技術領域：
本發(fā)明涉及鈣螯合肽的制備方法，尤其涉及一種利用銀杏果皮制備鈣螯合肽的方法。
背景技術：
：鈣是人體所必須的營養(yǎng)元素，人們必須通過合理的飲食來獲得鈣元素，并被人體所吸收，以保證人體的健康和增強體質，目前市場上有各種各樣的補鈣產品，這些補鈣產品豐富了鈣的來源，但是這些補鈣產品仍不能滿足人們越來越高的需要。目前，我國每年的白果總產量超過1.2萬噸，銀杏葉片產量達到1.5萬噸，而銀杏果皮的產量更大，可達到1.5-2.0萬噸。銀杏果皮中含有蛋白質、脂肪、糖類、鞣質、微量元素、氨基酸，以及黃酮類和酚酸類物質：如銀杏酚、白果酚、白果酸、氫化白果酸、氫化白果亞酸、白果醇、莽草酸、D－糖質酸、橙如酸等物質。在目前，國內外對銀杏的研究主要集中在銀杏葉，而銀杏果皮主要還是以廢棄物的形式被扔掉，沒有得到有效的利用，既浪費大量資源，又污染了環(huán)境。如果能將銀杏果皮進行綜合利用，利用其中的蛋白質來制備鈣螯合肽，不但可解決銀杏果皮污染環(huán)境的問題，還能提供一種高效的鈣離子補充劑，以滿足人們日益增長的需要。技術實現要素：本申請的目的在于提供一種利用銀杏果皮制備鈣螯合肽的方法，具體包括如下步驟：（1）、將經過干燥、粉碎的銀杏果皮投入到NaOH水溶液中，經振蕩、沉淀后取上清液，然后將上清液的pH值調節(jié)至2-3，再次沉淀，將沉淀物清洗并干燥后制得銀杏果皮粗蛋白；在目前，調節(jié)pH值的物質很多，例如常用的鹽酸就可滿足本申請的需要；（2）、將銀杏果皮粗蛋白配制為質量濃度為1-10%，pH值為9-10的水溶液；然后加入蛋白酶，調節(jié)水溶液的溫度為50-60℃，進行水解反應0.5-5小時后，再將水溶液在95-100℃下保持5-20min，進行滅酶，獲得水解液；（3）、將上述水解液離心沉淀，取上清液真空冷凍干燥后制得肽；（4）、將鈣鹽與步驟（3）所制得的肽用蒸餾水溶解后，制成水溶液，并調整水溶液的pH值為8.0，在50℃下進行螯合反應0.5-10h，反應結束后，離心沉淀取上清液，然后在上清液中加入乙醇，靜置1-3小時，然后離心沉淀，將沉淀物干燥后制得鈣螯合肽；所述鈣鹽優(yōu)選為氯化鈣；水溶液中肽與鈣離子的質量比為10:1-50:1。進一步，在上述步驟（1）中，所述NaOH水溶液的濃度為0.05-0.1mol/L，進一步優(yōu)選為0.08-0.1mol/L；銀杏果皮與NaOH水溶液的質量比為1:10-1:100，進一步優(yōu)選為1:50-1:90。NaOH的主要作用是將銀杏果皮中的蛋白質溶解出來，以利于提取，當NaOH的濃度達到一定濃度后，對于蛋白質的溶解速度已增加有限，將NaOH的濃度控制在0.05-0.1mol/L，在保證蛋白質被溶解出來的前提下，降低NaOH的消耗。適當的固液比可以使銀杏果皮中蛋白質能夠被提取出來，進入到NaOH水溶液中，為避免NaOH水溶液中蛋白質的濃度過高，而影響銀杏果皮中蛋白質的提取率，NaOH水溶液相對于銀杏果皮的量不能太少，當然在超過一定的比例后，過多的NaOH水溶液也不能提取到更多的蛋白質，將銀杏果皮與NaOH溶液的質量比控制在1:10-1:100之間，即可保證銀杏果皮中的蛋白質能夠被盡可能地提取出來。進一步，所述蛋白酶為堿性蛋白酶。經過篩選，堿性蛋白酶是最佳的用于分解蛋白質的蛋白酶。進一步，蛋白酶的添加量為銀杏果皮粗蛋白質量的0.1-2%，進一步優(yōu)選為0.8-1.6%。該范圍內的蛋白酶的用量已能較好地完成蛋白質的分解，無需過多地添加。適宜的溫度可提高蛋白質的提取速度，在步驟（1）中，NaOH水溶液的溫度優(yōu)選為50-60℃。進一步，水溶液中肽的濃度為10-100g/L。進一步，所述乙醇為無水乙醇，無水乙醇在上清液中的加入量為上清液體積的1-10倍。具體地，本發(fā)明的最佳實施步驟為：（1）、將經過干燥、粉碎的銀杏果皮投入到60℃的NaOH水溶液中，經振蕩1-5小時后，沉淀取上清液，然后將上清液的pH值調節(jié)至2.6，再次沉淀，將沉淀物清洗并干燥后制得銀杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的濃度為0.08-0.1mol/L，銀杏果皮與NaOH溶液的質量比為1:50-1:90；（2）、將銀杏果皮粗蛋白配制為質量濃度為1-10%，pH值為9的水溶液；然后加入堿性蛋白酶，調節(jié)水溶液的溫度為50℃，進行水解反應0.5-5小時后，再將水溶液在95-100℃下保持10min，進行滅酶，然后冷卻，獲得水解液；堿性蛋白酶的加入量為銀杏果皮粗蛋白質量的0.8-1.6%。（3）、將上述水解液離心沉淀，取上清液真空冷凍干燥后制得肽；（4）、將氯化鈣鹽與步驟（3）所制得的肽用蒸餾水溶解，并調整pH值為8.0，在50℃下進行螯合反應0.5-10h，反應結束后，離心沉淀取上清液，然后在上清液中加入5倍體積的無水乙醇，靜置2小時，然后離心沉淀，將沉淀物干燥后制得鈣螯合肽；其中，肽與鈣離子的質量比為10:1-50:1。在采用本發(fā)明制備鈣螯合肽的過程中，經過堿性蛋白酶水解后得到的多肽，不但具有鈣離子螯合的能力，還具有很強的抗氧化活性，因此本發(fā)明所制備的鈣螯合肽還可以作為抗氧化劑來使用，其對DPPH自由基的清除率較高，當鈣螯合肽在溶劑中的濃度達到0.4g/L以上時，對DPPH自由基的清除率穩(wěn)定在74%以上。本申請所制作的鈣螯合肽對人體具有較高的保健作用。具體實施方式實施例1將銀杏果皮除雜，40℃烘干12小時，用粉碎機研磨成粉，取10kg投入到100kg溫度為60℃的NaOH水溶液中，在振蕩1小時后，離心沉淀取上清液，然后將上清液用鹽酸調節(jié)pH值至2.6，然后離心沉淀，將沉淀物清洗并干燥后制得銀杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的濃度為0.08mol/L。將制得的銀杏果皮粗蛋白制成質量濃度為1%、pH值為9的水溶液，然后加入相對于銀杏果皮粗蛋白的質量的0.1%的堿性蛋白酶，在50℃進行水解反應0.5小時后，將水溶液在100℃下保持沸騰10min，進行滅酶，獲得水解液。將水解液離心沉淀，取上清液經真空冷凍干燥后制得肽A。將適量的肽A與氯化鈣制成水溶液，其中肽A的濃度為10g/L，鈣離子的濃度為1g/L，pH值為8.0，在50℃下進行螯合反應0.5小時，然后冷卻、離心沉淀取上清液，然后在上清液中加入5倍體積的無水乙醇，靜置2h后離心取沉淀，將沉淀物干燥后制得鈣螯合肽A。所得的鈣螯合肽A中肽A與鈣的螯合率為53.17%，螯合鈣得率為49.28%，鈣的質量百分比為1.95%。實施例2將銀杏果皮除雜，50℃烘干8小時，用粉碎機研磨成粉，取1kg投入到100kg溫度為50℃的NaOH水溶液中，在振蕩5小時后，離心沉淀取上清液，然后將上清液用鹽酸調節(jié)pH值至2，然后離心沉淀，將沉淀物清洗并干燥后制得銀杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的濃度為0.1mol/L。將制得的銀杏果皮粗蛋白制成質量濃度為10%、pH值為10的水溶液，然后加入相對于銀杏果皮粗蛋白質量的2%的堿性蛋白酶，在60℃進行水解反應5小時后，將水溶液在95℃下保持20min，進行滅酶，獲得水解液。將水解液離心沉淀，取上清液經真空冷凍干燥后制得肽B。將適量的肽B與氯化鈣制成水溶液，其中肽B的濃度為100g/L，鈣離子的濃度為2g/L，pH值為8.0，在50℃下進行螯合反應10小時，然后冷卻、離心沉淀取上清液，然后在上清液中加入3倍體積的無水乙醇，靜置1h后離心取沉淀，將沉淀物干燥后制得鈣螯合肽B。所得的鈣螯合肽B中肽B與鈣的螯合率為58.36%，螯合鈣得率為52.46%，鈣的質量百分比為2.05%。實施例3將銀杏果皮除雜，50℃烘干8小時，用粉碎機研磨成粉，取2kg投入到100kg溫度為55℃的NaOH水溶液中，在振蕩3小時后，離心沉淀取上清液，然后將上清液用鹽酸調節(jié)pH值至3，然后離心沉淀，將沉淀物清洗并干燥后制得銀杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的濃度為0.05mol/L。將制得的銀杏果皮粗蛋白制成質量濃度為5%、pH值為9.5的水溶液，然后加入相對于銀杏果皮粗蛋白質量的0.8%的堿性蛋白酶，在50℃進行水解反應2小時后，將水溶液在98℃下保持5min，進行滅酶，獲得水解液。將水解液離心沉淀，取上清液經真空冷凍干燥后制得肽C。將適量的肽C與氯化鈣制成水溶液，其中肽C的濃度為30g/L，鈣離子的濃度為1g/L，pH值為8.0，在50℃下進行螯合反應5小時，然后冷卻、離心沉淀取上清液，然后在上清液中加入7倍體積的無水乙醇，靜置3h后離心取沉淀，將沉淀物干燥后制得鈣螯合肽C。所得的鈣螯合肽C中肽C與鈣的螯合率為55.41%，螯合鈣得率為50.31%，鈣的質量百分比為1.92%。實施例4將銀杏果皮除雜，40℃烘干12小時，用粉碎機研磨成粉，取1kg投入到90kg溫度為60℃的NaOH水溶液中，在振蕩4小時后，離心沉淀取上清液，然后將上清液用鹽酸調節(jié)pH值至2.6，然后離心沉淀，將沉淀物清洗并干燥后制得銀杏果皮粗蛋白；其中，NaOH水溶液的濃度為0.09mol/L。將制得的銀杏果皮粗蛋白制成質量濃度為8%、pH值為9.7的水溶液，然后加入相對于銀杏果皮粗蛋白質量的1.6%的堿性蛋白酶，在50℃進行水解反應3小時后，將水溶液在97℃下保持10min，進行滅酶，獲得水解液。將水解液離心沉淀，取上清液經真空冷凍干燥后制得肽D。將適量的肽D與氯化鈣制成水溶液，其中肽D的濃度為80g/L，鈣離子的濃度為4g/L，pH值為8.0，在50℃下進行螯合反應3小時，然后冷卻、離心沉淀取上清液，然后在上清液中加入5倍體積的無水乙醇，靜置3h后離心取沉淀，將沉淀物干燥后制得鈣螯合肽D。所得的鈣螯合肽D中肽D與鈣的螯合率為57.50%，螯合鈣得率為50.20%，鈣的質量百分比為2.15%。對實施例中得到的肽和鈣螯合肽進行活性檢測，采用對DPPH自由基的清除作用來表示，具體操作如下：將鈣螯合肽分別制成不同濃度的樣品，然后分別取0.4mL樣品與等體積的40g/LDPPH無水乙醇溶液充分混合，室溫下避光靜置30min，于波長517nm下測定吸光值。用去離子水和還原型谷胱甘肽代替樣品分別作空白對照和陽性對照。樣品的DPPH自由基清除活力按下列公式（1）計算：(1)式中，Ai為加入樣品的DPPH無水乙醇溶液的吸光值；Aj為加入樣品的無水乙醇溶液的吸光值；A0為用去離子水替代樣品的DPPH無水乙醇溶液的吸光值。檢測結果見表1。表1鈣螯合肽對DPPH自由基的清除效果樣品濃度（g/L）0.10.20.40.60.81.0鈣螯合肽A對DPPH自由基的清除（%）194876828284鈣螯合肽B對DPPH自由基的清除（%）215075818282鈣螯合肽C對DPPH自由基的清除（%）204976788082鈣螯合肽D對DPPH自由基的清除（%）204974808283還原型谷胱甘肽對DPPH自由基的清除（%）698391929393本申請公開了一種利用銀杏果皮制備鈣螯合肽的方法，包括如下步驟：（1）、將銀杏果皮投入到NaOH水溶液中，經振蕩、沉淀后取上清液，然后將上清液的pH值調節(jié)至2-3，再次沉淀，沉淀物即銀杏果皮粗蛋白；（2）、將銀杏果皮粗蛋白配制為水溶液；加入蛋白酶，進行水解反應，最后進行滅酶，獲得水解液；（3）、將水解液離心沉淀，取上清液真空冷凍干燥后制得肽；（4）、將鈣鹽與步驟（3）所制得的肽制成水溶液，進行螯合反應，反應結束后，離心沉淀取上清液，然后在上清液中加入乙醇，靜置后離心沉淀，將沉淀物干燥后制得鈣螯合肽。本發(fā)明所制備的鈣螯合肽可以作為抗氧化劑來使用，其對DPPH自由基的清除率較高。當前第1頁1 2 3