本發(fā)明涉及海藻提取領(lǐng)域，具體涉及從海藻中提取肽的方法。所述的肽是低聚肽、短肽和多肽等化合物的混合物。
背景技術(shù)：
可食用的海藻是重要的海洋生物之一，是人類綠色的食品源。常見的可食用海藻有：孔石莼、鼠尾藻、裙帶菜、螺旋藻等。它們對(duì)人體都有各自不同的保健功能。
孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)是一種大型綠藻，俗稱海白菜、海菠菜、海萵苣等，屬綠藻門石莼科石莼屬。它幼體綠色，成體碧綠色，生活在潮間帶，廣泛分布于西太平洋沿海，在我國(guó)野生藻類中資源極為豐富，是黃渤海產(chǎn)量最大的一種綠藻。因其味美營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，當(dāng)?shù)厝顺Ｓ脕碜鞲鞣N食品。自古以來孔石莼在食用和藥用方面就有廣泛的應(yīng)用?！吨腥A本草》記載孔石莼“主風(fēng)秘不通，五嗝氣，并小便不利，臍下結(jié)氣”；“軟堅(jiān)散結(jié)，清熱祛痰，利水解毒。用于喉炎，頸淋巴結(jié)腫，水腫，瘡癤及癭瘤等。”我國(guó)民間一直用孔石莼與其他藥用植物配伍治療中暑、頸淋巴結(jié)腫、甲狀腺腫、瘡疥、急慢性胃腸炎、高血壓、水腫和小便不利、喉炎及咳嗽等。孔石莼的化學(xué)組分主要有多糖，脂類，蛋白質(zhì)，維生素以及無機(jī)礦物元素等。具有降血脂，降膽固醇，抗凝血，抗病毒，抗腫瘤等活性?？资坏牡鞍踪|(zhì)含量豐富，因此逐漸引起了研究者的關(guān)注。其含量因地域、季節(jié)變化略有差異，大約在17％～19％之間?？资唤?jīng)堿提酸解后，可檢測(cè)出約20種氨基酸，其中有8種為人體必需氨基酸，這些氨基酸對(duì)人體的生長(zhǎng)發(fā)育是至關(guān)重要的，與陸地高等植物和動(dòng)物蛋白相比，孔石莼蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。
裙帶菜(Undaria pinnatifida)屬褐藻門，褐子綱，海帶目，翅藻科，裙帶菜屬，又被稱為聰明菜、美容菜、健康菜。裙帶菜的葉狀體不但可食用，還可作為中藥使用，其藥用歷史最早見于明代姚可成的《食療本草》：“裙帶菜主女人赤白帶下，男子精泄夢(mèng)遺”。近代認(rèn)為裙帶菜與昆布化學(xué)成分相似，將其作為中藥昆布入藥，具有消痰軟堅(jiān),利水退腫的功效。裙帶菜具有營(yíng)養(yǎng)高、熱量低的特點(diǎn)，具有減肥、清理腸道、保護(hù)皮膚、延緩衰老的功效。研究表明裙帶菜中含有豐富的粗蛋白和糖類，其蛋白質(zhì)和糖類的含量遠(yuǎn)高于其他藻類。據(jù)測(cè)定，裙帶菜含有19種氨基酸，其中8種是人體必需氨基酸。Sato M等將裙帶菜用17種蛋白酶水解，測(cè)定水解產(chǎn)物中4種具有顯著降血壓的作用，不僅沒有副作用，而且能同時(shí)補(bǔ)充更多人體所必須的營(yíng)養(yǎng)，增強(qiáng)免疫力。
鼠尾藻(Sarassum thunbergii(Mert.)O.Kuntze)是暖溫帶海藻，隸屬于褐藻門、無孢子綱、馬尾藻科、馬尾藻屬，是我國(guó)沿海常見的野生種。由于其具有軟堅(jiān)散結(jié)、利尿消腫、清熱化痰之功效，被收載于《中國(guó)海洋藥物詞典》。據(jù)報(bào)道，鼠尾藻蛋白含量高達(dá)19.35％，且含有的氨基酸也較全面，氨基酸構(gòu)成比例方面大部分氨基酸比較接近，其中必需氨基酸的組成合理，氨基酸化學(xué)評(píng)分在80～88之間，遠(yuǎn)高于海帶和紫菜。
目前，對(duì)于孔石莼的利用多見于飼料、肥料、凈水中，對(duì)其的研究也見于多糖，而對(duì)孔石莼多肽的研究鮮有報(bào)道。對(duì)于裙帶菜的研究同樣多見于多糖。目前，對(duì)于這些海藻的應(yīng)用多局限于餐桌的涼拌菜。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有研究與應(yīng)用的不足，開發(fā)一種工藝簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理的海藻肽提取方法，提高海藻的利用率，充分利用自然資源，同時(shí)，降低海藻大規(guī)模生長(zhǎng)對(duì)海水水質(zhì)及近海生物的影響。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種從海藻中提取低聚肽制作海藻低聚肽粉的方法，具體步驟為：
S1、原料預(yù)處理：將海藻洗凈、曬干，粉碎、過100目篩，得到海藻粉；
S2、向步驟S1制得的海藻粉中加水、磨漿，得到海藻漿液；
所述海藻粉與水的質(zhì)量比為1:10～20；
S3、將步驟S2制得的海藻漿液加熱至50～60℃，用質(zhì)量濃度為10％的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.3～4.0，加入30000u/g的果膠酶，攪拌酶解3～5h，得到海藻酶解液；
所述果膠酶的加入量為所述海藻粉總質(zhì)量的0.05～0.2‰；
S4、調(diào)節(jié)步驟S3制得的海藻酶解液溫度至40～47℃，向所述海藻酶解液中加入質(zhì)量濃度為10％的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0～9.0，加入占所述海藻粉總質(zhì)量0.3～1.3％的復(fù)合蛋白酶，攪拌酶解3～6h；升溫至85～95℃，滅酶10～30min，固液分離，收集液相；
所述復(fù)合蛋白酶的質(zhì)量組成為：
S5、采用孔徑1～8nm的膜過濾步驟S4收集的液相，收集透過液，向截留液中加水稀釋后再過濾，重復(fù)3～5次，合并收集的透過液；將所述透過液進(jìn)行電滲析至液體電導(dǎo)率小于30μs/cm2、活性炭精制、脫炭，得到精制液；
S6、將步驟S5得到的精制液，蒸發(fā)濃縮、噴霧干燥得海藻低聚肽粉。
優(yōu)選方式下，步驟S1所述海藻為孔石莼、鼠尾藻、裙帶菜、紫菜、海帶、江蘺、滸苔或螺旋藻中的一種。
優(yōu)選方式下，步驟S2所述海藻粉與水的質(zhì)量比為1:19。
優(yōu)選方式下，步驟S4中所述固液分離使用離心機(jī)或板框式壓濾機(jī)。
優(yōu)選方式下，步驟S5所述電滲析的操作條件為：電壓75V，進(jìn)所述透過液流速1.50噸/小時(shí)，濃水流速1.55噸/小時(shí)，電極冷卻水流速1噸/小時(shí)。
優(yōu)選方式下，步驟S5所述蒸發(fā)濃縮至固含量為35～55％。
本發(fā)明的有益效果在于：
1、本發(fā)明采用30000u/g的果膠酶對(duì)海藻漿液進(jìn)行酶解，將海藻的細(xì)胞壁酶解破碎，有利于進(jìn)一步提取多肽。
2、本發(fā)明采用的復(fù)合蛋白酶可有效的將蛋白質(zhì)酶解成小肽，對(duì)海藻的酶解收率達(dá)90％以上，分子量小于2000Da的小肽含量占90％以上，且產(chǎn)品沒有苦味。
3、本發(fā)明采用膜分離獲得透過液，采用電滲析法去除透過液中的無機(jī)離子，保留了小肽；本發(fā)明方法可有效去除重金屬離子，確保產(chǎn)品的安全性。
4、本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理，酶解提取海藻中的小肽，提供有益于人體健康的產(chǎn)品；實(shí)現(xiàn)海藻的高值化利用，提高海藻的利用率，充分利用自然資源，同時(shí)，降低海藻大規(guī)模生長(zhǎng)對(duì)海水水質(zhì)及近海生物的影響。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明。
本具體實(shí)施方式采用的技術(shù)方案是：它的工藝流程如下：
步驟一、將海藻洗凈，晾曬風(fēng)干；
步驟二、將干燥的海藻，經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎后，過100目篩；
步驟三、稱取一定量海藻粉末，按質(zhì)量比1:10～20比例加純水，用膠體磨磨漿；
步驟四、將體系溫度調(diào)至50-60℃，用質(zhì)量濃度10％HCL調(diào)體系pH 3.3-4.0，加入果膠酶(30000u/g)0.05-0.2‰(海藻粉總質(zhì)量)，攪拌酶解3-5h；
步驟五、將步驟四中得到的酶解液調(diào)用質(zhì)量濃度10％NaOH調(diào)體系pH 7.0-9.0，加復(fù)合蛋白酶(其中10萬u/g As1.398中性蛋白酶20-80％、20萬u/g 2709堿性蛋白酶10-70％、胰酶5-50％、60萬u/g木瓜蛋白酶2-30％、風(fēng)味酶0.5-10％)0.3-1.3％(海藻粉總質(zhì)量)，攪拌酶解3-6h，升溫至85-95℃滅酶10-30min，離心或板框過濾得清液；
步驟六、將步驟五中的清液經(jīng)孔徑1-8nm膜過濾，其中過濾下來的截留液加純水稀釋后再過濾，重復(fù)3-5次，收集透過液，合并；
步驟七、將步驟六中的膜透過液為肽類和無機(jī)離子，經(jīng)電滲析脫去無機(jī)離子；
步驟八、將步驟七中的所得液經(jīng)活性炭精制、脫炭，得精制液，經(jīng)含量測(cè)定后，精制液蒸發(fā)濃縮、干燥得海藻低聚肽粉。
實(shí)施例1
1、孔石莼用純水清洗，晾曬風(fēng)干；
2、粉碎：取晾干的孔石莼超微粉碎，過100目篩；
3、破細(xì)胞壁：稱取孔石莼粉末1000g，按1:19比例加純水，用膠體磨磨漿，將體系溫度調(diào)至50℃，pH 3.5，加入果膠酶(30000u/g)0.1g，攪拌酶解3h；
4、酶解：調(diào)體系溫度42℃，pH7.5，加復(fù)合蛋白酶5g攪拌酶解4h，升溫至90℃滅酶20min，離心分離得清液；
復(fù)合蛋白酶的組成為：
5、膜過濾：將清液用孔徑4nm膜過濾，截留液加純水稀釋后再過濾，重復(fù)3次，合并透過液，透過液中主要含肽類和無機(jī)離子；
6、孔石莼肽精制：將透過液經(jīng)電滲析脫鹽至液體電導(dǎo)率小于30μs/cm2，采用活性炭棒精制、脫炭得精制液，將精制液蒸發(fā)濃縮、噴霧干燥得孔石莼低聚肽粉。
本實(shí)施例制得孔石莼低聚肽粉156.4g，按原料中蛋白總量計(jì)算收率為：
低聚肽粉質(zhì)量/(原料重量*蛋白含量)＝156.4g/(1000g*17％)＝92％，其中，步驟2制得的孔石莼粉末的蛋白含量為17％；
采用高效液相色譜法測(cè)得分子量小于2000Da的小肽含量為91.6％。
實(shí)施例2
1、鼠尾藻用純水清洗，晾曬風(fēng)干；
2、粉碎：取晾干的鼠尾藻超微粉碎，過100目篩；
3、破細(xì)胞壁：稱取鼠尾藻粉末10kg，按1:14比例加純水，用膠體磨磨漿，將體系溫度調(diào)至52℃，pH 3.7，加入果膠酶(30000u/g)1g，攪拌酶解3.5h；
4、酶解：調(diào)體系溫度40℃，pH8.0，加復(fù)合蛋白酶100g攪拌酶解4h，升溫至85℃滅酶20min，離心分離得清液；
所述復(fù)合蛋白酶的組成為：
5、膜過濾：清液用孔徑5nm膜過濾，截留液加純水稀釋后再過濾，重復(fù)3次，合并透過液，透過液中主要含肽類和無機(jī)離子；
6、鼠尾藻肽精制：將透過液經(jīng)電滲析脫鹽至液體電導(dǎo)率小于30μs/cm2，采用活性炭棒精制、脫炭得精制液，精制液蒸發(fā)濃縮、干燥得鼠尾藻低聚肽粉。
本實(shí)施例制得低聚肽粉1650.6g，按原料中蛋白總量計(jì)算收率為：
低聚肽粉質(zhì)量/(原料重量*蛋白含量)＝1650.6g/(10kg*18％)＝91.7％，其中，步驟2制得的鼠尾藻粉末的蛋白含量為18％；
高效液相色譜法測(cè)得分子量小于2000Da的小肽含量為93.8％。
實(shí)施例3
1、裙帶菜用純水清洗，攤開晾曬，50℃烘干至恒重；
2、粉碎：取干燥的裙帶菜超微粉碎，過100目篩；
3、破細(xì)胞壁：稱取裙帶菜粉末10kg，按1:19比例加純水，用膠體磨磨漿，將體系溫度調(diào)至56℃，pH 3.9，加入果膠酶(30000u/g)1g，攪拌酶解4h；
4、調(diào)體系溫度45℃，pH8.5，加復(fù)合蛋白酶120g攪拌酶解5h，升溫至85℃滅酶20min，離心分離得清液；
所述復(fù)合蛋白酶的質(zhì)量組成為：
5、膜過濾：清液用孔徑6nm膜過濾，截留液加純水稀釋后再過濾，重復(fù)3次，合并透過液，主要含肽類和無機(jī)離子；
6、裙帶菜低聚肽精制：將透過液經(jīng)電滲析脫鹽至液體電導(dǎo)率小于30μs/cm2，活性炭棒、脫炭得精制液，減壓濃縮至固含量35～55％，噴霧干燥，得裙帶菜低聚肽粉。
本實(shí)施例制得低聚肽粉1642.94g，按原料中蛋白總量計(jì)算收率為：
低聚肽粉質(zhì)量/(原料重量*蛋白含量)＝1642.94g/(10kg*17.8％)＝92.3％，其中，步驟2制得的裙帶菜粉末的蛋白含量為17.8％；
高效液相色譜法測(cè)得分子量小于2000Da的小肽含量為93.1％。
實(shí)施例4
1、螺旋藻用純水清洗，攤開晾曬，烘干；
2、粉碎：取干燥的螺旋藻超微粉碎，過100目篩；
3、破細(xì)胞壁：稱取螺旋藻粉末100kg，按1:12比例加純水，膠體磨磨漿，將體系溫度調(diào)至60℃，pH 3.8，加入果膠酶(30000u/g)8g，攪拌酶解4.5h；
3、酶解：調(diào)體系溫度47℃，pH8.5，加復(fù)合蛋白酶1300g攪拌酶解5h，升溫至95℃滅酶20min，離心分離得清液；
所述復(fù)合蛋白酶的質(zhì)量組成為：
4、膜過濾：清液用孔徑6nm膜過濾，截留液加純水稀釋后再過濾，重復(fù)3次，合并透過液，主要含肽、脂類和無機(jī)離子；
5、螺旋藻低聚肽精制：將透過液經(jīng)電滲析脫鹽至液體電導(dǎo)率小于30μs/cm2，活性炭棒、脫炭得精制液，減壓濃縮至固含量45～55％，噴霧干燥，得螺旋藻低聚肽粉。
本實(shí)施例制得低聚肽粉17158.8g，按原料中蛋白總量計(jì)算收率為：
低聚肽粉質(zhì)量/(原料重量*蛋白含量)＝17158.8g/(100kg*18.1％)＝94.8％，其中，步驟2制得的螺旋藻粉末的蛋白含量為18.1％；
高效液相色譜法測(cè)得分子量小于2000Da的小肽含量為96.4％。
實(shí)施例5
1、紫菜用純水清洗，攤開晾曬，烘干；
2、粉碎：取干燥的紫菜超微粉碎，過100目篩；
3、破細(xì)胞壁：稱取紫菜粉末100kg，按1:12比例加純水，膠體磨磨漿，將體系溫度調(diào)至60℃，pH 4.0，加入果膠酶(30000u/g)8g，攪拌酶解4.5h；
3、酶解：調(diào)體系溫度47℃，pH8.5，加復(fù)合蛋白酶1300g攪拌酶解4.5h，升溫至93℃滅酶20min，離心分離得清液；
所述復(fù)合蛋白酶的配制比例為：
4、膜過濾：清液用孔徑6nm膜過濾，截留液加純水稀釋后再過濾，重復(fù)3次，合并透過液，主要含肽、脂類和無機(jī)離子；
5、紫菜低聚肽精制：將透過液經(jīng)電滲析脫鹽至液體電導(dǎo)率小于30μs/cm2，活性炭棒、脫炭得精制液，減壓濃縮至固含量45～55％，噴霧干燥，得紫菜低聚肽粉。
本實(shí)施例制得低聚肽粉28740.1g，按原料中蛋白總量計(jì)算收率為：
低聚肽粉質(zhì)量/(原料重量*蛋白含量)＝28740.1g/(100kg*30％)＝95.8％，其中，步驟2制得的螺旋藻粉末的蛋白含量為30％；
高效液相色譜法測(cè)得分子量小于2000Da的小肽含量為92.4％。
實(shí)施例6
1、海帶用純水清洗，攤開晾曬，50℃烘干至恒重；
2、粉碎：取干燥的海帶超微粉碎，過100目篩；
3、破細(xì)胞壁：稱取海帶粉末10kg，按1:19比例加純水，用膠體磨磨漿，將體系溫度調(diào)至56℃，pH 3.9，加入果膠酶(30000u/g)1g，攪拌酶解4h；
4、調(diào)體系溫度45℃，pH8.5，加復(fù)合蛋白酶120g攪拌酶解5h，升溫至85℃滅酶20min，離心分離得清液；
所述復(fù)合蛋白酶的配制比例為：
5、膜過濾：清液用孔徑5nm膜過濾，截留液加純水稀釋后再過濾，重復(fù)3次，合并透過液，主要含肽類和無機(jī)離子；
6、海帶低聚肽精制：將透過液經(jīng)電滲析脫鹽至液體電導(dǎo)率小于30μs/cm2，活性炭棒、脫炭得精制液，減壓濃縮至固含量35～55％，噴霧干燥，得海帶低聚肽粉。
本實(shí)施例制得低聚肽粉730.86g，按原料中蛋白總量計(jì)算收率為：
低聚肽粉質(zhì)量/(原料重量*蛋白含量)＝730.86g/(10kg*7.8％)＝93.7％，其中，步驟2制得的海帶粉末的蛋白含量為7.8％；
高效液相色譜法測(cè)得分子量小于2000Da的小肽含量為91.9％。
實(shí)施例7
1、江蘺用純水清洗，晾曬風(fēng)干；
2、粉碎：取晾干的江蘺超微粉碎，過100目篩；
3、破細(xì)胞壁：稱取江蘺粉末1000g，按1:19比例加純水，用膠體磨磨漿，將體系溫度調(diào)至53℃，pH 3.7，加入果膠酶(30000u/g)0.1g，攪拌酶解3h；
4、酶解：調(diào)體系溫度44℃，pH7.8，加復(fù)合蛋白酶5g攪拌酶解4h，升溫至90℃滅酶20min，離心分離得清液；
所述復(fù)合蛋白酶的組成為：
5、膜過濾：將清液用孔徑4nm膜過濾，截留液加純水稀釋后再過濾，重復(fù)3次，合并透過液，透過液中主要含肽類和無機(jī)離子；
6、江蘺肽精制：將透過液經(jīng)電滲析脫鹽至液體電導(dǎo)率小于30μs/cm2，采用活性炭棒精制、脫炭得精制液，將精制液蒸發(fā)濃縮、噴霧干燥得江蘺低聚肽粉。
本實(shí)施例制得江蘺低聚肽粉156.4g，按原料中蛋白總量計(jì)算收率為：
低聚肽粉質(zhì)量/(原料重量*蛋白含量)＝216.905g/(1000g*23.5％)＝92.3％，其中，步驟2制得的江蘺粉末的蛋白含量為23.5％；
采用高效液相色譜法測(cè)得分子量小于2000Da的小肽含量為94.1％。
實(shí)施例8
1、滸苔用純水清洗，晾曬風(fēng)干；
2、粉碎：取晾干的滸苔超微粉碎，過100目篩；
3、破細(xì)胞壁：稱取滸苔粉末10kg，按1:14比例加純水，用膠體磨磨漿，將體系溫度調(diào)至52℃，pH 3.7，加入果膠酶(30000u/g)1g，攪拌酶解3.5h；
4、酶解：調(diào)體系溫度40℃，pH8.0，加復(fù)合蛋白酶100g攪拌酶解4h，升溫至85℃滅酶20min，離心分離得清液；
所述復(fù)合蛋白酶的配制比例為：
5、膜過濾：清液用孔徑5nm膜過濾，截留液加純水稀釋后再過濾，重復(fù)3次，合并透過液，透過液中主要含肽類和無機(jī)離子；
6、滸苔肽精制：將透過液經(jīng)電滲析脫鹽至液體電導(dǎo)率小于30μs/cm2，采用活性炭棒精制、脫炭得精制液，精制液蒸發(fā)濃縮、干燥得滸苔低聚肽粉。
本實(shí)施例制得低聚肽粉1650.6g，按原料中蛋白總量計(jì)算收率為：
低聚肽粉質(zhì)量/(原料重量*蛋白含量)＝1226.79g/(10kg*12.9％)＝95.1％，其中，步驟2制得的滸苔粉末的蛋白含量為12.9％；
高效液相色譜法測(cè)得分子量小于2000Da的小肽含量為92.1％。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。