本發(fā)明屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域，涉及一種通過核苷酸定點(diǎn)替換獲得抗草甘膦水稻的方法，還涉及一種可以產(chǎn)生核苷酸定點(diǎn)替換以及片段替換的方法。

背景技術(shù)：

水稻是我國乃至世界上的主要糧食作物，在我國，其總面積、總產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量均居首位，種植面積約5億畝左右。我國稻田雜草發(fā)生面積約占水稻種植面積的45％左右，未進(jìn)行雜草防治的稻田一般減產(chǎn)5-15％，每年損失稻谷約1000萬噸，嚴(yán)重的減產(chǎn)15-30％。為了防除稻田雜草，不僅投入大量的人力物力和財(cái)力，還噴灑了大量除草劑。因此，培育抗除草劑的水稻十分必要。傳統(tǒng)的育種方式周期長，可利用的種質(zhì)資源匱乏。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，為水稻抗草甘膦育種提供了一條有效的途徑。

基因組編輯技術(shù)是近年來興起的新技術(shù)，主要包括三大類型序列特異性核酸酶：鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas9)。這些人工核酸酶都可以在DNA靶位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks，DSBs)，DNA損傷后產(chǎn)生的DSBs激活細(xì)胞內(nèi)固有的非同源末端連接(Non-homologous ending-joining，NHEJ)或同源重組(Homologous recombination，HR)兩種不同的修復(fù)機(jī)制對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)：通過HR方式修復(fù)的概率很低；機(jī)體主要是通過NHEJ方式進(jìn)行修復(fù)，斷裂的染色體會重新連接，但往往是不精確的，斷裂位置會產(chǎn)生少量堿基的插入或刪除，造成移碼突變或者使蛋白翻譯提前終止，從而實(shí)現(xiàn)對目的基因的定點(diǎn)敲除。

草甘膦是一種非選擇性除草劑，具有廣譜、高效、低毒、低殘留以及對大多數(shù)植物具有滅生性的優(yōu)點(diǎn)，是目前世界上使用量最大的除草劑，其作用機(jī)理主要是競爭性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3磷酸合成酶(簡稱為EPSPS)的活性，導(dǎo)致芳香族氨基酸合成受阻，最終造成植物死亡。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種獲得抗草甘膦植物的方法。

本發(fā)明所提供的獲得抗草甘膦植物的方法，包括如下步驟：僅將目的植物內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)的氨基酸序列的第8位的蘇氨酸(T)替換為異亮氨酸(I)，第12位的脯氨酸(P)替換為絲氨酸(S)，所得植物即為抗草甘膦植物；所述目的植物內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO:2。

發(fā)生所述替換以后的所述保守區(qū)的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO:7。

在所述方法中，所述“僅將目的植物內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)的氨基酸序列的第8位的蘇氨酸(T)替換為異亮氨酸(I)，第12位的脯氨酸(P)替換為絲氨酸(S)”是通過如下方法實(shí)現(xiàn)的：向所述目的植物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入如下a)或b)或c)或d)或e)或f)，再將導(dǎo)入后的細(xì)胞或組織培養(yǎng)成完整植株；

a)遺傳物質(zhì)1、遺傳物質(zhì)2和donor載體；所述遺傳物質(zhì)1為能夠表達(dá)序列特異性核酸酶1的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；所述遺傳物質(zhì)2為能夠表達(dá)序列特異性核酸酶2的DNA環(huán)狀質(zhì)粒或DNA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；

b)遺傳物質(zhì)12和donor載體；所述遺傳物質(zhì)12為既能夠表達(dá)所述序列特異性核酸酶1也能夠表達(dá)所述序列特異性核酸酶2的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；

c)非遺傳物質(zhì)1、非遺傳物質(zhì)2和donor載體；所述非遺傳物質(zhì)1為表達(dá)所述序列特異性核酸酶1的mRNA；所述非遺傳物質(zhì)2為表達(dá)所述序列特異性核酸酶2的mRNA；

d)非遺傳物質(zhì)1、非遺傳物質(zhì)2和donor載體；所述非遺傳物質(zhì)1為體外表達(dá)的序列特異性核酸酶1的蛋白質(zhì)；所述非遺傳物質(zhì)2為體外表達(dá)的序列特異性核酸酶2的蛋白質(zhì)；

e)所述donor載體；

f)既能夠表達(dá)所述序列特異性核酸酶1也能夠表達(dá)所述序列特異性核酸酶2的donor載體；

所述donor載體為攜帶有突變目的靶序列的載體；所述突變目的靶序列含有將所述目的植物的基因組中包含待突變核苷酸的自靶標(biāo)片段1的5’末端起到靶標(biāo)片段2的3’末端止的這段DNA片段進(jìn)行核苷酸突變后得到的DNA片段序列；所述靶標(biāo)片段1位于所述目的植物的基因組中編碼所述內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸的核苷酸序列上游的內(nèi)含子區(qū)(記為內(nèi)含子區(qū)1)或啟動子區(qū)；所述靶標(biāo)片段2位于所述目的植物的基因組中編碼所述內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列下游的內(nèi)含子區(qū)(記為內(nèi)含子區(qū)2)或3’-UTR區(qū)；所述核苷酸突變?yōu)槟軌驅(qū)崿F(xiàn)僅將所述目的植物的內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的第8位的蘇氨酸替換為異亮氨酸，第12位的脯氨酸替換為絲氨酸的突變。

其中，所述突變目的靶序列既可以為將所述目的植物的基因組中包含待突變核苷酸的自所述靶標(biāo)片段1的5’末端起到所述靶標(biāo)片段2的3’末端止的這段DNA片段進(jìn)行所述核苷酸突變后得到的DNA片段序列；也可以在此基礎(chǔ)上在上游和/或下游增加同源序列后得到的DNA片段，其中上游同源序列為位于所述目的植物基因組中所述靶標(biāo)片段1上游的一段序列；下游同源序列為位于所述目的植物基因組中所述靶標(biāo)片段2下游的一段序列。

所述序列特異性核酸酶1能夠特異性切割所述目的植物基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段1；所述序列特異性核酸酶2能夠特異性切割所述目的植物基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段2；當(dāng)所述序列特異性核酸酶1和所述序列特異性核酸酶2同時(shí)切割所述目的植物基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段1和所述靶標(biāo)片段2時(shí)，所述donor載體的兩個靶標(biāo)位點(diǎn)之間的含有待替換核苷酸的片段則有機(jī)會連接到所述目的生物基因組的兩個靶標(biāo)位點(diǎn)之間，從而獲得核苷酸定點(diǎn)替換的基因組序列。

所述序列特異性核酸酶(如所述序列特異性核酸酶1或所述序列特異性核酸酶2)同時(shí)對所述目的生物基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段進(jìn)行特異性切割，雖然可能會造成少量堿基的插入突變、和/或缺失突變，但該突變位于啟動子區(qū)，和/或內(nèi)含子區(qū)，和/或UTR區(qū)(非編碼區(qū))，一般不會影響蛋白的功能；所述的兩個序列特異性核酸酶(即所述序列特異性核酸酶1或所述序列特異性核酸酶2)同時(shí)切割所述目的植物基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段1和所述靶標(biāo)片段2時(shí)，可以引起兩個靶標(biāo)位點(diǎn)之間序列的核苷酸替換突變。

其中，所述序列特異性核酸酶1和所述序列特異性核酸酶2均可為CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN核酸酶、鋅指核酸酶或所有能實(shí)現(xiàn)基因組編輯的序列特異性核酸酶。所述序列特異性核酸酶1和所述序列特異性核酸酶2既可以為同一種核酸酶也可以為不同種核酸酶。

在所述方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物可為禾本科植物；所述禾本科植物具體可為水稻。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述植物具體為水稻品種日本晴。

相應(yīng)的，所述目的植物內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的突變位點(diǎn)(第8位和第12位)在基因組DNA水平上位于所述目的植物內(nèi)源EPSPS基因的第二外顯子；所述內(nèi)含子區(qū)1為第一內(nèi)含子，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:3的第1-704位；所述內(nèi)含子區(qū)2為第二內(nèi)含子，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:3的第950-1030位。所述序列特異性核酸酶1和所述序列特異性核酸酶2均為CRISPR/Cas9核酸酶，所述靶標(biāo)片段1為序列表中SEQ ID NO:3的第1-704所示核苷酸序列中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列規(guī)則的片段；N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30，且X為整數(shù)(如X為20)，N_X表示X個連續(xù)的核苷酸。所述靶標(biāo)片段2為序列表中SEQ ID NO:3的第950-1030位所示核苷酸序列中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列規(guī)則的片段；N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30，且X為整數(shù)(如X為20)，N_X表示X個連續(xù)的核苷酸。

進(jìn)一步，所述靶標(biāo)片段1的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:4；所述靶標(biāo)片段2的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:5。

相應(yīng)的，在本發(fā)明中，所述遺傳物質(zhì)1具體為將pHUN411載體的兩個限制性內(nèi)切酶BsaI之間的小片段替換為序列表中SEQ ID NO:4的第1-20位所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒(pHUN411-C3)；所述遺傳物質(zhì)2具體為將pHUN411載體的兩個限制性內(nèi)切酶BsaI之間的小片段替換為序列表中SEQ ID NO:5的第1-20位所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒(pHUN411-C4)。

所述donor載體上攜帶的突變目的靶序列的核苷酸序列具體為序列表中SEQ ID NO:6。所述donor載體具體為將序列表中SEQ ID NO:6所示DNA片段與pEASY-Blunt載體(如全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，目錄號CB101)相連后得到的重組質(zhì)粒(pEPSPS-donor)。

在本發(fā)明中，將所述pHUN411-C3、所述pHUN411-C4和所述pEPSPS-donor導(dǎo)入水稻品種日本晴的愈傷組織時(shí)，三者的摩爾比為1:1:2。

在所述方法中，所述細(xì)胞可為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細(xì)胞；所述組織可為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織。具體的，所述細(xì)胞如可為原生質(zhì)體細(xì)胞或懸浮細(xì)胞；所述組織如可為愈傷組織、幼胚或成熟胚。

在所述方法中，向所述目的植物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入所述a)或所述b)或所述c)或所述d)或所述e)的方法可為基因槍法、農(nóng)桿菌侵染法、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法或其他任何導(dǎo)入方法。

如下生物材料中的任一種也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

(1)蛋白質(zhì)，為僅將水稻內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的第8位的蘇氨酸替換為異亮氨酸，第12位的脯氨酸替換為絲氨酸后形成的蛋白；所述水稻內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO:2；

(2)所述蛋白質(zhì)的編碼基因；

(3)含有所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為非繁殖材料。

本發(fā)明還提供了一種對目的基因中的目的核苷酸進(jìn)行替換的方法。其中，所述目的核苷酸既可為1個核苷酸或者多個不連續(xù)的核苷酸，也可以為由多個連續(xù)的核苷酸組成的片段。

本發(fā)明所提供的對目的基因中的目的核苷酸進(jìn)行替換的方法，是通過向目的生物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入如下a)或b)或c)或d)或e)，實(shí)現(xiàn)對所述目的生物中所述目的基因的目的核苷酸的替換：

a)遺傳物質(zhì)1、遺傳物質(zhì)2和donor載體；所述遺傳物質(zhì)1為能夠表達(dá)序列特異性核酸酶1的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；所述遺傳物質(zhì)2為能夠表達(dá)序列特異性核酸酶2的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；

b)遺傳物質(zhì)12和所述donor載體；所述遺傳物質(zhì)12為既能夠表達(dá)所述序列特異性核酸酶1也能表達(dá)所述序列特異性核酸酶2的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；

c)非遺傳物質(zhì)1、非遺傳物質(zhì)2和所述donor載體；所述非遺傳物質(zhì)1為表達(dá)所述序列特異性核酸酶1的mRNA；所述非遺傳物質(zhì)2為表達(dá)所述序列特異性核酸酶2的mRNA；

d)非遺傳物質(zhì)1、非遺傳物質(zhì)2和所述donor載體；所述非遺傳物質(zhì)1為體外表達(dá)序列特異性核酸酶1的蛋白質(zhì)；所述非遺傳物質(zhì)2為體外表達(dá)序列特異性核酸酶2的蛋白質(zhì)；

e)既能夠表達(dá)序列特異性核酸酶1也能表達(dá)序列特異性核酸酶2的donor載體；

所述donor載體為攜帶有突變目的靶序列的載體；所述突變目的靶序列含有將所述目的生物的基因組中包含待替換核苷酸的自靶標(biāo)片段1的5’末端起到靶標(biāo)片段2的3’末端止的這段DNA片段進(jìn)行所述目的核苷酸替換后得到的DNA片段序列；所述靶標(biāo)片段1位于所述目的生物的基因組中所述目的基因的目的核苷酸上游的內(nèi)含子區(qū)或啟動子區(qū)；所述靶標(biāo)片段2位于所述目的生物的基因組中所述目的基因的目的核苷酸下游的內(nèi)含子區(qū)或3’-UTR區(qū)。兩個序列特異性核酸酶的靶標(biāo)位置位于啟動子區(qū)，和/或內(nèi)含子區(qū)，和/或UTR區(qū)(非編碼區(qū))，在該區(qū)產(chǎn)生少量堿基的插入缺失一般不會影響目的基因的表達(dá)。

其中，所述突變目的靶序列既可以為將所述目的生物的基因組中包含待替換核苷酸的自所述靶標(biāo)片段1的5’末端起到所述靶標(biāo)片段2的3’末端止的這段DNA片段進(jìn)行所述核苷酸突變后得到的DNA片段序列；也可以在此基礎(chǔ)上在上游和/或下游增加同源序列后得到的DNA片段，其中上游同源序列為位于所述目的生物的基因組中所述靶標(biāo)片段1上游的一段序列；下游同源序列為位于所述目的生物的基因組中所述靶標(biāo)片段2下游的一段序列。

所述序列特異性核酸酶1能夠特異性切割所述目的生物基因組中和所述donor載體中的靶標(biāo)片段1；所述序列特異性核酸酶2能夠特異性切割所述目的生物基因組中和所述donor載體中的靶標(biāo)片段2。所述donor載體中的上下游同源序列引導(dǎo)所述donor載體到達(dá)所述目的生物的基因組中所述目的基因處，當(dāng)所述序列特異性核酸酶1和所述序列特異性核酸酶2同時(shí)切割所述目的生物基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段1和所述靶標(biāo)片段2時(shí)，所述donor載體的兩個靶標(biāo)位點(diǎn)之間的含有待替換核苷酸的片段則有機(jī)會連接到所述目的生物基因組的兩個靶標(biāo)位點(diǎn)之間，從而獲得核苷酸定點(diǎn)替換的基因組序列。

其中，所述目的生物可為目的植物、目的動物或目的微生物。

所述序列特異性核酸酶1和所述序列特異性核酸酶2均可為CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN核酸酶、鋅指核酸酶或所有能實(shí)現(xiàn)基因組編輯的序列特異性核酸酶。所述序列特異性核酸酶1和所述序列特異性核酸酶2既可以為同一種核酸酶也可以為不同種核酸酶。

在一些實(shí)施方案中，所述目的生物是植物，包括單子葉植物或雙子葉植物，例如水稻或擬南芥。所述細(xì)胞為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細(xì)胞；所述組織為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織。具體的，所述細(xì)胞為原生質(zhì)體細(xì)胞或懸浮細(xì)胞；所述組織為愈傷組織、幼胚或成熟胚。向所述目的植物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入所述a)或所述b)或所述c)或所述d)或所述e)的方法包括基因槍法、農(nóng)桿菌侵染法、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法或其他任何導(dǎo)入方法。

在一具體實(shí)施方案中，所述植物是擬南芥，所述目的基因是SEQ ID NO:9所示的Atsnc1(At4g16890)，其中所述序列特異性核酸酶1包含對應(yīng)SEQ ID NO:12的sgRNA，所述序列特異性核酸酶2包含對應(yīng)SEQ ID NO:13的sgRNA，所述突變目的靶序列示于SEQ ID NO：14，所述目的核苷酸的替換使得SEQ ID NO：10的Atsnc1外顯子3被替換為SEQ ID NO：11，由此賦予植物對Pseudomonas syringae pv maculicola ES4326和Peronospora parasitica Noco2的抗性。

本發(fā)明利用CRISPR介導(dǎo)的NHEJ途徑通過設(shè)計(jì)兩個gRNA的位點(diǎn)，兩個gRNA的位點(diǎn)分別位于EPSPS基因的第一內(nèi)含子和第二內(nèi)含子中，通過CRISPR/Cas9技術(shù)兩個gRNA同時(shí)切割基因組中和donor載體中的靶標(biāo)片段1和2，靶標(biāo)位點(diǎn)之間的堿基替換的片段有機(jī)會連接到基因組的靶標(biāo)位點(diǎn)之間，對水稻的第二外顯子進(jìn)行替換，從而實(shí)現(xiàn)保守區(qū)兩個氨基酸的定點(diǎn)突變，從而產(chǎn)生具有草甘膦抗性的水稻，對于培育抗除草劑植物新品種具有重要意義。

本發(fā)明還提供了一種對目的基因中的目的核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)替換的方法。

附圖說明

圖1為OsEPSPS基因結(jié)構(gòu)示意圖及利用CRISPR/Cas9技術(shù)的兩個靶位點(diǎn)(C3和C4)的序列。

圖2為OsEPSPS基因靶位點(diǎn)C3和C4在水稻原生質(zhì)體中的活性檢測及對應(yīng)的測序結(jié)果。a為C3靶位點(diǎn)在原生質(zhì)體中PCR/RE檢測結(jié)果，b為C3靶位點(diǎn)對應(yīng)的測序結(jié)果；c為C4靶位點(diǎn)在原生質(zhì)體中PCR/RE檢測結(jié)果；d為C4靶位點(diǎn)對應(yīng)的測序結(jié)果。其中，WT表示野生型水稻日本晴的基因組序列，“-”表示發(fā)生了刪除突變的序列，“+”表示發(fā)生了插入突變的序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量(小寫字母為插入的核苷酸)，M1-M4表示4種突變類型。

圖3為含有替換堿基的donor載體(pEPSPS-donor)的結(jié)構(gòu)示意圖。a為水稻基因組中EPSPS保守區(qū)的DNA序列以及保守區(qū)編碼的氨基酸序列，b為donor載體中EPSPS保守區(qū)的DNA序列及編碼的氨基酸序列，加粗標(biāo)記的氨基酸是替換氨基酸。為了便于后期的檢測，同義突變出一個酶切位點(diǎn)PvuI。

圖4為用PCR/RE檢測CRISPR介導(dǎo)的水稻OsEPSPS基因定點(diǎn)突變的T0代突變體以及測序結(jié)果。a為T0代突變體的PCR/RE檢測結(jié)果，其中1-16為不同的再生line，PCR產(chǎn)物利用PvuI限制性內(nèi)切酶酶切，ck為野生型水稻日本晴對照；b為突變體1，5，7的測序結(jié)果，其中，G表示野生型水稻日本晴EPSPS基因的部分序列：左邊序列為C3位點(diǎn)序列，中間為EPSPS保守區(qū)DNA序列，右邊為C4位點(diǎn)序列；D表示donor載體上的EPSPS基因的部分序列：左邊序列為C3位點(diǎn)序列，中間為點(diǎn)突變的EPSPS保守區(qū)DNA序列，右邊為C4位點(diǎn)序列?！?”表示發(fā)生了刪除突變的序列，“+”表示發(fā)生了插入突變的序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量(小寫字母為插入的核苷酸)。

圖5為水稻植株在含1mg/L草甘膦的N6培養(yǎng)基中的生長情況。培養(yǎng)10天后，a為OsEPSPS基因TIPS定點(diǎn)突變的突變體T0-1；b為野生型水稻日本晴對照。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

pHUN411載體：在文獻(xiàn)“Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.A CRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants.BMC plant biology.14:327-338(2014)”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。該質(zhì)?？赏瑫r(shí)用于轉(zhuǎn)錄向?qū)NA和表達(dá)Cas9蛋白。

實(shí)施例1、水稻OsEPSPS靶位點(diǎn)的選擇并構(gòu)建CRISPR載體

一、OsEPSPS靶位點(diǎn)的選擇

OsEPSPS基因座位號是06g04280，位于水稻第6號染色體，包含8個外顯子，7個內(nèi)含子，共編碼515個氨基酸。OsEPSPS基因的保守區(qū)位于第2外顯子中，構(gòu)建敲除載體選擇的靶位點(diǎn)分別位于第1內(nèi)含子和第2內(nèi)含子中(圖1)。OsEPSPS基因在水稻基因組中第1內(nèi)含子、包含保守區(qū)的第2外顯子及第2內(nèi)含子的序列如序列表中序列3所示。其中，序列3的第1-704位為第1內(nèi)含子，第705-949位為第2外顯子，第950-1030位為第2內(nèi)含子。

利用CRISPR技術(shù)敲除的靶標(biāo)雙鏈中的一條鏈具有如下結(jié)構(gòu)：5-Nx-NGG-3，PAM(NGG)中的N表示A、T、C和G中的任一種，Nx中的N表示A、T、C和G中的任一種，x＝20。OsEPSPS基因的靶序列如下，帶下劃線的堿基為PAM(原型間隔序列毗鄰基序)。其中，靶標(biāo)C3位于第1內(nèi)含子，靶標(biāo)C4位于第2內(nèi)含子。

C3：5’-TACTAAATATACAATCCCTTGGG-3’(SEQ ID NO:4)；

C4：5’-AAAATATGTATGGAATTCATGGG-3’(SEQ ID NO:5)。

該敲除載體轉(zhuǎn)化水稻后，在gRNA的介導(dǎo)下，Cas9蛋白在靶序列區(qū)域切割，形成DNA雙鏈斷裂，觸發(fā)機(jī)體內(nèi)的自我損傷修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞自發(fā)修復(fù)該缺口的過程中會引入突變(本處“突變”指的是廣義突變，包括插入、缺失、狹義突變等形式，這些突變中絕大多數(shù)為基因功能失活突變)。

上述靶序列C3含有BsaJI酶切識別序列(斜體加粗部分的序列)，可以被BsaJI限制性內(nèi)切酶切割；上述靶序列C4含有EcoRI酶切識別序列(斜體加粗部分的序列)，可以被EcoRI限制性內(nèi)切酶切割。C3靶序列區(qū)域被切割后，如果發(fā)生了突變，則BsaJI酶切識別序列被破壞，將不能被限制性內(nèi)切酶BsaJI切割；如果沒有發(fā)生突變，將可以被限制性內(nèi)切酶BsaJI切割。同理，C4靶序列區(qū)域被切割后，如果發(fā)生了突變，則EcoRI酶切識別序列被破壞，將不能被限制性內(nèi)切酶EcoRI切割；如果沒有發(fā)生突變，將可以被限制性內(nèi)切酶EcoRI切割。

二、重組載體的構(gòu)建

1、用限制性內(nèi)切酶BsaI酶切pHUN411質(zhì)粒(該質(zhì)粒上含有兩個BsaI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn))，回收約12.5kb的載體骨架，命名為HUN411。

2、根據(jù)步驟一設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)C3和C4序列，合成如下帶有粘性末端(下劃線部分)的引物：

C3-F：5’-GGCGTACTAAATATACAATCCCTT-3’；

C3-R：5’-AAACAAGGGATTGTATATTTAGTA-3’。

C4-F：5’-GGCGAAAATATGTATGGAATTCAT-3’；

C4-R：5’-AAACATGAATTCCATACATATTTT-3’。

3、將C3-F和C3-R，C4-F和C4-R分別進(jìn)行退火，形成有粘性末端的雙鏈DNA命名為C3和C4，將其和步驟1中的膠回收產(chǎn)物HUN411連接，得到重組質(zhì)粒pHUN411-C3、pHUN411-C4。

重組質(zhì)粒pHUN411-C3的結(jié)構(gòu)描述為：將pHUN411質(zhì)粒的兩個限制性內(nèi)切酶BsaI的識別序列之間的小片段(約1.2kb)替換為序列表中SEQ ID NO:4的第1-20位所示DNA片段后所得的重組質(zhì)粒，該質(zhì)?？赏瑫r(shí)用于轉(zhuǎn)錄包含SEQ ID NO:4的向?qū)NA和表達(dá)Cas9蛋白。

重組質(zhì)粒pHUN411-C4的結(jié)構(gòu)描述為：將pHUN411質(zhì)粒的兩個限制性內(nèi)切酶BsaI的識別序列之間的小片段(約1.2kb)替換為序列表中SEQ ID NO:5的第1-20位所示DNA片段后所得的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒可同時(shí)用于轉(zhuǎn)錄包含SEQ ID NO:5的向?qū)NA和表達(dá)Cas9蛋白。

實(shí)施例2、轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體及檢測重組載體在原生質(zhì)體中的活性

將實(shí)施例1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pHUN411-C3、pHUN411-C4分別通過PEG介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)入水稻品種日本晴的原生質(zhì)體，然后提取原生質(zhì)體的基因組DNA，用特異引物通過PCR擴(kuò)增包含靶位點(diǎn)C3、C4的OsEPSPS基因，然后分別將含有靶位點(diǎn)C3、C4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BsaJI、EcoRI酶切(如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有部分條帶不能被切開，說明實(shí)施例1中設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)有活性)，將不能被限制性內(nèi)切酶切開的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，連pEASY-Blunt載體(如全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，目錄號CB101)，挑單克隆進(jìn)行測序。

分別用于擴(kuò)增含有靶位點(diǎn)C3、C4的引物序列如下：

上游引物OsEC3-F：5’-CTAGGAATTATCTCTCAAGTCAATC-3’；

下游引物OsEC3-R：5’-CTCACTGTTCAGCAAGTTGTCC-3’。

上游引物OsEC4-F：5’-TTCTTAATAGCTTTGATCGCG-3’；

下游引物OsEC4-R：5’-TAACCTTGCCACCAGGAAGTC-3’。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未經(jīng)酶切的野生型水稻日本晴的PCR產(chǎn)物對照，以及經(jīng)過BsaJI或EcoRI酶切的野生型對照PCR產(chǎn)物對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

原生質(zhì)體中C3檢測重組載體活性的酶切結(jié)果見圖2中a，泳道1、2為轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體，其中含有不能被BsaJI切開的PCR條帶(大小約為640bp，與預(yù)期一致)，說明靶位點(diǎn)C3有活性；泳道3為未經(jīng)酶切的野生型PCR產(chǎn)物對照；泳道4為經(jīng)過酶切的野生型對照PCR產(chǎn)物，可以被BsaJI完全切開。測序(圖2中b)結(jié)果表明靶位點(diǎn)處產(chǎn)生了少量堿基的插入與缺失，證實(shí)重組載體pHUN411-C3在靶位點(diǎn)C3處進(jìn)行了基因定點(diǎn)編輯。

原生質(zhì)體中C4檢測重組載體活性的酶切結(jié)果見圖2中c，泳道1、2為轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體，其中含有不能被EcoRI切開的PCR條帶(大小約為730bp，與預(yù)期一致)，說明靶位點(diǎn)C4有活性；泳道3為未經(jīng)酶切的野生型PCR產(chǎn)物對照；泳道4為經(jīng)過酶切的野生型對照PCR產(chǎn)物，可以被EcoRI完全切開。測序(圖2中d)結(jié)果表明靶位點(diǎn)處產(chǎn)生了少量堿基的插入與缺失，證實(shí)重組載體pHUN411-C4在靶位點(diǎn)處進(jìn)行了基因定點(diǎn)編輯。

實(shí)施例3、Donor載體的構(gòu)建

本實(shí)施例旨在構(gòu)建含有突變目的靶序列的donor載體，以期能夠與CRISPR/Cas9核酸酶一同實(shí)現(xiàn)將水稻內(nèi)源EPSPS蛋白中SEQ ID NO:2所示的保守區(qū)多肽(保守區(qū)多肽的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇蠸EQ ID NO:1)的第8位的蘇氨酸(T)替換為異亮氨酸(I)，第12位的脯氨酸(P)替換為絲氨酸(S)，即使得突變后的所述保守區(qū)多肽的序列為序列表中SEQ ID NO:7，下文將該突變簡稱為TIPS突變。Donor載體的具體構(gòu)建方法如下：

以野生型水稻日本晴的基因組DNA為模板，用引物OsEPSPS-DF/OsEPSPS-DR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測，出現(xiàn)1.2Kb的目的條帶，PCR產(chǎn)物純化后連接pEASY-Blunt載體(如全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，目錄號CB101)。經(jīng)PCR驗(yàn)證獲得連接EPSPS片段的克隆，搖菌提取質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明在結(jié)構(gòu)組成上為將序列表中SEQ ID NO:8所示DNA片段與T-Blunt載體相連后所得質(zhì)粒命名為TB-EPSPS-D。其中，SEQ ID NO:8的第12-1041位與SEQ ID NO:3完全一致。

OsEPSPS-DF：5’-CCCTCTCCGAGGTGAGACG-3’(SEQ ID NO:8的第1-19位)；

OsEPSPS-DR：5’-TAACCTTGCCACCAGGAAGTC-3’(SEQ ID NO:8的第1179-1199位的反向互補(bǔ)序列)。

以質(zhì)粒TB-EPSPS-D為模板，用引物OsEPSPS-TIPSF/OsEPSPS-TIPSR擴(kuò)增(為了方便后期檢測，該對引物中也同義突變出P_vuI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn))，PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI處理后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑克隆送測序，將經(jīng)測序表明在結(jié)構(gòu)組成上為將序列表中SEQ ID NO:6所示DNA片段與T-Blunt載體相連后得到的重組質(zhì)粒命名為pEPSPS-donor。其中，SEQ ID NO:6與SEQ ID NO:8相比，差別僅在于OsEPSPS-TIPSF/OsEPSPS-TIPSR引物中引入的突變位點(diǎn)，突變后的保守區(qū)氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。

pEPSPS-donor的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示。

OsEPSPS-TIPSF：5’-GAACGCTGGAATGCAATGCGACTTGACAGCAGCCGTGAC-3’；

OsEPSPS-TIPSR：5’-TGCTGTCAAcGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCCCCAAG-3’。

其中，加方框的為突變堿基，加粗字體為突變出的酶切位點(diǎn)PvuI。

實(shí)施例4、轉(zhuǎn)化水稻及TIPS EPSPS位點(diǎn)突變體檢測

將實(shí)施例1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pHUN411-C3、pHUN411-C4和實(shí)施例3中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEPSPS-donor通過基因槍轉(zhuǎn)化的方法同時(shí)導(dǎo)入水稻品種日本晴。以日本晴的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，轉(zhuǎn)化時(shí)重組質(zhì)粒pHUN411-C3、pHUN411-C4和pEPSPS-donor的摩爾配比為1:1:2，轉(zhuǎn)化后經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得完整再生植株(即T0代)。

提取T0代轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，用含有靶位點(diǎn)C3、C4和TIPS突變位點(diǎn)的特異引物OsEF1和OsER對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

OsEF1：5’-CAACAGGATCCTCCTCCTCTC-3’(位于水稻基因組中序列8/6的上游30bp處)；

OsER：5’-TAACCTTGCCACCAGGAAGTC-3’(SEQ ID NO:6的第1179-1199位的反向互補(bǔ)序列)。

PCR產(chǎn)物用PvuI單酶切，酶切結(jié)果見圖4a。經(jīng)PCR、酶切檢測后，共獲得3個line在TIPS處突變的植株，如T0-1，T0-5，T0-7(分別對應(yīng)圖4a的泳道1、5和7，除了大小約為1.2kb的PCR產(chǎn)物條帶外，還含有經(jīng)由PvuI酶切開的大小約為950bp和270bp的目的條帶)，其余編號植株(分別對應(yīng)圖4中的泳道2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16)為野生型。

進(jìn)一步，對突變體的測序結(jié)果見圖4b，3個line(T0-1，T0-5，T0-7)在設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)處產(chǎn)生了目的堿基的突變，同時(shí)在C3和C4靶位點(diǎn)處產(chǎn)生少量堿基的插入和缺失，由于C3和C4位于內(nèi)含子中，少量堿基的缺失插入并不影響OsEPSPS基因的閱讀框，僅發(fā)生目的堿基突變的堿基影響了翻譯產(chǎn)生的蛋白，證明成功獲得了TIPS EPSPS位點(diǎn)突變的突變體。

實(shí)施例5、TIPS EPSPS位點(diǎn)突變體的草甘膦抗性鑒定

將實(shí)施例4獲得的3個TIPS EPSPS位點(diǎn)突變line(T0-1，T0-5，T0-7)和野生型水稻日本晴植株放置于含有1mg/L草甘膦的N6培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，10天后觀察抗性結(jié)果。每個TIPS EPSPS位點(diǎn)突變line均進(jìn)行3株以上重復(fù)。

結(jié)果顯示，野生型水稻日本晴植株已經(jīng)變黃萎蔫死亡，而所有的TIPS EPSPS位點(diǎn)突變植株均正常存活(葉片為綠色)。其中，圖5a為TIPS EPSPS位點(diǎn)突變的T0-1，圖5b為野生型水稻日本晴對照植株。

實(shí)施例6、擬南芥中內(nèi)含子介導(dǎo)的定點(diǎn)基因替換

對于雙子葉模式植物擬南芥的功能基因組研究，產(chǎn)生精確的基因組修飾(例如點(diǎn)突變和基因替換)具有巨大價(jià)值。本文報(bào)道在擬南芥中使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過非同源末端連接(NHEJ)途徑實(shí)現(xiàn)的內(nèi)含子介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性基因替換方法。

先前已經(jīng)鑒別到Atsnc1(At4g16890)中的點(diǎn)突變(G1654-A)導(dǎo)致Glu552Lys置換，并導(dǎo)致組成型表達(dá)病程相關(guān)(PR)基因，賦予植物對Pseudomonas syringae pv maculicola ES4326和Peronospora parasitica Noco2的抗性。本實(shí)施例目的是獲得內(nèi)源Atsnc1基因的氨基酸替換。Atsnc1的基因組序列示于SEQ ID NO:9。

上述點(diǎn)突變出現(xiàn)于Atsnc1的外顯子3，而外顯子3編碼的序列示于SEQ ID NO：10。為了用含有點(diǎn)所述突變(G1654-A)的新外顯子(SEQ ID NO:11)替換內(nèi)源外顯子3，我們設(shè)計(jì)了分別靶向Atsnc1的內(nèi)含子2和3的sgRNA。靶向Atsnc1的內(nèi)含子2的sgRNA(S1)的序列示于SEQ ID NO：12，而靶向Atsnc1的內(nèi)含子3的sgRNA(S2)的序列示于SEQ ID NO：13。

S1sgRNA(由AtU626啟動子驅(qū)動)、S2sgRNA(由AtU629啟動子驅(qū)動)以及含有單核苷酸置換(G1654-A)的供體序列被整合進(jìn)攜帶潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)和Cas9表達(dá)盒的pHEE401載體，獲得構(gòu)建體pHEE411-S1S2Donor。含有所述核苷酸置換的供體序列示于SEQ ID NO：14。

終載體pHEE411-S1S2Donor通過凍融法轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌菌株GV3101。通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0野生型植物。收集的種子在含有25mg/L潮霉素的MS平板上進(jìn)行篩選。從土壤生長的T1代轉(zhuǎn)基因植物提取基因組DNA。使用基因特異性引物PCR擴(kuò)增包含靶位點(diǎn)的片段并進(jìn)行測序。結(jié)果確認(rèn)獲得了具有所需基因替換的植物。