本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中L-DNA/L-RNA聚合酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

L-DNA和L-RNA是非天然的分子，L-DNA和L-RNA是分別與天然的D-DNA和D-RNA互為鏡像關(guān)系的對(duì)映異構(gòu)體。另外，由于在生命體中沒(méi)有可以降解L-DNA和L-RNA物質(zhì)的系統(tǒng)，所以在生理環(huán)境中有比天然DNA和RNA更長(zhǎng)的半衰期。已經(jīng)有研究組和公司在嘗試使用L-DNA和L-RNA做成靶向生物藥，用于治療疾病。鏡像核酸藥物可能的作用機(jī)理為結(jié)合特定的蛋白結(jié)構(gòu)或者進(jìn)行mRNA的剪切。

D-DNA的合成和擴(kuò)增通常有固相亞磷酸酰胺法(多數(shù)DNA合成儀所用方法)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(PCR)。由于L-DNA和L-RNA的特殊性，現(xiàn)有的方法是不依賴聚合酶的固相合成方法，目前只能用化學(xué)方法來(lái)合成，尤其是L-RNA的合成非常困難，高成本、鏈長(zhǎng)度受限制。而且如果用同樣的自動(dòng)化儀器合成L型和D型的核苷酸，還面臨兩種手性相互污染的問(wèn)題。

脫氧核酶(DNAzyme)用于描述具有催化活性的DNA，即化學(xué)本質(zhì)是脫氧核糖核酸(DNA),卻具有酶的催化功能。DNAzyme的作用底物可以是不同的DNA分子或是同一DNA分子中的某些部位。脫氧核酶的功能很多,有的能夠切割RNA,有的能夠切割DNA等。與蛋白質(zhì)酶相比，脫氧核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。根據(jù)催化功能的不同，可以將脫氧核酶分為5大類：切割RNA的脫氧核酶、切割DNA的脫氧核酶、具有激酶活力的脫氧核酶、具有連接酶功能的脫氧核酶、催化卟啉環(huán)金屬螯合反應(yīng)的脫氧核酶。其中以對(duì)RNA切割活性的脫氧核酶更引人注意，不僅能催化RNA特定部位的切割反應(yīng)，而且能從mRNA水平對(duì)基因進(jìn)行滅活，從而調(diào)控蛋白的表達(dá)。對(duì)于脫氧核酶的研究有望成為基因功能研究、核酸突變分析、治療腫瘤、對(duì)抗病毒及腫瘤等疾病的新型基因治療藥物的新型核酸工具酶。

非洲豬瘟病毒(ASFV)是一種雙鏈DNA病毒，屬虹彩病毒科。它廣泛地分布在非洲、伊比利亞半島和加勒比地區(qū)，能夠感染家養(yǎng)的豬，并且導(dǎo)致嚴(yán)重致命的疾病。非洲豬瘟病毒的直徑為175-215納米，有囊膜包裹?；蚪M組大小在168-189kb，編碼150多種多肽和蛋白，包括用于轉(zhuǎn)錄、蛋白修飾、DNA復(fù)制和修復(fù)等目的的很多種酶類。

ASFV編碼兩種DNA聚合酶，一種是真核類型的family B的DNA聚合酶，用于病毒基因組的復(fù)制；還有一種是family X的DNA聚合酶，被命名為ASFV Pol X。ASFV Pol X是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的最小的DNA聚合酶，由174個(gè)氨基酸組成，大小為20kDa。ASFV Pol X是模板依賴的聚合酶，保真度很低，缺少3’-5’外切酶活性，對(duì)于雙脫氧核苷酸的 識(shí)別能力較差。經(jīng)研究證實(shí)，ASFV Pol X還具有利用rNTPs合成RNA的能力。

將ASFV Pol X的基因序列和其他代表性的family X的聚合酶進(jìn)行比對(duì)(Oliveros M等，1997)，可以看到ASFV Pol X和人、牛、鼠的TdT、人、鼠polβ等在結(jié)構(gòu)和功能上有一定的聯(lián)系。Pol X和其它聚合酶不一樣，它只具有一個(gè)palm結(jié)構(gòu)和一個(gè)C端子域。在真核的Polβ中，一般還有一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)DNA結(jié)合。Pol X沒(méi)有這個(gè)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域，結(jié)合DNA的能力卻強(qiáng)于Polβ。另外，ASFV Pol X可以結(jié)合單個(gè)核苷酸剪切修復(fù)(BER)的中間產(chǎn)物，并且可以高效地修復(fù)單個(gè)核苷酸缺口。BER的步驟中，Pol X修復(fù)缺口并且很容易引入突變。在最后一步再由一種ASFV編碼的一種容錯(cuò)連接酶把帶有錯(cuò)配的新合成鏈連入基因組。Pol X在修復(fù)基因組時(shí)將新的突變引入，有助于病毒變異的產(chǎn)生，以便在有生存壓力的環(huán)境中存活下來(lái)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何化學(xué)合成L-DNA和L-RNA。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了可用于合成L-DNA和L-RNA的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有催化L-dNTPs聚合得到L-DNA的L-DNA聚合酶功能以及催化L-rNTPs聚合得到L-RNA的L-RNA聚合酶功能。

DNA聚合酶是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶。以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具備模板、引物、dNTP等的情況下)及其相輔的活性。RNA聚合酶是以一條DNA鏈或RNA為模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶，是催化以DNA為模板、三磷酸核糖核苷為底物、通過(guò)磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶。所述L-DNA聚合酶是可以催化L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP聚合得到L型DNA的酶；所述L-RNA聚合酶是可以催化L-ATP、L-UTP、L-CTP和L-GTP聚合得到L型RNA的酶。

本發(fā)明所提供的可用于L-DNA和L-RNA合成的蛋白質(zhì)，其名稱為D-ASFV Pol X，所述蛋白質(zhì)由甘氨酸和非甘氨酸連接而成(即所述蛋白質(zhì)由甘氨酸殘基和非甘氨酸殘基組成)，所述非甘氨酸均為D型氨基酸；所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列1所示。D-ASFV Pol X與非洲豬瘟病毒(ASFV)的ASFV Pol X互為鏡像關(guān)系，D-ASFV Pol X與ASFV Pol X中除甘氨酸外對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基都互為對(duì)映異構(gòu)體，ASFV Pol X的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

其中，序列1由174個(gè)氨基酸組成。所述D型氨基酸分別為D型丙氨酸、D型精氨酸、D型天冬酰胺、D型天冬氨酸、D型半胱氨酸、D型谷氨酰胺、D型谷氨酸、D型組氨酸、D型異亮氨酸、D型亮氨酸、D型賴氨酸、D型甲硫氨酸、D型苯丙氨酸、D型脯氨酸、D型絲氨酸、D型蘇氨酸、D型色氨酸、D型酪氨酸和D型纈氨酸。

上述蛋白質(zhì)中第81位D型半胱氨酸的硫與第86位D型半胱氨酸的硫可通過(guò)二硫 鍵相連。

上述蛋白質(zhì)按照可如下蛋白質(zhì)的制備方法制備：

1)將甘氨酸和所述D型氨基酸進(jìn)行連接得到序列1所示的D-多肽；

2)將所述序列1所示的D-多肽進(jìn)行折疊復(fù)性得到所述蛋白質(zhì)。

上述蛋白質(zhì)中，所述將甘氨酸和所述D型氨基酸進(jìn)行連接可選擇利用逐步合成法、片段組合法、自然化學(xué)連接法、化學(xué)選擇性連接法(如半胱氨酸肽片段連接方法)或定向拼接法進(jìn)行氨基酸或肽段的連接(黃永東等，2004；李娟等，2007)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述序列1所示的D-多肽通過(guò)連接(自然化學(xué)連接法)序列1的第1-85位氨基酸所示的D-多肽的羧基與序列1的第86-174位氨基酸所示的D-多肽的氨基得到。所述序列1的第86-174位氨基酸所示的D-多肽利用半胱氨酸肽片段連接方法制備得到，具體為按照如下A1)和A2)制備：A1)連接序列2的第1-20位氨基酸所示的D-多肽的羧基與序列2的第21-89位氨基酸所示的D-多肽的氨基得到序列2所示的D-多肽；A2)將所述序列2所示的D-多肽的第21位的D-半胱氨酸突變?yōu)镈-丙氨酸得到所述序列1的第86-174位氨基酸所示的D-多肽。

其中，序列2由89個(gè)氨基酸組成，序列2與序列1第86-174位的區(qū)別僅在于序列2為將序列1第86-174位的第106位的丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬玫降男蛄小Ｋ鯠-多肽均為由甘氨酸和所述D型氨基酸組成的D型肽段。

上述蛋白質(zhì)中，所述2)可包括：

21)將所述序列1所示的D-多肽按照鹽酸胍濃度從高到低的順序依次在不同濃度的鹽酸胍溶液中進(jìn)行透析得到鹽酸胍溶液透析蛋白質(zhì)；

所述不同濃度的鹽酸胍溶液由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)為鹽酸胍，所述鹽酸胍溶液中所述鹽酸胍的濃度大于0小于等于6M；所述溶劑為透析溶液，所述透析溶液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為Tris-HCl緩沖液，所述溶質(zhì)及其濃度分別為40mM KCl、6mM醋酸鎂、0.01M EDTA和16％(體積百分比濃度)甘油；所述Tris-HCl緩沖液的溶質(zhì)為Tris堿和HCl，溶劑為水，所述Tris-HCl緩沖液中Tris堿的含量為50mM，所述Tris-HCl緩沖液的pH為7.0，所述HCl是以加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值的形式加入的；

22)將所述鹽酸胍溶液透析蛋白質(zhì)在所述透析溶液中進(jìn)行透析得到所述蛋白質(zhì)。

上述蛋白質(zhì)中，所述不同濃度的鹽酸胍溶液具體可為鹽酸胍濃度分別為6M、4M、2M和1M的鹽酸胍溶液。所述透析的時(shí)間均可為5-15小時(shí)，如10小時(shí)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述序列1所示的D-多肽依次在鹽酸胍濃度分別為6M、4M、2M和1M的鹽酸胍溶液與所述透析溶液中進(jìn)行透析得到所述蛋白質(zhì)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)的制備方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)在作為L(zhǎng)-DNA聚合酶或L-RNA 聚合酶中的應(yīng)用。

所述L-DNA聚合酶是可以催化L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP聚合得到L型DNA的酶；所述L-RNA聚合酶是可以催化L-ATP、L-UTP、L-CTP和L-GTP聚合得到L型RNA的酶。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了L-DNA的制備方法

本發(fā)明所提供的L-DNA的制備方法，包括以目的L-DNA為模板，以L-dNTPs為原料，以所述蛋白質(zhì)作為L(zhǎng)-DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)得到L-DNA。

上述L-DNA的制備方法中，所述反應(yīng)可在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行。所述反應(yīng)包括制備L-DNA所需的各種試劑，如所述蛋白質(zhì)、模板、L-dNTPs、引物以及制備L-DNA所需的其他試劑。制備L-DNA所需的其他試劑可為反應(yīng)緩沖液；所述反應(yīng)緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水，所述溶質(zhì)及其濃度分別為500mM Tris-HCl，200mM MgCl₂，10mM DTT和500mM KCl，所述反應(yīng)緩沖液的pH為7.5。

上述L-DNA的制備方法中，所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度可為37℃。所述反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)目的L-DNA的長(zhǎng)度來(lái)確定，如2小時(shí)。所述反應(yīng)可通過(guò)EDTA終止。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了L-RNA的制備方法。

本發(fā)明所提供的L-RNA的制備方法，包括以目的L-RNA為模板，以L-rNTPs為原料，以所述蛋白質(zhì)作為L(zhǎng)-DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)得到L-RNA。

上述L-RNA的制備方法中，所述反應(yīng)可在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行。所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度可為37℃。所述反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)目的L-RNA的長(zhǎng)度來(lái)確定，如2小時(shí)。所述反應(yīng)可通過(guò)EDTA終止。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了制備L-DNA的系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的制備L-DNA的系統(tǒng)，包括制備L-DNA所需的試劑和/或儀器。具體來(lái)說(shuō)，制備L-DNA所需的試劑可包括所述蛋白質(zhì)、制備L-DNA所需的其他試劑和/或儀器。所述其他試劑可包括L-dNTPs、所述反應(yīng)緩沖液、模板和/或引物。

所述制備L-DNA所需的試劑可只由所述蛋白質(zhì)、所述L-dNTPs和所述反應(yīng)緩沖液這三種組成，也可只由所述蛋白質(zhì)和所述L-dNTPs組成，也可只由所述蛋白質(zhì)和所述反應(yīng)緩沖液組成。所述蛋白質(zhì)、所述L-dNTPs、所述反應(yīng)緩沖液和制備L-DNA所需的其他試劑均可獨(dú)立包裝。制備L-DNA所需的其他試劑可為EDTA。

制備L-DNA所需的儀器可為為制備L-DNA的反應(yīng)體系提供恒溫環(huán)境或提供定時(shí)恒溫環(huán)境的儀器，如PCR儀或恒溫儀。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了制備L-RNA的系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的制備L-RNA的系統(tǒng)，包括制備L-RNA所需的試劑和/或儀器。具體來(lái)說(shuō)，制備L-RNA所需的試劑可包括所述蛋白質(zhì)、制備L-RNA所需的其他試劑和/或儀 器。所述制備L-RNA所需的其他試劑可包括L-rNTPs、所述反應(yīng)緩沖液、模板和/或引物。

所述制備L-RNA所需的試劑可只由所述蛋白質(zhì)、所述L-rNTPs和所述反應(yīng)緩沖液這三種組成，也可只由所述蛋白質(zhì)和所述L-rNTPs組成，也可只由所述蛋白質(zhì)和所述反應(yīng)緩沖液組成。所述蛋白質(zhì)、所述L-rNTPs、所述反應(yīng)緩沖液和制備L-RNA所需的其他試劑均可獨(dú)立包裝。制備L-RNA所需的其他試劑可為EDTA。

制備L-RNA所需的儀器可為為制備L-RNA的反應(yīng)體系提供恒溫環(huán)境或提供定時(shí)恒溫環(huán)境的儀器，如PCR儀或恒溫儀。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述P1-P3中任一產(chǎn)品：

P1、利用所述蛋白質(zhì)作為L(zhǎng)-DNA或L-RNA聚合酶制備的產(chǎn)品；

P2、利用所述L-DNA的制備方法或所述L-RNA的制備方法制備的產(chǎn)品；

P3、利用所述制備L-DNA的系統(tǒng)或所述制備L-RNA的系統(tǒng)制備的產(chǎn)品；

所述產(chǎn)品為L(zhǎng)-DNA或L-RNA。

上述產(chǎn)品可為如下a1)或a2)或a3)的L-DNA：

a1)核苷酸序列為序列表中序列4的第1-56位核苷酸的L-DNA；

a2)核苷酸序列為序列表中序列4的第13-56位核苷酸的L-DNA；

a3)在a2)的L-DNA兩端添加一個(gè)或幾個(gè)脫氧核苷酸和/或L型脫氧核苷酸得到的具有脫氧核酶功能的由a2)衍生的L-DNA。

上述產(chǎn)品中，所述L型脫氧核苷酸可為L(zhǎng)-dATP、L-dTTP、L-dCTP或L-dGTP；所述脫氧核苷酸可為dATP、dTTP、dCTP或dGTP。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述產(chǎn)品為在序列4的第13-56位核苷酸所示的L-DNA的5′端添加序列4的第1-12位核苷酸序列所示的L-DNA得到的L-DNAzyme。

本發(fā)明中，所述L-dNTPs由L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP組成；所述L-rNTPs由L-ATP、L-UTP、L-CTP和L-GTP組成。所述L-dNTPs具體可為美國(guó)chemgenes公司產(chǎn)品，所述L-rNTPs具體可為美國(guó)chemgenes公司產(chǎn)品。

實(shí)驗(yàn)證明，發(fā)明人合成了與來(lái)源于ASFV的ASFV pol X互為鏡像關(guān)系的D-ASFV pol X，D-ASFV pol X可以以目的L-DNA為模板，以L-dNTPs(L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP)為原料，催化L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP聚合為L(zhǎng)-DNA，還可以以目的L-RNA為模板，以L-rNTPs(L-ATP、L-UTP、L-CTP和L-GTP)為原料，催化L-ATP、L-UTP、L-CTP和L-GTP聚合為L(zhǎng)-RNA。實(shí)驗(yàn)證明，在以L-DNA型DNAzyme為模板時(shí)，利用D-ASFV pol X合成的L-DNAzyme具有自我剪切活性，表明利用D-ASFV pol X可以合成具有功能的L-DNA。

發(fā)明人通過(guò)化學(xué)合成D-ASFV pol X，首次實(shí)現(xiàn)了L-DNA和L-RNA的酶合成，而且 效率高，產(chǎn)物純度好，不需要昂貴的合成儀。

附圖說(shuō)明

圖1為序列1所示的D-多肽的合成路線。其中，1表示D-多肽1，2表示首位半胱氨酸被乙酰胺甲基(Acm)保護(hù)的D-多肽2，3表示首位半胱氨酸被乙酰胺甲基(Acm)保護(hù)的D-多肽3，4表示首位半胱氨酸被乙酰胺甲基(Acm)保護(hù)的D-多肽4，5表示D-多肽4，6表示D-多肽5，7表示序列1所示的D-多肽。

圖2為D-ASFV pol X與來(lái)源于ASFV的ASFV pol X互為鏡像關(guān)系。其中，L-ASFV pol X表示來(lái)源于ASFV的ASFV pol X。

圖3為合成L-DNA時(shí)不同反應(yīng)時(shí)間的產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。

圖4為合成L-RNA時(shí)不同反應(yīng)時(shí)間的產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。

圖5為合成L-DNAzyme時(shí)不同反應(yīng)時(shí)間的產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。

圖6為利用D-ASFV pol X合成的L-DNAzyme的自我剪切活性的檢測(cè)結(jié)果。其中，泳道1為在Zn²⁺離子存在下L-DNAzyme的自我剪切活性的檢測(cè)結(jié)果；泳道2為未進(jìn)行自我剪切的L-DNAzyme。

圖7為L(zhǎng)-DNAzyme的結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的不同濃度的鹽酸胍溶液均由溶質(zhì)和溶劑組成；溶質(zhì)均為鹽酸胍；溶劑為透析溶液，透析溶液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為Tris-HCl緩沖液，溶質(zhì)及其濃度分別為40mM KCl、6mM醋酸鎂、0.01M EDTA和16％(體積百分比濃度)甘油；Tris-HCl緩沖液的溶質(zhì)為Tris堿和HCl，溶劑為水，Tris-HCl緩沖液中Tris堿的含量為50mM，Tris-HCl緩沖液的pH為7.0，HCl是以加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值的形式加入的。

下述實(shí)施例中的反應(yīng)緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為Tris-HCl緩沖液1，溶質(zhì)及其濃度分別為200mM MgCl₂、10mM DTT和500mM KCl；Tris-HCl緩沖液1的溶質(zhì)為Tris堿和HCl，溶劑為水，Tris-HCl緩沖液中Tris堿的含量為500mM，Tris-HCl緩沖液的pH為7.5，HCl是以加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值的形式加入的。

下述實(shí)施例中的D-氨基酸為9-芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)基保護(hù)的D-氨基酸，為希施生物科技(上海)有限公司產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate)、HOAT(1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑、N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(1-hydroxy-7-azabenzotriazole)和HOBT(1-羥基-苯并-三氮唑(1-hydroxy-benzotriazole)均為吉爾生化(上海)有限公司產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺(N,N’-Di isopropyl-carbodi imide(DIC))和4-巰基苯乙酸(1,2-ethanedithiol and 4-mercaptophenylacetic acid(MPAA))為阿法埃莎(Alfa Aesar)產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide(DMF)為北京化工廠產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的2-Cl-trityl-Cl樹(shù)脂(2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂(2CTC)，取代度為0.53mmol/g)為天津南開(kāi)合成科技有限公司產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的VA-044為青島柯信新材料科技有限公司產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的肼取代的2CTC樹(shù)脂為天津南開(kāi)合成有限公司產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的N,N-二異丙基乙基胺為北京偶合科技有限公司產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的切割試劑K(三氟乙酸/苯酚/水/茴香硫醚/乙二硫醇＝82.5/5/5/5/2.5)為將三氟乙酸、苯酚、水、茴香硫醚和乙二硫醇按照82.5：5：5：5：2.5的體積比混合得到的混合物。其中，三氟乙酸、苯酚、茴香硫醚以及乙二硫醇均為百靈威科技有限公司產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的磷酸三氯乙酯(TCEP)緩沖液均為向去離子水中加入磷酸三氯乙酯得到的溶液；其中磷酸三氯乙酯為阿達(dá)瑪斯試劑有限公司產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的還原型谷胱甘肽為阿達(dá)瑪斯試劑有限公司產(chǎn)品。

實(shí)施例1、L-DNA/L-RNA聚合酶的制備

本發(fā)明將來(lái)自于非洲豬瘟病毒(ASFV)的ASFV Pol X中的L-氨基酸全部替換為對(duì)應(yīng)的D-氨基酸，得到具有催化L-dNTPs合成L-DNA的L-DNA聚合酶功能以及催化L-rNTPs合成L-RNA的L-RNA聚合酶功能的蛋白質(zhì)，將該蛋白質(zhì)命名為D-ASFV Pol X，D-ASFV Pol X與ASFV Pol X的氨基酸序列均為序列表中序列1。

D-ASFV Pol X的制備如圖1所示，首先合成三條D-多肽，然后采取從C段到N端順序連接及脫硫反應(yīng)得到D-ASFV Pol X。這三條D-多肽分別為序列2的第21-89位氨基酸所示的D-多肽(將其命名為D-多肽1)，序列2的第1-20位氨基酸所示的D-多肽(將其命名為D-多肽2)，序列1的第1-85位氨基酸所示的D-多肽(將其命名為D-多肽5)。將D-多肽1的N端D-半胱氨酸與D-多肽2的C端進(jìn)行連接，得到序列2所示的D-多肽3；將D-多肽3的第21位的D-半胱氨酸進(jìn)行脫硫反應(yīng)，得到序列1的第86-174位氨基酸所示的D-多肽4；將D-多肽4的N端D-半胱氨酸與D-多肽 5的C端進(jìn)行連接，得到序列1所示的D-多肽；將序列1所示的D-多肽進(jìn)行折疊復(fù)性得到D-ASFV Pol X。序列1由174個(gè)氨基酸殘基組成，序列2由89個(gè)核苷酸組成，序列2與序列1第86-174位的區(qū)別僅在于序列2為將序列1第86-174位的第106位的丙氨酸殘基突變?yōu)榘腚装彼釟埢玫降男蛄小?/p>

D-ASFV Pol X的具體制備方法如下：

1、D-多肽1、D-多肽2和D-多肽5的合成

D-多肽1、D-多肽2和D-多肽5的合成均采用基于9-芴甲氧羰基(Fmoc)為保護(hù)基策略的固相多肽合成法(Fmoc-SPPS)。D-多肽1的合成采用的是2-Cl-trityl-Cl樹(shù)脂(2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂(2CTC)，取代度為0.53mmol/g)，D-多肽2和D-多肽5的合成使用的是肼取代的2CTC樹(shù)脂。

首先將400mg樹(shù)脂(取代量為0.21mmol)在二氯甲烷(DCM)以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液中溶脹半小時(shí)，然后除去溶劑。

隨后，對(duì)于D-多肽1，按照下述方法從C端到N端依次增加D-氨基酸完成肽鏈的延長(zhǎng)直至得到D-多肽1：將5ml溶有1mmol D-氨基酸和2mmol N,N-二異丙基乙基胺的DMF溶液加入到反應(yīng)管中，在30℃的恒溫?fù)u床內(nèi)反應(yīng)12小時(shí)，之后加入200μL甲醇，封閉未反應(yīng)的活性氯。多肽片段合成過(guò)程中，脫去Fmoc保護(hù)基的方法是使用含有20％哌啶的DMF溶液，浸泡兩次，一次5分鐘，另一次10分鐘。從第二個(gè)氨基酸開(kāi)始直到最后，縮合體系都使用的是HATU/HOAT/DIEA，其中1mmol D-氨基酸進(jìn)行縮合反應(yīng)時(shí)使用0.8mmol HATU、0.8mmol HOAT和2mmol DIEA。

對(duì)于D-多肽2和D-多肽5按照下述方法從C端到N端依次增加D-氨基酸完成肽鏈的延長(zhǎng)直至得到D-多肽2和D-多肽5：將5ml溶有1mmol D-氨基酸、0.8mmol HATU、0.8mmol HOAT和2mmol DIEA的DMF溶液加入到反應(yīng)管中，在30℃的恒溫?fù)u床內(nèi)反應(yīng)1小時(shí)。多肽片段合成過(guò)程中，脫去Fmoc保護(hù)基的方法是使用含有20％哌啶的DMF溶液，浸泡兩次，一次5分鐘，另一次10分鐘。從第二個(gè)氨基酸開(kāi)始直到最后，縮合體系都使用的是HATU/HOAT/DIEA，其中1mmol D-氨基酸進(jìn)行縮合反應(yīng)時(shí)使用0.8mmol HATU、0.8mmol HOAT和2mmol DIEA。

多肽片段合成完畢后，使用切割試劑K(三氟乙酸/苯酚/水/茴香硫醚/乙二硫醇＝82.5/5/5/5/2.5)浸泡3小時(shí)，然后用高純氮?dú)獬ト宜釋Ⅲw系濃縮，隨后加入乙醚，使多肽沉淀出來(lái)，最后離心，收集固體沉淀，使用半制備級(jí)別的反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化目標(biāo)多肽片段，分別得到D-多肽1、首位半胱氨酸被乙酰胺甲基(Acm)保護(hù)的D-多肽2和D-多肽5。

2、D-多肽的制備

按照以下方法進(jìn)行D-多肽的化學(xué)連接：首先將1μmol含有酰肼基團(tuán)的步驟1的 D-多肽2溶于0.2ml緩沖液中(緩沖液中含有6M鹽酸胍和200mM磷酸氫二鈉，pH 3.0)。在冰鹽浴中，往反應(yīng)液中加入15μmol的NaNO₂，反應(yīng)20分鐘。隨后加入0.2ml混有40μmol 4-巰基苯乙酸(MPAA)和1μmol的步驟1的D-多肽1、pH值為7.0的緩沖溶液。攪拌均勻后，將體系的pH值調(diào)至7.0，反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入0.5ml 80mM磷酸三氯乙酯(TCEP)緩沖液，將體系濃度稀釋一倍。最后使用半制備級(jí)別的RP-HPLC分離目標(biāo)產(chǎn)物，得到首位半胱氨酸被乙酰胺甲基(Acm)保護(hù)的序列2所示的D-多肽3。

按照以下方法進(jìn)行多肽的脫硫反應(yīng)：首先將1μmol上述首位半胱氨酸被乙酰胺甲基(Acm)保護(hù)的序列2所示的D-多肽3溶于2.5ml 200mM TCEP緩沖溶液(該TCEP緩沖溶液含有6M鹽酸胍和0.2M磷酸氫二鈉，pH＝6.9)中，然后加入50μmol VA-044和100μmol還原型谷胱甘肽，在37℃下反應(yīng)12小時(shí)。最后用半制備級(jí)別的RP-HPLC分離純化，得到首位半胱氨酸被乙酰胺甲基(Acm)保護(hù)的序列1的第86-174位所示的D-多肽4。

按照以下方法脫除首位半胱氨酸被乙酰胺甲基(Acm)保護(hù)的D-多肽4的保護(hù)基：0.5μmol首位半胱氨酸被乙酰胺甲基(Acm)保護(hù)的D-多肽4溶于1ml 50％醋酸水溶液中。然后加入5mg醋酸銀，在30℃下攪拌過(guò)夜。隨后加入2.5mmol巰基乙醇，并且用6M鹽酸胍水溶液將體系稀釋2倍。通過(guò)離心，除去沉淀，用RP-HPLC分離上清液，得到序列1的第86-174位所示的D-多肽4。

按照上述D-多肽的化學(xué)連接的方法，將含有酰肼基團(tuán)的步驟1的D-多肽2替換為含有酰肼基團(tuán)的步驟1的D-多肽5，將步驟1的D-多肽1替換為上述D-多肽4，其他步驟均不變，得到序列1所示的D-多肽。

3、D-多肽的折疊復(fù)性

按照以下方法對(duì)步驟2的序列1所示的D-多肽進(jìn)行折疊復(fù)性。將5mg序列1所示的D-多肽溶于10ml鹽酸胍濃度為6M的鹽酸胍溶液中，將溶液置于3K Da的透析袋。然后把透析袋放在鹽酸胍濃度為4M的鹽酸胍溶液中浸泡10小時(shí)，隨后將鹽酸胍溶液中鹽酸胍濃度逐漸降低為2M、1M和0M。透析袋在每種濃度鹽酸胍溶液中浸泡時(shí)間均為10小時(shí)，得到D-ASFV pol X。使用圓二色譜對(duì)D-ASFV pol X進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)D-ASFV pol X與來(lái)源于ASFV的ASFV pol X互為鏡像關(guān)系(圖2)，利用質(zhì)譜對(duì)D-ASFV pol X的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)，D-ASFV pol X的D-Cys⁸¹和D-Cys⁸⁶之間形成二硫鍵。

實(shí)施例2、L-DNA和L-RNA的合成

1、利用實(shí)施例1的D-ASFV pol X制備L-DNA

在含有如下物質(zhì)的反應(yīng)體系中制備L-DNA：1μl反應(yīng)緩沖液、實(shí)施例1的D-ASFV pol X、L-dNTPs(Chemgenes產(chǎn)品)、用來(lái)合成L-DNA的模板(模板由Chemgenes公 司定制合成，模板序列為5'-CTCAGTCGCGTTCGTAGT，該模板由L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP組成)以及擴(kuò)增該L-DNA的引物(引物由Chemgenes公司定制合成，引物序列為5’-ACTACGAACGCG，該引物由L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP組成)，10μl的反應(yīng)體系中，D-ASFV pol X的濃度為2.5×10^-3U/μl，引物的濃度為2.5μM，模板的濃度為2.5μM，L-dNTPs的L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP的濃度均為0.2mM，用去離子水補(bǔ)足10μl。將該10μl的反應(yīng)體系置于37℃下孵育2小時(shí)，加入0.5M的EDTA溶液1μl終止反應(yīng)，得到2小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物。

按照上述方法，將2小時(shí)分別替換為0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)，其他步驟均不變，分別得到0小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物、0.5小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物、1小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物、3小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物和4小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物。

對(duì)上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PAGE電泳檢測(cè)(圖3)，結(jié)果顯示，以目的L-DNA為模板，以L-dNTPs為原料時(shí)，D-ASFV pol X可作為L(zhǎng)-DNA聚合酶催化底物進(jìn)行聚合反應(yīng)得到L-DNA，在該反應(yīng)體系下得到與模板相同的L-DNA最短需要2小時(shí)。圖3中顯示，在只有一條引物時(shí)，聚合反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間時(shí)可以得到不同長(zhǎng)度的L-DNA片段(每個(gè)泳道中相鄰的兩條帶表示相差一個(gè)核苷酸的兩個(gè)L-DNA)，與模板相同的L-DNA隨反應(yīng)時(shí)間的增加而逐漸增加。

2、利用實(shí)施例1的D-ASFV pol X制備L-RNA

在含有如下物質(zhì)的反應(yīng)體系中制備L-RNA：1μl反應(yīng)緩沖液、實(shí)施例1的D-ASFV pol X、L-rNTPs(Chemgenes產(chǎn)品)、用來(lái)合成L-RNA的模板(模板由Chemgenes公司定制合成，模板序列為5'-CTCAGTCGCGTTCGTAGT，該模板由L-ATP、L-UTP、L-CTP和L-GTP組成)以及擴(kuò)增該L-RNA的引物(由Chemgenes產(chǎn)品Chemgenes公司定制合成，引物序列為5’-ACTACGAACGCG，該引物由L-ATP、L-UTP、L-CTP和L-GTP組成)，10μl的反應(yīng)體系中，D-ASFV pol X的濃度為0.2×10^-3U/μl，引物的濃度為2.5μM，模板的濃度為2.5μM，L-rNTPs的L-ATP、L-UTP、L-CTP和L-GTP的濃度均為0.2mM，用去離子水補(bǔ)足10μl。將該反應(yīng)體系置于37℃下孵育12小時(shí)，加入0.5M的EDTA溶液1μl終止反應(yīng)，得到36小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物。

按照上述方法，將2小時(shí)分別替換為0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)、7小時(shí)和60小時(shí)，其他步驟均不變，分別得到0小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物、1小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物、3小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物、5小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物、7小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物和60小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物。

對(duì)上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PAGE電泳檢測(cè)(圖4)，結(jié)果顯示，以目的L-RNA為模板，以L-rNTPs為原料時(shí)，D-ASFV pol X可作為L(zhǎng)-RNA聚合酶催化底物進(jìn)行聚合反應(yīng)得到L-RNA，在該反應(yīng)體系下得到與模板相同的L-RNA最短需要36小時(shí)。圖4中顯示，在只有一條引物時(shí)，聚合反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間時(shí)可以得到不同長(zhǎng)度的L-RNA片段(每個(gè)泳 道中相鄰的兩條帶表示相差一個(gè)核苷酸的兩個(gè)L-RNA)，與模板相同的L-RNA隨反應(yīng)時(shí)間的增加而逐漸增加。

實(shí)施例3、利用實(shí)施例1的D-ASFV pol X合成DNAzyme

DNAzyme是具有自我剪切活性的DNA短鏈。發(fā)明人利用實(shí)施例1的D-ASFV pol X合成了具有功能的是L型的DNAzyme(圖7)，將其命名為L(zhǎng)-DNAzyme，L-DNAzyme與常見(jiàn)的D型的DNAzyme互為鏡像對(duì)映異構(gòu)體。L-DNAzyme的序列如序列表中序列4的第13-56位核苷酸所示，具體合成方法如下：

100μl的L-DNAzyme合成體系包含下述物質(zhì)：10μl反應(yīng)緩沖液、、實(shí)施例1的D-ASFV pol X、L-dNTPs(Chemgenes產(chǎn)品)、DNAzyme模板(模板由Chemgenes公司定制合成，模板序列為序列表中序列3，該模板由L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP組成)以及擴(kuò)增該DNAzyme的引物(由Chemgenes定制合成，引物序列為5’-ACTACGAACGCG，該引物由L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP組成)，該100μl反應(yīng)體系中D-ASFV pol X的濃度為2.5×10^-3U/μl，引物的濃度為5μM，模板的濃度為5μM，L-dNTPs的L-dATP、L-dTTP、L-dCTP和L-dGTP的濃度均為0.4mM，用去離子水補(bǔ)足100μl。

分別配制上述100μl的L-DNAzyme合成體系4個(gè)，將這4個(gè)反應(yīng)體系分別在37℃下孵育0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)，得到0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入上樣緩沖液后，用12％PAGE膠在300V下電泳3小時(shí)(圖5)。結(jié)果顯示，36小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物中含有目的L-DNA片段。用溴化乙錠處理電泳結(jié)束后的12％PAGE膠進(jìn)行L-DNA染色，在UV光下把大小正確的目的L-DNA片段(即序列表中序列4的第1-56位核苷酸所示的L-DNAzyme)切下，棄去雜帶和空白的區(qū)域，切割的膠塊應(yīng)該盡量小。然后將膠塊放在TE緩沖液中，顛倒混合過(guò)夜。小心吸取上清液，向上清液中加入1/10體積的乙酸鈉溶液(乙酸鈉濃度為3mol/L，PH＝5.2)充分混勻，使乙酸鈉的最終濃度為0.3mol/L。加入2倍體積用冰預(yù)冷的乙醇，充分混勻置于-20℃中30分鐘。12000g離心10分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴。于室溫下將開(kāi)蓋的EP管的置于實(shí)驗(yàn)桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干，得到目的L-DNA片段。

目的L-DNA片段DNAzyme活性的檢測(cè)：將目的L-DNA片段用緩沖液1(50mM HEPES(pH 7.0)，100mM NaCl)溶解，并在90℃加熱2min，再冰上降溫5min。然后加入等體積的緩沖液2(50mM HEPES(pH 7.0)，100mM NaCl，4mM ZnCl₂)，在37℃反應(yīng)36小時(shí)。最后用EDTA終止反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物在12％PAGE膠上分離并顯影(圖6)。

結(jié)果顯示，利用實(shí)施例1的D-ASFV pol X可以合成在特定條件下具有DNAzyme活性的L-DNA。