本發(fā)明涉及一種納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶及其制備方法，屬于生物催化工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,HPL)是植物脂質(zhì)氧化途徑中脂肪氧合酶(LOX)下游的酶，可將LOX作用下多不飽和脂肪酸形成的脂肪酸氫過氧化物裂解形成含氧酸和揮發(fā)性醛類。根據(jù)底物過氧基位置的差異，HPL可分為兩類：第一類可裂解13位氫過氧化產(chǎn)物生成C6醛和C12含氧酸，稱為13-HPL；第二類可裂解9位氫過氧化物生成C9醛類和C9含氧酸，稱為9-HPL。由13-LOX和13-HPL共同催化得到的C6醛類(包括己醛，己烯醛)具有清新芳香風(fēng)味，在國外被稱為“Green note”。這些揮發(fā)性醛類被廣泛應(yīng)用于香精/香水制造和食品工業(yè)，例如用于長期存儲或殺菌后果蔬新鮮氣味的重塑。

HPL的不穩(wěn)定性是制約這一生物合成途徑實現(xiàn)工業(yè)化的重要障礙。大多 數(shù)植物來源的HPL通常會在反應(yīng)開始的20分鐘之內(nèi)完全喪失活力。HPL的不穩(wěn)定性主要體現(xiàn)在以下三個方面：(1)作為反應(yīng)底物的氫過氧化物性質(zhì)非?；顫?，具有攻擊性，易造成HPL蛋白的氧化而使酶失活；(2)Gargouri等人推測的反應(yīng)機理表明HPL反應(yīng)過程中產(chǎn)生的自由基會攻擊HPL酶，使其喪失活性；(3)反應(yīng)產(chǎn)物(包括己醛和己烯醛)也都會對HPL活力產(chǎn)生較強的抑制作用。

一般而言，固定化被認(rèn)為是提高酶活力和穩(wěn)定性最為便捷的方法。許多酶在經(jīng)過固定化之后穩(wěn)定性得到了顯著的提高。例如，來源于熒光假單胞菌的脂肪酶在羊毛纖維上的固定化顯著提高了脂肪酶的操作穩(wěn)定性。除此之外，固定化也可以比較方便地實現(xiàn)酶的重復(fù)使用而大大降低酶用量，同時也使得反應(yīng)器的設(shè)計更為容易。因此，無論是在實驗室水平還是工業(yè)化生產(chǎn)中，固定化酶都是很有優(yōu)勢的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是合成一種納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶，所得到的納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶易于分離且具有較高的酶活力以及較好的操作穩(wěn)定性。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶，它的化學(xué)名稱為：四氧化三鐵(甲基丙烯酸縮水甘油酯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸-2-羥乙酯)共聚物固定化氫過氧化物裂解酶，它的初始酶活力為34.7U/g，其在底物濃度為400μM時重復(fù)使用10次之后仍保留70-95％的相對酶活力。

這種納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶，由以下步驟制得：

a.將納米磁性微球置于錐形瓶中，按HPL/NMP質(zhì)量比為20mg/g～60mg/g加入HPL并將兩者混合在一起，然后加入配置好的固定化介質(zhì)，得到混合物。

b.將步驟a中得到的混合物于30～40℃恒溫震蕩6～12h，得到固定化HPL。

c.外加磁場回收固定化HPL，然后去除上清液。

d.用PBS以及去離子水分別清洗固定化HPL兩次，得到納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶。清洗的目的是洗去雜質(zhì)，因此清洗的次數(shù)可以根據(jù)實際情況進(jìn)行選擇，通常用PBS及去離子水分別清洗兩次即可。

步驟a所述固定化介質(zhì)為：含1～5mM DTT及質(zhì)量濃度0.1％～0.5％Triton X-100的PBS，PBS的濃度為0.1～1.0M，pH為6.0～7.5。

其中，步驟a中所述納米磁性微球的制備包括如下步驟：

(一)水相組成為：將0.5～1.7g/L的Fe₃O₄超聲至完全分散于含有0.1 wt.％～0.3wt.％PVA的水溶液中。

(二)油相組成為：GMA、HEMA以及MMA按摩爾比2～10:0～15:15～0混合，并加入0.1wt.％～0.5wt.％的EDGMA作為交聯(lián)劑。

(三)水相與油相混合、通氮氣驅(qū)氧并攪拌10～30min，然后逐滴加入0.5％～1.0％v/v濃度為0.5wt.％～5.0wt.％的過硫酸鉀作為引發(fā)劑，并于60～80℃下回流反應(yīng)30min～12h，然后磁分離得到固體產(chǎn)物。

(四)使用40％～75％乙醇洗去固體產(chǎn)物中殘余未聚合的單體，得到納米磁性微球。

如采用上述步驟(一)至(四)制備的納米磁性微球制備一種納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶，則其步驟c應(yīng)為：外加磁場回收固定化HPL，然后去除上清液，之后向固定化HPL中加入半胱氨酸猝滅多余的環(huán)氧基團(tuán),半胱氨酸的添加量為摩爾比GMA:-NH₂＝1:0.01～0.1。

本發(fā)明的納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶可以應(yīng)用到其他多種固定化酶的制備中。

本發(fā)明的納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶可以應(yīng)用于芳香性風(fēng)味成分C6醛的制備。

本發(fā)明的第二個目的是提供上述納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶的制備方法。

該方法包括以下步驟：

A.將納米磁性微球置于錐形瓶中，按HPL/NMP質(zhì)量比為20mg/g～60mg/g加入HPL并將兩者混合在一起，然后加入配置好的固定化介質(zhì)，得到混合物。

B.將步驟A中得到的混合物于30～40℃恒溫震蕩6～12h，得到固定化HPL。

C.外加磁場回收固定化HPL，然后去除上清液。

D.用PBS以及去離子水分別清洗固定化HPL，得到納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶。清洗的目的是洗去雜質(zhì)，因此清洗的次數(shù)可以根據(jù)實際情況進(jìn)行選擇，通常用PBS及去離子水分別清洗兩次即可。

步驟A中所述納米磁性微球的制備包括如下步驟：

①水相組成為：將0.5～1.7g/L的Fe₃O₄超聲至完全分散于含有0.1wt.％～0.3wt.％PVA的水溶液中。

②油相組成為：GMA、HEMA以及MMA按摩爾比2～10:0～15:15～0混合，并加入0.1wt.％～0.5wt.％的EDGMA作為交聯(lián)劑。

③水相與油相混合、通氮氣驅(qū)氧并攪拌10～30min，然后逐滴加入0.5％～1.0％v/v濃度為0.5wt.％～5.0wt.％的過硫酸鉀作為引發(fā)劑，并于60～80℃下回流反應(yīng)30min～12h，然后磁分離得到固體產(chǎn)物。

④使用40％～75％乙醇洗去固體產(chǎn)物中殘余未聚合的單體，得到納米磁性微球。

步驟C為：外加磁場回收固定化HPL，然后去除上清液，之后向固定化HPL中加入半胱氨酸猝滅多余的環(huán)氧基團(tuán)，半胱氨酸的添加量為摩爾比GMA:-NH₂＝1:0.01～0.1。

步驟B所述固定化介質(zhì)為：含1～5mM DTT及質(zhì)量濃度0.1％～0.5％Triton X-100的PBS，PBS的濃度為0.1～1.0M，pH為6.0～7.5。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

1)本發(fā)明制備的納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶具有較高的酶活力及穩(wěn)定性。

2)本發(fā)明制備的納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶在反應(yīng)結(jié)束后易于從反應(yīng)體系中分離出來，實現(xiàn)固定化酶的重復(fù)利用。

附圖說明

下面附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解。

圖1是本發(fā)明制備的納米磁性微球的透射電鏡圖譜；

圖2是本發(fā)明制備的納米磁性微球的粒徑分布圖；

圖3是本發(fā)明制備的納米磁性微球的紅外圖譜；

圖4是本發(fā)明制備的納米磁性微球的熱重圖譜；

圖5是本發(fā)明在不同的固定化條件下得到的納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶重復(fù)使用的相對酶活性圖。

實施實例

下面通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例僅僅是用于本發(fā)明，用于解釋本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的改進(jìn)或簡化都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

固定化HPL的酶活檢測方法為頂空氣相色譜法(HS-GC)。具體的檢測步驟如下：與分光光度檢測法相同的反應(yīng)溶液經(jīng)2min的保溫之后迅速將酶滅活。反應(yīng)產(chǎn)物使用氣相色譜儀進(jìn)行測定，即待測樣品迅速轉(zhuǎn)移至氣相頂空進(jìn)樣器，70℃下保溫平衡30min并自動進(jìn)樣?？瞻诪橹缓坞x粗酶液或固定化酶的PBS。反應(yīng)生成的產(chǎn)物的濃度通過以下公式確定：

C_s＝A_s/A₀×C₀

其中，A_s為反應(yīng)樣品峰面積；A₀為標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積；C_s為反應(yīng)樣品濃度；C₀為標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度。

1U酶活的定義為每分鐘生成1μmoL的2(E)-己烯醛所需的加酶量。

實施例1

首先制備納米微球，納米磁性微球的制備方法是將0.5g Fe₃O₄超聲至完全分散于300mL含有0.9g PVA的水溶液中制得水相部分；油相部分由0.8mol GMA、0.4mol HEMA和0.8mol MMA混合而成，并加入1.23g EDGMA作為交聯(lián)劑。水相與油相于1L四口燒瓶中混合、通氮氣驅(qū)氧并攪拌20min之后，逐滴加入3mL質(zhì)量濃度為2％的過硫酸鉀作為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑。經(jīng)過80℃回流反應(yīng)2h之后，磁分離產(chǎn)物并使用50％乙醇洗去殘余未聚合的單體，得到納米磁性微球(NMP)。

將所合成的NMP置于錐形瓶中按HPL/NMP質(zhì)量比＝40mg/g加入HPL溶液，固定化介質(zhì)為含2mM DTT及0.5wt％Triton X-100的PBS，PBS的濃度為1.0M，pH為6.0，將配好的固定化介質(zhì)加入錐形瓶中于40℃恒溫震蕩8h之后，外加磁場回收固定化HPL，去除上清液之后加入8mmol半胱氨酸猝滅多余的環(huán)氧基團(tuán)，所得產(chǎn)物用PBS(0.01M，pH 6.5)以及去離子水分別清洗2次后得到納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶，所得納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶重新懸浮于含有1mM DTT的PBS(0.01M，pH 6.5)中待用。

當(dāng)以400μM13-HPOD作為底物時，每次反應(yīng)6min，所制得的納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶經(jīng)過10次反應(yīng)依然具有原來活性的95.0％。

實施例2

首先制備納米微球，納米磁性微球的制備方法是將0.05g Fe₃O₄超聲至完全分散于100mL含有0.1g PVA的水溶液中制得水相部分；油相部分由0.2mol GMA和1.5mol HEMA混合而成，并加入1.12g EDGMA作為交聯(lián)劑。水相與油相于1L四口燒瓶中混合、通氮氣驅(qū)氧并攪拌30min之后，逐滴加入7mL濃度為5.0wt％的過硫酸鉀作為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑。經(jīng)過60℃回流反應(yīng)12h之后，磁分離產(chǎn)物并使用40％乙醇洗去殘余未聚合的單體，得到納米磁性微球(NMP)。

將所合成的NMP置于錐形瓶中按HPL/NMP質(zhì)量比＝60mg/g，加入HPL溶液，固定化介質(zhì)為含5mM DTT及0.1％Triton X-100的PBS(1.0M，pH7.5)，將配好的固定化介質(zhì)加入錐形瓶中于30℃恒溫震蕩12h之后，外加磁場回收固定化HPL，去除上清液之后加入2mmol半胱氨酸猝滅多余的環(huán)氧基團(tuán)，所得產(chǎn)物用PBS(0.01M，pH 6.5)以及去離子水分別清洗2次，得到納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶，所得納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶重新懸浮于含有1mM DTT的PBS(0.01M，pH 6.5)中待用。

所制得的酶，其性質(zhì)與實施實例1相似。

實施例3

首先制備納米微球，納米磁性微球的制備方法是將0.375g Fe₃O₄超聲至完全分散于250mL含有0.5g的水溶液中制得水相部分；油相部分由0.7mol GMA和1.5mol MMA混合而成，并加入1.18g EDGMA作為交聯(lián)劑。水相與油相于1L四口燒瓶中混合、通氮氣驅(qū)氧并攪拌25min之后，逐滴加入4mL濃度為3.0％的過硫酸鉀作為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑。經(jīng)過80℃回流反應(yīng)2h之后，磁分離產(chǎn)物并使用45％乙醇洗去殘余未聚合的單體，得到納米磁性微球(NMP)。

將所合成的NMP置于錐形瓶中按HPL/NMP質(zhì)量比＝20mg/g，加入HPL溶液，固定化介質(zhì)為含3mM DTT及0.4wt％Triton X-100的PBS(1.0M，pH 6.5)，將配好的固定化介質(zhì)加入錐形瓶中于40℃恒溫震蕩8h之后，外加磁場回收固定化HPL，去除上清液之后按加入70mmol半胱氨酸猝滅多余的環(huán)氧基團(tuán)，所得產(chǎn)物用PBS(0.01M，pH 6.5)以及去離子水分別清洗2次，得到納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶，所得納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶重新懸浮于含有1mM DTT的PBS(0.01M，pH 6.5)中待用。

所制得的酶，其性質(zhì)與實施實例1相似。

實施例4

首先制備納米微球，納米磁性微球的制備方法是將0.175g Fe₃O₄超聲至完全分散于250mL含有0.1％PVA的水溶液中制得水相部分；油相部分由0.6mol GMA、1.0mol HEMA和1.0mol MMA混合而成，并加入0.946g EDGMA作為交聯(lián)劑。水相與油相于1L四口燒瓶中混合、通氮氣驅(qū)氧并攪拌10min之后，逐滴加入1mL濃度為0.5％的過硫酸鉀作為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑。經(jīng)過60℃回流反應(yīng)0.5h之后，磁分離產(chǎn)物并使用75％乙醇洗去殘余未聚合的單體，得到納米磁性微球(NMP)。

將所合成的NMP置于錐形瓶中按HPL/NMP質(zhì)量比＝30mg/g，加入HPL溶液，固定化介質(zhì)為含1mM DTT及0.1wt％Triton X-100的PBS(0.1M，pH 7.5)，將配好的固定化介質(zhì)加入錐形瓶中于40℃恒溫震蕩8h之后，外加磁場回收固定化HPL，去除上清液之后加入30mmol半胱氨酸猝滅多余的環(huán)氧基團(tuán)，所得產(chǎn)物用PBS(0.01M，pH 6.5)以及去離子水分別清洗2次，得到納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶，所得納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶重新懸浮于含有1mM DTT的PBS(0.01M，pH 6.5)中待用。

所制得的酶，其性質(zhì)與實施實例1相似。

以實施實例1為例對合成產(chǎn)物進(jìn)行了如下性能表征

圖1是本發(fā)明制備的納米磁性微球的透射電鏡圖譜，通過TEM可以觀察到所合成的NMP-HPL為球形結(jié)構(gòu)且表面較為光滑，分散性比較好，基本為單層分散并且不易聚集。

圖2是本發(fā)明制備的納米磁性微球的粒徑分布圖。其粒徑大多在200-300nm，平均粒徑274.58nm。

圖3為本發(fā)明制備的納米磁性微球的紅外圖譜，可以看出，1270，923以及839cm^-1的吸收峰為環(huán)氧基團(tuán)的伸縮振動，3428,1724和1163cm^-1的吸收峰分別為GMA、HEMA和MMA中羰基和酯基中-OH、C＝O、C-O的伸縮振動，由此可以證實確實在Fe₃O₄磁流體的外部包覆著一層油狀GMA、HEMA和MMA的聚合物。

圖4為本發(fā)明制備的納米磁性微球的熱重圖譜，可以看出，合成的磁性微球在100℃左右失去游離水和結(jié)合水，因此該磁性微球在100℃一下都是穩(wěn)定的，同時，根據(jù)失重率可以算出磁性微球的含水量較高為70％。

圖5是本發(fā)明在不同的固定化條件下得到的納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶重復(fù)使用的相對酶活性圖，其中標(biāo)注線(1)、(2)、(3)為13-HPOD，未標(biāo)注線為13-HPOT。可以看出，使用納米磁性微球固定化氫過氧化物裂解酶對13-HPOD具有較高的可重復(fù)使用性，重復(fù)使用10次后，最低相對酶活力仍然有75％以上，在其他條件不變的情況下，相對于選用NaCl作為固定化介質(zhì)，選用PBS作為固定化介質(zhì)時，固定化后的HPL酶具有更高的酶活力。