腦實質(zhì),進入CSF。
在已經(jīng)注射Mab266并如上所述分析CSF的同一小鼠的腦皮質(zhì)勻漿內(nèi),測量可溶于PBS或碳酸鹽緩沖液的Aβ肽形式。觀察到在皮質(zhì)勻漿中這些溶解型的相似增加。
實施例7Mab266在體外作為Aβ肽接受器起作用構(gòu)建作為體外系統(tǒng)的透析室,測試Mab266作為Aβ肽接受器的能力。將1mL人CSF置于聚丙烯管的頂室內(nèi),該室由一塊特定截斷值為10-100kD的透析膜將其與底室分開,底室內(nèi)盛有含或不含1μg Mab266的75uL PBS。
在不同時間點將底室內(nèi)的物質(zhì)加載到酸尿素凝膠,然后用6E10針對Aβ肽進行蛋白質(zhì)印跡分析,看起來3小時后達到平衡。樣品在蟻酸中變性,達到80%(體積比)的終濃度,然后用β-巰基乙醇(1%)還原。樣品在0.9M乙酸電泳緩沖液內(nèi)電泳(陽極到陰極)通過4%-35%的聚丙烯酰胺梯度凝膠,所述梯度凝膠含6M尿素、5%(體積比)冰乙酸和2.5%TEMED。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素之前,中和凝膠的酸性PH。然后使用標(biāo)準蛋白質(zhì)印跡技術(shù)鑒定Aβ。檢測到的帶對應(yīng)于4kD。
3小時后,通過ELISA分析頂室和底室(n=4),由此確定從頂室移除的Aβ的量。圖1顯示存在和不存在Mab266的情況下,不同分子量截斷值獲得的結(jié)果。如圖顯示,雖然當(dāng)將PBS置于底室內(nèi)時僅有最小量的Aβ肽穿過膜,但當(dāng)存在Mab266、分子量截斷值是25kD的情況下,50%的Aβ肽在底室中受到螯合;當(dāng)分子量截斷值增加到100kD時穿過膜的量增加,吸引幾乎100%的Aβ肽穿過膜。
還觀察到抗N末端Aβ抗體3D6和10D5能夠在該系統(tǒng)中吸引Aβ肽穿過膜,雖然所述抗體不能在實施例1所述測定中螯合Aβ肽。這些結(jié)果顯示針對Aβ肽的抗體在這些條件下有足夠親和力螯合生理溶液中的所述肽,使其與其它結(jié)合蛋白質(zhì)分離,但對于位置13-28的表位有免疫反應(yīng)性的Mab如266實際上更有效、以更高親和力結(jié)合。
在相似的測定中,如DeMattos,R.B.等,J.Biol.Chem.(1998)2734206-4212;Sun,Y.等,J.Neurosci.(1998)183261-3272所述方法純化的星形細胞分泌的apoE4對于增加底室內(nèi)Aβ肽量有微小但在統(tǒng)計學(xué)上顯著的效應(yīng)。當(dāng)用多克隆IgG或BSA取代Mab266時,沒有觀察到明顯效應(yīng)。
實施例8Aβ肽從CNS流出到血漿A.將1μg Aβ40溶解于5μl小鼠CSF,保持其可溶,然后將其注射入野生型Swiss-Webster小鼠小腦延髓池的蛛網(wǎng)膜下腔,在此之前所述小鼠已經(jīng)接受PBS(n=3)或200μg生物素化Mab266(n=3)的靜脈內(nèi)注射。在處理后的不同時間點,通過Aβ ELISA測定小鼠血漿中的AβTotal,在Aβ ELISA中使用3D6作為包被抗體,并使用與過量生物素化266混合的Aβ標(biāo)準品。從每只動物取出血漿樣品后,將每份血漿樣品與過量生物素化266混合,以在ELISA中進行Aβ檢測。在注射PBS的小鼠中,30-60分鐘后檢測到0.15ng/ml水平的峰值,即最低限度可檢測量的肽,在此之后所述水平基本上是零。然而,在給予Mab266的小鼠中,60分鐘后血漿Aβ肽達到在注射PBS的小鼠中所檢測到水平的330倍水平(約50ng/ml),在180分鐘后達到約90ng/ml的值。
B.將200μg(n=3)或600μg(n=3)靜脈內(nèi)注射入兩月齡APPV717F小鼠,重復(fù)該程序。以上述劑量將Mab266靜脈內(nèi)注射入3月齡APPV717F+/+小鼠。在靜脈注射前和注射后的不同時間點,通過RIA測定結(jié)合Mab266的Aβ血漿濃度。圖2顯示來自一只有代表性的小鼠的詳細結(jié)果。
發(fā)現(xiàn)結(jié)合單克隆抗體Mab266的Aβ的濃度在4天內(nèi)從150pg/ml的基礎(chǔ)水平增加到超過100ng/ml的水平。通過分析該曲線上的早期時間點,確定在存在飽和水平所述抗體的情況下,APPV717FTg小鼠AβTotal進入血漿的凈速率是42pg/ml/分鐘。
Mab266在野生型和APPV717FTg小鼠體內(nèi)對血漿Aβ水平的效應(yīng)以及所述抗體對CSF中Aβ濃度的效應(yīng)顯示循環(huán)Mab266的存在改變CNS和血漿間Aβ流動或轉(zhuǎn)運平衡。
實施例9Mab266對腦中Aβ的效應(yīng)對四月齡APPV717F+/+小鼠腹膜內(nèi)注射鹽水、Mab266(500μg)或?qū)φ帐驣gG(100μg,Pharmigen),每2周處理一次,共進行5個月。在九月齡處死小鼠,測定皮質(zhì)中的Aβ沉積。如Holtzman,D.M.等,Ann.Neurol.(2000)972892-2897所述,在用兔淘選Aβ抗體(QCB,Inc.)覆蓋背海馬后,立即定量皮質(zhì)中所述抗體鑒定的呈現(xiàn)Aβ免疫反應(yīng)性的面積%。結(jié)果顯示于圖3A。在該鼠齡,每組約一半動物仍然沒有開始出現(xiàn)Aβ沉積。然而,在用266處理的組中,皮質(zhì)中帶有>50%Aβ的小鼠的%顯著更少(P=0.02,x2檢驗法)。雖然九月齡APPV717F小鼠出現(xiàn)大量Aβ沉積,但有很大可變性,約50%顯示沒有沉積,約50%顯示有大量沉積。在PBS和IgG處理的動物中,6/14和5/13小鼠有超過50%皮質(zhì)被Aβ染色覆蓋,而用Mab266處理的14只小鼠中僅有一只達到該染色水平。在9月齡時,所有組中幾乎50%的動物沒有發(fā)展出Aβ沉積。后者看起來是由于我們使用的實驗動物中各個小鼠的親本來源,因為即使研究的所有小鼠都證實是APPV717F+/+,但僅在從4/8育種對獲得的小鼠中觀察到高水平Aβ沉積(高病理幼仔)。來自其它4個育種對的小鼠看起來沒有Aβ沉積(低病理幼仔)。使用親本來源作為共變量,M266對于降低Aβ沉積有強烈、顯著的效應(yīng)(p=0.0082,圖3B)。
實施例10在APPV717FTg小鼠中外周注射Mab并不結(jié)合淀粉樣斑為確定在5個月內(nèi)腹膜內(nèi)注射的Mab266是否結(jié)合腦中的Aβ,利用來自包含Aβ沉積并且已經(jīng)用Mab266、鹽水或?qū)φ誌gG治療的9月齡APPV717F+/+Tg小鼠的腦切片。如文獻所述進行組織加工和免疫染色(Bales,K.R.等,Nature Genet.(1997)17263-264)。用熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG(Vector,Inc.)溫育來自所有組動物的組織,然后在熒光顯微鏡下檢查。在任何組中沒有觀察到Aβ沉積的特異性染色。與此相反,當(dāng)在用抗小鼠IgG溫育所述切片前應(yīng)用Mab266于所述切片,則可以清楚地檢測到Aβ沉積。
實施例11給予抗體266對于24月齡轉(zhuǎn)基因半合子PDAPP小鼠的認知的效應(yīng)使用16只半合子轉(zhuǎn)基因小鼠(APPV717F)。研究開始時所述小鼠約24月齡。所有注射都是腹膜內(nèi)注射(i.p.)。一半小鼠每周注射磷酸鹽緩沖液(PBS,“對照”),另一半接受溶解于PBS中的500微克小鼠抗體266。注射在7周(42天)內(nèi)進行,總共注射6次。最后一次注射后3天,基本如J.-C.Dodart等,Bahavioral Neuroscience,113(5)982-990(1999)所述,使用目標(biāo)認知任務(wù)評價動物行為。計算認知指數(shù)(TB×100)/(TB-TA)。結(jié)果顯示于下面表1。
表1.認知指數(shù)的統(tǒng)計學(xué)描述認知指數(shù)(分鐘)
**p=0.0010對24月齡半合子轉(zhuǎn)基因小鼠每周給予500微克抗體266與行為顯著變化有關(guān)。抗體處理的轉(zhuǎn)基因小鼠具有與野生型對照動物相似的認知指數(shù)[J.-C.Dodart等]。認知指數(shù)上的差異在0.001概率水平上具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。認知指數(shù)的增加表明用結(jié)合β淀粉樣蛋白肽氨基酸13-28區(qū)的抗體處理將逆轉(zhuǎn)在該阿耳茨海默氏病小鼠模型中記錄到的行為障礙。因此,給予結(jié)合β淀粉樣蛋白肽氨基酸13-28區(qū)的抗體將治療疾病如阿耳茨海默氏病和Down氏綜合征,并將阻止通常與疾病進程有關(guān)的認知下降。
如上所述,用小鼠抗體266處理7周的24月齡動物的腦海馬(包括扣帶區(qū)和頂皮質(zhì))覆蓋后,立即定量皮質(zhì)中的淀粉樣蛋白負荷(用抗Aβ抗體3D6或21F12染色后被免疫反應(yīng)性材料覆蓋的面積%)。結(jié)果顯示于下表。處理組間的差異在統(tǒng)計學(xué)上并不顯著。
表2.用小鼠266抗AB抗體處理后APPV717F+/-小鼠中的淀粉樣斑負荷淀粉樣斑負荷(%)
對于這些年齡非常大的動物,根據(jù)用3D6或21F12測量,用小鼠抗體266處理與PBS處理組相比并不導(dǎo)致顯著不同的淀粉樣負荷。此外,與更年輕的動物中的淀粉樣蛋白負荷相比,Aβ負荷確實更多并且顯著增加(見下文),所述更年輕的動物在目標(biāo)認知任務(wù)中不能分辨新對象與熟悉的對象。最驚人的是,這些結(jié)果證明抗Aβ抗體能夠逆轉(zhuǎn)認知缺陷,而不需降低淀粉樣負荷本身。
處理7周后,m266處理組的認知指數(shù)與24月齡野生型動物預(yù)期的認知指數(shù)沒有顯著不同!這指出在這些轉(zhuǎn)基因動物中完全逆轉(zhuǎn)認知下降。
實施例12給予抗體266對于年輕轉(zhuǎn)基因半合子PDAPP小鼠的認知的效應(yīng)使用五十四(54)只純合子轉(zhuǎn)基因小鼠(APPV717F)。二十三(23)只小鼠在研究開始時約二月齡。其余小鼠在研究開始時約四月齡。處理時間五個月。因此,在研究終止時,小鼠約七(7)個月齡或約九(9)個月齡。
所有注射都是腹膜內(nèi)注射(i.p.)。每只“PBS”對照組的小鼠每周接受磷酸鹽緩沖溶液注射(PBS;200μL)?!癐gG”對照組的每只小鼠每周接受IgG1κ1同種型對照注射(100μg/小鼠/周)。每只“高劑量”組的小鼠每周接受溶解于PBS中的500微克抗體266注射(“HD”)?!暗蛣┝拷M”中的每只小鼠每周接受溶解于PBS中的100微克抗體266注射(“LD”)。如上面實施例10所述,最后一次注射后三天,使用目標(biāo)識別任務(wù)評價動物行為,計算辨別指數(shù),辨別指數(shù)是花費在新對象上和花費在熟悉對象上的時間差異。結(jié)果顯示于下表3。結(jié)果按照研究結(jié)束時小鼠的年齡分組。
表3.辨別指數(shù)的統(tǒng)計學(xué)描述辨別指數(shù)(分鐘)
*p<0.05***p<0.0001將這些數(shù)據(jù)結(jié)合起來,支持這樣一個結(jié)論給予針對Aβ中間域的抗體266緩解7-9月齡APPV717F轉(zhuǎn)基因小鼠中的斑沉積,并逆轉(zhuǎn)以前特征鑒定的行為損害。用針對Aβ肽中間域的抗體治療患者將抑制或防止一般與疾病進程有關(guān)的認知下降,并逆轉(zhuǎn)所述認知下降。
受處理動物的辨別指數(shù)與同齡野生型小鼠預(yù)期的辨別指數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著不同。因此,就如在更老的動物中一樣(實施例10),用m266處理在這些更年輕的轉(zhuǎn)基因動物中完全逆轉(zhuǎn)認知下降。
實施例13合成人源化抗體266細胞和抗體。從ATCC(Manassas,VA)獲得小鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0,置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中,在含10%FBS(Cat # SH32661.03,HyClone,Logan,UT)的DME培養(yǎng)基中維持。小鼠266雜交瘤細胞首先在含10%FBS(HyClone),10mM HEPES,2mM谷氨酰胺,0.1mM非必需氨基酸,1mM丙酮酸鈉,25μg/ml慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后在含2%低Ig FBS(Cat # 30151.03,HyClone)的無血清培養(yǎng)基(Hybridoma SFM,Cat # 12045-076,Life Technologies,Rockville,MD)中擴展到滾瓶中的2.5升體積。使用蛋白G Sepharose柱,通過親和層析從所述培養(yǎng)物上清純化小鼠單克隆抗體266(Mu266)。使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-生物素(Cat # 21338ZZ,Pierce,Rockford,IL)制備生物素化Mu266。
克隆不同區(qū)cDNA。使用TRIzol試劑(Life Technologies)從約107雜交瘤細胞提取總RNA,使用PolyATract mRNA分離系統(tǒng)(Promega,Madison,WI),按照供應(yīng)商的方法分離poly(A)+RNA。使用SMARTTMRACE cDNA擴增試劑盒(Clontech,Palo Alto,CA),按照供應(yīng)商的方法合成雙鏈cDNA。使用分別與小鼠K鏈和r鏈恒定區(qū)退火的3′引物,以及在SMARTTMRACE cDNA擴增試劑盒中提供的5′通用引物,通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增輕鏈和重鏈的可變區(qū)cDNA。對于VLPCR,3′引物具有如下序列5′ -TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3′[SEQ ID NO13]其中殘基17-46與小鼠Ck區(qū)雜交。對于VH PCR,3′引物具有如下簡并序列AG T5′ - TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC-3′T[SEQ ID NO14]其中殘基17-50與小鼠γ鏈CH1雜交。將VL和VH cDNA亞克隆入pCR4Blunt-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA),進行序列測定。使用熒光雙脫氧鏈終止劑(Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA),按照廠家的指導(dǎo)通過PCR循環(huán)測序反應(yīng)進行DNA測序。在377型DNA測序儀(Applied Biosystems)上分析所述測序反應(yīng)。
構(gòu)建人源化266(Hu266)可變區(qū)。如Queen等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033(1988)]所述人源化小鼠抗體V區(qū)。根據(jù)序列同源性,選擇人V區(qū)構(gòu)架作為Mu266 CDR的受體。使用計算機程序ABMOD和ENCAD[Levitt,M.,J.Mol.Biol.168595-620(1983)]構(gòu)建可變區(qū)的分子模型。用Mu266的對應(yīng)殘基取代人源化V區(qū)中預(yù)期接觸CDR的氨基酸。取代重鏈殘基46、47、49和98,取代輕鏈殘基51。將人源化V區(qū)中在同一V區(qū)亞型內(nèi)稀有的氨基酸取代為共有氨基酸,消除可能的免疫原性。取代輕鏈殘基42和44。
使用長度從約65堿基到80堿基的八種重疊合成寡核苷酸,構(gòu)建和擴增輕鏈和重鏈可變區(qū)基因[He,X.Y.等,J.Immunol.160029-1035(1998)]。所述寡核苷酸成對退火,用DNA聚合酶I的Klenow片段延伸,產(chǎn)生四個雙鏈片段。變性所獲得的片段,成對退火,然后用Klenow延伸,產(chǎn)生兩個片段。變性這些片段,成對退火,再次延伸,產(chǎn)生全長基因。使用延伸高保真PCR系統(tǒng)(Roche MolecularBiochemicals,Indianapolis,IN),通過PCR擴增所得產(chǎn)物。所述PCR擴增片段通過凝膠純化并克隆進pCR4Blunt-TOPO載體。確認序列后,用MIu I和Xba I消化所述VL和VH基因,凝膠純化,分別亞克隆進用于表達輕鏈和重鏈的載體,產(chǎn)生pVk-Hu266和pVg1-Hu266(分別見本文的圖6和圖7)[Co,M.S.等,J.Immunol.1481149-1154(1992)]。從這些質(zhì)粒表達的成熟人源化266抗體具有SEQ ID NO11的輕鏈和SEQ ID NO12的重鏈。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。使用Gene Pulser儀器(BioRad,Hercules,CA),如所述(Co等,1992)應(yīng)用360V和25μF,通過電穿孔完成對小鼠骨髓瘤Sp2/0的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前,用Fsp I線性化pVk-Hu266和pVg1-Hu266質(zhì)粒DNA。用20μgpVk-Hu266和40μgpVg1-Hu266轉(zhuǎn)染約107Sp2/0細胞。將轉(zhuǎn)染細胞懸浮于含10%FBS的DME培養(yǎng)基,然后接種幾個96孔板。48小時后,應(yīng)用選擇培養(yǎng)基(含10%FBS,HT培養(yǎng)基補加劑,0.3mg/ml黃嘌呤和1μg/ml霉酚酸的DME培養(yǎng)基)。開始選擇后約10天,如下所述通過ELISA分析培養(yǎng)物上清中的抗體生成。高產(chǎn)量克隆在含10%FBS的DME培養(yǎng)基中擴增,然后進一步分析抗體表達。選定克隆然后在雜交瘤SFM中培養(yǎng)。
通過ELISA測量抗體表達。用100ul在0.2M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH9.4)中的1μg/ml山羊抗人IgG、Fcγ片段特異性多克隆抗體(Cat # 109-005-098,Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)包被96孔ELISA板(Nunc-Immuno板,Cat # 439454,NalgeNunc,Naperville,IL),在4℃過夜。用洗滌緩沖液(含0.1%Tween 20的PBS)洗孔后,用400μl Superblock封閉緩沖液(Cat # 37535,Pierce)封閉孔30分鐘,然后用洗滌緩沖液洗滌。用ELISA緩沖液(含1%BSA和0.1%Tween20的PBS)合適稀釋含Hu266的樣品,然后應(yīng)用于ELISA板(每孔100μl)。使用人源化抗CD33IgGl單克隆抗體HuM195(Co等,1992,見上文)作為標(biāo)準品。所述ELISA板在室溫下溫育2小時,然后用洗滌緩沖液洗孔。然后將100μl ELISA緩沖液中的1/1,1000稀釋HRP綴合山羊抗人κ多克隆抗體(Cat # 1050-05,Southern Biotechnology,Birmingham,AL)應(yīng)用于每個孔。每孔在室溫下溫育1小時并用洗滌緩沖液洗滌后,每孔中加入100μl ABTS底物(Cat # 507602和Cat #506502,Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)。在每孔中加入100μl2%草酸,終止顯色。使用OPTImax微量滴定板讀數(shù)器(Molecular Devices,Menlo Park,CA),在415nm讀出吸光度值。
純化Hu266。將其中一個高度表達Hu266的Sp2/0穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(克隆1D9)改為在雜交瘤SFM中培養(yǎng),然后擴展到滾瓶中的2升。當(dāng)細胞生存力達到10%或更低時,收獲用過的培養(yǎng)物上清,并加載到蛋白A Sepharose柱。用PBS洗滌該柱,然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5),0.1M NaCl洗脫抗體。洗脫蛋白對2升PBS透析,更換3次,然后過濾通過0.2μm濾膜,隨后于4℃貯存。通過在280nm處測量吸光度確定抗體濃度(1mg/ml=1.4A280)。根據(jù)標(biāo)準程序,在4-20%梯度膠(Cat # EC6025,Novex,San Diego,CA)上,在Tris-甘氨酸緩沖液中進行SDS-PAGE。減少純化的人源化266抗體,在SDS-PAGE凝膠上電泳。整個抗體顯示分子量約25kDa和50kDa的兩條帶。這些結(jié)果與根據(jù)氨基酸組成計算的輕鏈和重鏈或重鏈片段的分子量一致。
實施例14人源化266抗體的體外結(jié)合特性在一個比較ELISA中,比較小鼠266抗體(用生物素化小鼠266抗體)與如上所述合成并純化的人源化266抗體的結(jié)合效能。用100μl在0.2M碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液(pH9.4)中綴合BSA的β-淀粉樣蛋白肽(1-42)(10μg/ml)包被96孔ELISA板(Nunc-Immuno板,Cat # 439454,NalgeNunc),在4℃過夜。如下制備所述Aβ1-42-BSA綴合物將7.5mgAβ1-42-Cys43(C末端半胱氨酸Aβ1-42,AnaSpec)溶解于500μL二甲基亞砜,然后立即加入1,500μL蒸餾水。將兩(2)毫克馬來酰亞胺激活的牛血清白蛋白(Pierce)溶解于200μL蒸餾水。完全混合兩種溶液,在室溫下靜置兩(2)小時。使用凝膠層析柱將未反應(yīng)的肽與Aβ1-42-Cys-BSA綴合物分離開。
使用ELISA板洗滌器,用含0.1%Tween 20的磷酸鹽緩沖液(洗滌緩沖液)洗孔,然后每孔加入300μL Superblock試劑(Pierce)封閉孔。封閉30分鐘后,用洗滌緩沖液洗孔,除去多余液體。
一式三份,加入在ELISA緩沖液中生物素化Mu266(0.3μg/ml終濃度)和競爭抗體(Mu266或Hu266;開始終濃度為750μg/ml,順序3倍稀釋)的混合物,每孔達到100μl終體積。作為無競爭物的對照,加入100μl0.3μg/ml生物素化Mu266。作為背景對照,加入100μl ELISA緩沖液。所述ELISA板在室溫下溫育90分鐘。用洗滌緩沖液洗板后,每孔加入100μl1μg/ml HRP綴合鏈霉抗生物素(Cat #21124,Pierce)。所述板在室溫下溫育30分鐘,然后用洗滌緩沖液洗滌。為進行顯色,加入100μl/孔ABTS過氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Laboratories)。加入100μl/孔2%草酸,終止顯色。在415nm處讀出吸光度值。吸光度值針對競爭物濃度的對數(shù)作圖,使用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法,作符合數(shù)據(jù)點的曲線(使用Prism),并確定每種抗體的IC50。
小鼠266的平均IC50是4.7μg/ml(三個獨立實驗,標(biāo)準差=13μg/ml),人源化266的平均IC50是7.5μg/mL(三個獨立實驗,標(biāo)準差=1.1μg/ml)。如上所述進行第二組的三個實驗,測得小鼠266的平均IC50是3.87μg/mL(SD=0.12μg/mL),人266的平均IC50是4.0μg/mL(SD=0.5μg/mL)。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們得出結(jié)論人源化266具有與小鼠抗體266非常相似的結(jié)合特性。因此,我們預(yù)期人源化266具有與小鼠266非常相似的體外和體內(nèi)活性,并將在人體內(nèi)表現(xiàn)與小鼠266在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)的相同效應(yīng)。
實施例15小鼠抗體266和4G8的體外結(jié)合特性使用BIAcore生物傳感器2000測定抗體親和力(KD=Kd/Ka),用BIAevaluation(v.3.1)軟件分析數(shù)據(jù)。使用N-乙基-N-二甲基氨丙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS),將捕獲抗體(兔抗小鼠)通過游離氨基綴合到生物傳感器芯片(CM5)流動細胞2的羧基上。將非特異性兔IgG綴合到流動細胞1上,作為背景對照。單克隆抗體被捕獲,產(chǎn)生300共振單位(RU)。然后使淀粉樣蛋白β1-40或1-42(BiosourceInternational,Inc.)以遞減濃度(1000倍到0.1倍KD)流過所述芯片。為再生芯片,使用甘氨酸-HCl(pH2)洗滌,從所述芯片上洗脫結(jié)合的抗Aβ抗體。使用不含淀粉樣蛋白β的對照注射作為對照,以進行基線扣除。分析顯示結(jié)合相和解離相的傳感器克數(shù)(Sensorgram),確定Kd和Ka。使用該方法,發(fā)現(xiàn)小鼠抗體266對于Aβ1-40和對于Aβ1-42的親和力都是4pM。4G8對Aβ1-40的親和力是23nM,對Aβ1-42的親和力是24nM。盡管266和4G8對Aβ的親和力存在6000倍的差距,但它們都結(jié)合Aβ氨基酸13到28之間的表位,有效從人CSF中螯合Aβ。因此,在測定抗體螯合Aβ的能力以及提供本發(fā)明有利而驚人的益處時,極為重要的是表位的位置,而不是結(jié)合親和力。
實施例16使用Biacore方法和溶解性肽對小鼠抗體266的表位作圖BIAcore是測量分子相互作用的自動生物傳感器系統(tǒng)[Karlsson R.等,J.Immunol.Methods 145229-240(1991)]。BIAcore相對于其它結(jié)合測定的優(yōu)點是可以測量抗原結(jié)合而不必標(biāo)記或固定所述抗原(即所述抗原保持更接近天然的構(gòu)象)?;救缟衔膶嵤├?2所述,使用BIAcore方法評價各種淀粉樣蛋白β肽片段與小鼠抗體266的結(jié)合,不同之處是使用含Tween 20的HEPES緩沖鹽溶液進行所有稀釋,注射A□(BioSource International)的多種片段,并注射每種片段的單一濃度(440nM)。
淀粉樣蛋白β片段1-28、12-28、17-28和16-25結(jié)合小鼠抗體266,而Aβ片段1-20、10-20和22-35并不結(jié)合。片段1-20、10-20和22-35以對Aβ這些區(qū)已知的表位特異性結(jié)合其它Mab。使用該方法,小鼠抗體266的結(jié)合表位看起來是位于Aβ的氨基酸17到25之間。由于結(jié)合通常發(fā)生在所述表位的至少3個殘基,我們可以進一步推斷所述表位在殘基19-23之間。
實施例17人源化抗體266的體外結(jié)合特性基本如上文實施例15中所述,確定如上文合成和純化的人源化266抗體的親和力(KD=Kd/Ka)。使用該方法,發(fā)現(xiàn)人源化266對Aβ1-24的親和力是4pM。
權(quán)利要求
1.一種人源化抗體,它特異性結(jié)合Aβ的位置13-28包含的表位。
2.一種人源化抗體,它螯合血液中的結(jié)合循環(huán)型Aβ肽中的Aβ肽,并且改變?nèi)芙庑秃徒Y(jié)合型Aβ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血漿中的清除。
3.權(quán)利要求1或2的人源化抗體,所述抗體是人源化抗體本身。
4.權(quán)利要求1或2的人源化抗體,所述抗體是一種片段。
5.權(quán)利要求1或2的人源化抗體,所述抗體特異性結(jié)合具有Aβ位置17到25之間的氨基酸的表位,其中使用BIAcore方法確定所述表位位置。
6.權(quán)利要求1或2的人源化抗體,所述抗體特異性結(jié)合具有Aβ位置19到23之間的氨基酸的表位,其中使用BIAcore方法確定所述表位位置。
7.權(quán)利要求1或2的人源化抗體,所述抗體特異性結(jié)合抗體266特異性結(jié)合的Aβ表位。
8.權(quán)利要求1的人源化抗體,所述抗體特異性結(jié)合所述Aβ肽位置13-20包含的表位。
9.權(quán)利要求8的人源化抗體,所述抗體特異性結(jié)合包括所述Aβ肽位置16、17或18的表位。
10.權(quán)利要求1或2的人源化抗體,所述抗體是一種單鏈抗體。
11.權(quán)利要求1或2的人源化抗體,所述抗體包含人構(gòu)架區(qū)。
12.權(quán)利要求1或2的人源化抗體,所述抗體包含人源化CDR。
13.權(quán)利要求1或2的人源化抗體,所述抗體是人源化Mab266。
14.權(quán)利要求13的人源化抗體或其片段,所述抗體或其片段包含人源化輕鏈和人源化重鏈,其中所述輕鏈包含三個來自小鼠單克隆抗體266的輕鏈互補決定區(qū)(CDR)以及一個來自人免疫球蛋白輕鏈的輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列;所述重鏈包含三個來自小鼠單克隆抗體266的重鏈CDR和一個來自人免疫球蛋白重鏈的重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列;其中所述輕鏈CDR具有如下氨基酸序列輕鏈CDR11 5 10 15Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His(SEQ ID NO1)輕鏈CDR21 5Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO2)輕鏈CDR315Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO3);所述重鏈CDR具有如下氨基酸序列重鏈CDR11 5Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO4)重鏈CDR21 5 10 15Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQID NO5)重鏈CDR31Gly Asp Tyr (SEQ ID NO6)。
15.權(quán)利要求13的人源化抗體或其片段,所述抗體或其片段包含人源化輕鏈可變區(qū)以及包含重鏈可變區(qū),其中所述輕鏈可變區(qū)包含如下序列15 10 15Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa20 25 30Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa35 40 45Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe65 70 75Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp80 85 90Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val95 100 105Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa110Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys Arg(SEQ ID NO7)其中位置2的Xaa是Val或Ile;位置7的Xaa是Ser或Thr;位置14的Xaa是Thr或Ser;位置15的Xaa是Leu或Pro;位置30的Xaa是Ile或Val;位置50的Xaa是Arg、Gln或Lys;位置88的Xaa是Val或Leu;位置105的Xaa是Gln或Gly;位置108的Xaa是Lys或Arg;位置109的Xaa是Val或Leu;所述重鏈可變區(qū)包含如下序列15 10 15Xaa Val Gln Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly20 25 30Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser35 40 45Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Xaa Leu Val Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr65 70 75Pro Asp Xaa Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa80 85 90Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp95 100 105Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly110Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO8)其中位置1的Xaa是Glu或Gln;位置7的Xaa是Ser或Leu;位置46的Xaa是Glu、Val、Asp或Ser;位置63的Xaa是Thr或Ser;位置75的Xaa是Ala、Ser、Val或Thr;位置76的Xaa是Lys或Arg;位置89的Xaa是Glu或Asp;位置107的Xaa是Leu或Thr。
16.權(quán)利要求15的人源化抗體或其片段,所述抗體或其片段具有SEQ ID NO9給出序列的輕鏈可變區(qū)以及SEQ ID NO10給出的重鏈可變區(qū)。
17.權(quán)利要求16的人源化抗體或其片段,所述抗體或其片段具有SEQ ID NO11給出序列的輕鏈以及SEQ ID NO12給出序列的重鏈。
18.一種抗體片段,所述抗體片段可通過酶切權(quán)利要求1-17中任一項的人源化抗體獲得。
19.權(quán)利要求18的片段,所述片段是一種Fab或F(ab′)2片段。
20.權(quán)利要求19的片段,所述片段是一種F(ab')2片段。
21.權(quán)利要求19的片段,所述片段是一種Fab片段。
22.權(quán)利要求1-21中任一項的人源化抗體或片段,所述抗體或片段是IgGl免疫球蛋白同種型。
23.權(quán)利要求1-18中任一項的人源化抗體或片段,其中在選自以下的宿主細胞中產(chǎn)生所述抗體或其片段骨髓瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞、金黃倉鼠卵巢細胞和人胚腎細胞。
24.權(quán)利要求1-23中任一項的人源化抗體或片段,當(dāng)外周給予人類個體所述抗體或片段時,并不需要穿過所述個體的血腦屏障以實現(xiàn)其有益效應(yīng)。
25.權(quán)利要求1-23中任一項的人源化抗體或片段,當(dāng)外周給予人類個體所述抗體或片段時,并不需要在所述個體腦內(nèi)產(chǎn)生細胞應(yīng)答以實現(xiàn)其有益效應(yīng)。
26.權(quán)利要求1-23中任一項的人源化抗體或片段,當(dāng)外周給予人類個體所述抗體或片段時,并不需要直接結(jié)合所述個體腦內(nèi)聚集的Aβ。
27.權(quán)利要求1-23中任一項的人源化抗體或片段,當(dāng)外周給予人類個體所述抗體或片段時,并不需要顯著降低所述個體腦內(nèi)的Aβ斑負荷以實現(xiàn)其全部有益效應(yīng)。
28.一種核酸,所述核酸包含編碼權(quán)利要求1-27中任一項的人源化抗體或其片段的輕鏈或重鏈的序列。
29.一種或多種核酸,當(dāng)所述核酸在合適宿主細胞中表達時,產(chǎn)生權(quán)利要求1-27中任一項的抗體。
30.權(quán)利要求28的核酸,所述核酸包含編碼SEQ ID NO7或SEQID NO9所給出輕鏈可變區(qū)的序列。
31.權(quán)利要求28的核酸,所述核酸包含編碼SEQ ID NO8或SEQID NO10所給出重鏈可變區(qū)的序列。
32.權(quán)利要求28的核酸,所述核酸包含編碼SEQ ID NO11所給出輕鏈的序列。
33.權(quán)利要求28的核酸,所述核酸包含編碼SEQ ID NO12所給出重鏈的序列。
34.一種用于表達權(quán)利要求1-27中任一項的抗體或片段的表達載體,它包含編碼所述抗體或片段的核苷酸序列。
35.一種用權(quán)利要求34的表達載體轉(zhuǎn)染的細胞。
36.一種用兩種權(quán)利要求34的表達載體轉(zhuǎn)染的細胞,其中第一種載體包含編碼輕鏈的核苷酸序列,第二種載體包含編碼重鏈的核苷酸序列。
37.一種重組細胞,所述重組細胞產(chǎn)生權(quán)利要求13-17中任一項的人源化抗體或片段。
38.權(quán)利要求35-37中任一項的細胞,其中所述細胞選自骨髓瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞、金黃倉鼠卵巢細胞和人胚腎細胞。
39.一種藥用組合物,所述藥用組合物包含權(quán)利要求1-27中任一項的人源化抗體或片段和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
40.一種抑制人體內(nèi)淀粉樣斑形成或毒性溶解性Aβ物質(zhì)作用的方法,所述方法包括給予需要所述抑制作用的人類個體有效量的人源化抗體或其片段,所述人源化抗體或其片段特異性與Aβ位置13-28包含的表位發(fā)生免疫反應(yīng)。
41.一種降低人體內(nèi)淀粉樣斑或毒性溶解性Aβ物質(zhì)作用的方法,所述方法包括給予需要所述降低作用的人類個體有效量的人源化抗體或其片段,所述人源化抗體或其片段特異性與Aβ位置13-28包含的表位發(fā)生免疫反應(yīng)。
42.一種抑制人體內(nèi)淀粉樣斑形成或毒性溶解性Aβ作用的方法,所述方法包括給予需要所述抑制作用的人類個體有效量的人源化抗體或其片段,所述人源化抗體或其片段螯合血液中的結(jié)合循環(huán)型Aβ肽中的Aβ肽。
43.一種降低人體內(nèi)淀粉樣斑或毒性溶解性Aβ作用的方法,所述方法包括給予需要所述降低作用的人類個體有效量的人源化抗體或其片段,所述人源化抗體或其片段螯合血液中的結(jié)合循環(huán)型Aβ肽中Aβ肽。
44.權(quán)利要求40-43中任一項的方法,其中當(dāng)將所述抗體或片段外周給予人體時,并不需要穿過血腦屏障以抑制淀粉樣斑形成或毒性溶解性Aβ的效應(yīng)。
45.權(quán)利要求40-43中任一項的方法,其中當(dāng)將所述抗體或片段外周給予人體時,并不需要細胞應(yīng)答以抑制淀粉樣斑形成或毒性溶解性Aβ物質(zhì)的效應(yīng)。
46.權(quán)利要求40-43中任一項的方法,其中當(dāng)將所述抗體或片段外周給予人體時,并不直接結(jié)合腦中聚集的Aβ。
47.權(quán)利要求40-46中任一項的方法,其中所述個體經(jīng)診斷患有臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征、或臨床或臨床前腦淀粉樣血管病。
48.權(quán)利要求40-46中任一項的方法,其中所述個體經(jīng)診斷沒有患有臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征、或臨床或臨床前腦淀粉樣血管病。
49.權(quán)利要求40-48中任一項的方法,其中通過外周途徑給予所述抗體。
50.權(quán)利要求49的方法,其中通過口服途徑、腹膜內(nèi)途徑、皮下途徑、肌內(nèi)途徑或靜脈內(nèi)途徑給予所述抗體。
51.按照權(quán)利要求1-27中任一項的人源化抗體或其片段用于生產(chǎn)藥物的應(yīng)用,該應(yīng)用包括延長所述抗體或抗體片段的重組序列在人體組織內(nèi)的表達,以治療臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征、或臨床或臨床前腦淀粉樣血管病。
52.一種逆轉(zhuǎn)患者認知下降的方法,所述方法包括給予所述患者有效量的權(quán)利要求1-27中任一項的人源化抗體或片段。
53.一種改善患者認知的方法,所述方法包括給予所述患者有效量的權(quán)利要求1-27中任一項的人源化抗體或片段。
54.一種治療患者認知下降的方法,所述方法包括給予所述患者有效量的權(quán)利要求1-27中任一項的人源化抗體或片段。
55.一種預(yù)防患者認知下降的方法,所述方法包括給予所述患者有效量的權(quán)利要求1-27中任一項的人源化抗體或片段。
56.權(quán)利要求52-55中任一項的方法,其中當(dāng)外周給予人體所述抗體或片段時,并不需要穿過血腦屏障以影響認知。
57.權(quán)利要求52-55中任一項的方法,其中當(dāng)外周給予人體所述抗體或片段時,并不需要細胞應(yīng)答以影響認知。
58.權(quán)利要求52-55中任一項的方法,其中當(dāng)外周給予人體所述抗體或片段時,并不直接結(jié)合腦中聚集的Aβ。
59.權(quán)利要求52-57中任一項的方法,其中所述個體經(jīng)診斷患有臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征、或臨床或臨床前腦淀粉樣血管病。
60.權(quán)利要求52-57中任一項的方法,其中所述個體經(jīng)診斷沒有患有臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征、或臨床或臨床前腦淀粉樣血管病。
61.權(quán)利要求52-60中任一項的方法,其中通過外周途徑給予所述抗體。
62.權(quán)利要求61的方法,其中通過口服途徑、腹膜內(nèi)途徑、皮下途徑、肌內(nèi)途徑或靜脈內(nèi)途徑給予所述抗體。
63.按照權(quán)利要求1-27中任一項的人源化抗體或片段用于生產(chǎn)藥物的應(yīng)用,該應(yīng)用包括延長所述抗體或抗體片段的重組序列在人體組織內(nèi)的表達,以治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)臨床或臨床前阿耳茨海默氏病、Down氏綜合征、或臨床或臨床前腦淀粉樣血管病的認知下降。
64.一種治療阿耳茨海默氏病的方法,所述方法包括給予其需要患者有效量的權(quán)利要求1-27中任一項的抗體或片段。
65.權(quán)利要求1-27中任一項的人源化抗體或片段用于生產(chǎn)治療阿耳茨海默氏病的藥物的應(yīng)用。
66.一種評價人類個體對于用結(jié)合Aβ的抗體或其片段治療的反應(yīng)的方法,所述方法包括a)給予所述個體所述抗體或其片段;然后b)測量所述個體血液內(nèi)的Aβ濃度。
67.一種用結(jié)合Aβ的抗體或其片段治療人類患者的方法,所述方法包括a)給予所述患者首次劑量的所述抗體或片段;b)給予首次劑量后3小時到兩周內(nèi),測量所述患者血液內(nèi)的Aβ濃度;c)如果需要,根據(jù)步驟b)的結(jié)果計算抗體或其片段的第二次劑量,所述第二次劑量與首次劑量相同或不同;然后d)給予所述第二次劑量的所述抗體或片段。
68.一種評價抗體或其片段在人類個體內(nèi)的功效的方法,所述抗體或其片段結(jié)合Aβ以抑制或預(yù)防Aβ淀粉樣斑形成、減少Aβ淀粉樣斑、降低毒性溶解性Aβ的效應(yīng)或治療與Aβ斑有關(guān)的病癥或疾病,所述方法包括a)獲取所述個體血漿或CSF的第一份樣品;b)測量所述第一份樣品中的Aβ基線濃度;c)給予所述個體所述抗體或其片段;d)給予所述抗體或其片段后3小時到兩周內(nèi),獲得所述個體血漿或CSF的第二份樣品;然后e)測量所述第二份樣品中的Aβ濃度;其中功效與血液中結(jié)合所述抗體的Aβ量以及CSF中的Aβ濃度有關(guān)。
全文摘要
描述了一種預(yù)防性以及治療性治療特征在于淀粉樣斑形成的病癥的方法。所述方法使用的人源化抗體螯合人體生物學(xué)液體中可溶性Aβ肽,或者優(yōu)先特異性結(jié)合淀粉樣蛋白β肽Aβ位置13-28包含的表位。
文檔編號A61PGK1426423SQ01808430
公開日2003年6月25日 申請日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月24日
發(fā)明者D·M·霍爾茨曼, R·德馬托斯, K·R·巴勒斯, S·M·保羅, N·特蘇魯施塔, M·瓦斯奎茨 申請人:華盛頓大學(xué), 伊萊利利公司
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