基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統(tǒng)的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統(tǒng)的應用，所述的分選系統(tǒng)包含以下組分：第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質、限制性內切酶；所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸互補，且互補區(qū)域含有所述限制性內切酶的識別位點；所述的第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質均被修飾，修飾后的第一單鏈核苷酸可與修飾后的抗體相連接，修飾后的第二單鏈核苷酸可與修飾后的細胞分選介質相連接。本發(fā)明還提供了從細胞樣品中分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞的試劑盒的用途。本發(fā)明的細胞分選技術實現(xiàn)了同時分選多種細胞，可進行大量及脆弱細胞的分選，細胞得率和存活率高。
【專利說明】基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統(tǒng)的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術領域】，具體地說，涉及一種基于核酸內切酶特異性識別 的細胞分選系統(tǒng)的應用。

【背景技術】
[0002] 現(xiàn)有的細胞分選技術主要有以下兩種：
[0003] ①流式細胞分離技術
[0004] 通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。將待測細胞與單克隆抗體和熒光染料結合 后制成懸浮標本，在一定氣體壓力下樣品進入流動室，在不含細胞的緩沖液包裹下單行排 列。在流動室的超商頻的壓電晶體的商頻振蕩下，液流斷裂為均勻的液滴，待測細胞就包含 在液滴之中。將這些液滴充上正或負電荷，當帶電液滴通過電場，在電場的作用下發(fā)生偏 轉，然后落入相應的收集器之中，從而實現(xiàn)細胞分選。
[0005] ②免疫磁珠技術
[0006] 磁珠表面包被具免疫反應性的抗體，與細胞表面的抗原進行特異性結合；后者置 于強大的磁場下，就會與未結合的細胞分開；脫離磁場后會立即消失磁性，這樣就可以篩選 或去除所標記的細胞，從而達到篩選出陽性或陰性細胞的目的。其流程圖如圖1所示。
[0007] 以上技術存在以下不足：流式細胞分離技術雖然可以分選得到目的細胞，但是① 細胞必須能被熒光分子標記；②只能檢測懸浮的單細胞；③分選過程不夠溫和，對細胞傷 害大；④可能污染細胞；⑤不利于大體積樣品的分選。免疫磁珠分選技術雖然可以通過正、 負兩種篩選獲得目的細胞，但是①無法完成"一次結合"分離多種細胞；②如果需要從一個 樣品里面篩選多個目的細胞，需要多次結合和洗脫，得到的細胞活性差、得率低；③多次分 選，成本高；④目的細胞與磁珠不能完全分離，不利于后續(xù)研究。
[0008] 目前關于對細胞傷害小、可同時分選多種細胞、獲得的目的細胞能夠與載體徹底 分離，適用于大量及脆弱細胞分選的技術還未見報道。


【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供基于核酸內切酶特異性識別的細胞 分選系統(tǒng)的應用。
[0010] 本發(fā)明的再一的目的是，提供分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞的試劑盒的應用。
[0011] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0012] 基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統(tǒng)在分選細胞中的應用，所述的分選系 統(tǒng)包含以下組分：第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質、限制性內切酶； 所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸互補，且互補區(qū)域含有所述限制性內切酶的識別 位點；所述的第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質均被修飾，修飾后的第 一單鏈核苷酸可與修飾后的抗體相連接，修飾后的第二單鏈核苷酸可與修飾后的細胞分選 介質相連接。
[0013] 優(yōu)選地，所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸為部分序列互補或完全互補。
[0014] 優(yōu)選地，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈核苷酸的長度為6bp_lkb。
[0015] 更優(yōu)選地，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈核苷酸的長度為18bp_50bp。
[0016] 優(yōu)選地，所述的細胞分選介質是磁珠、分離柱或聚陽離子納米顆粒。
[0017] 更優(yōu)選地，所述的第一單鏈核苷酸被巰基修飾，所述的第二單鏈核苷酸被生物素 修飾，所述的抗體被順丁烯二酰亞胺修飾，所述的磁珠被鏈霉親和素修飾。
[0018] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0019] 分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞的試劑盒在分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞中 的應用，所述的試劑盒包含以下組分：巰基與生物素修飾的三對單鏈核苷酸，⑶3、⑶56和 HLA-DR抗體，鏈霉親和素磁珠，限制性內切酶BamH I、EcoR I、Hind III。
[0020] 所述的三對單鏈核苷酸的互補區(qū)域分別包含限制性內切酶BamH I、EcoR I、Hind III的識別位點。
[0021] 優(yōu)選地，所述的三對單鏈核苷酸的序列分別如SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6所示。
[0022] 本發(fā)明還涉及一種從細胞樣品中分選目的細胞的方法，所述的方法包括以下步 驟：
[0023] a)合成互補的單鏈核苷酸，制備"磁珠/單鏈核苷酸"和"抗體/單鏈核苷酸"復 合物；
[0024] b)在細胞樣品中加入"抗體/單鏈核苷酸"復合物，形成"單鏈核苷酸/抗體/細 胞"復合物；
[0025] c)將"磁珠/單鏈核苷酸"復合物加入到"單鏈核苷酸/抗體/細胞"復合物中， 形成"磁珠/雙鏈核苷酸/抗體/細胞"復合物；
[0026] d)通過外加磁場的作用，磁性吸附目的細胞，去除非目的細胞；
[0027] e)針對不同的目的細胞，每次使用不同的限制性內切酶剪切含有特定識別序列的 雙鏈核苷酸，逐次洗脫不同的目的細胞。
[0028] 優(yōu)選地，步驟b)中細胞樣品的體積、細胞樣品中目的細胞個數(shù)、目的細胞對應的 抗體質量的比例為：lmL細胞樣品：10 6_109個目的細胞：5-100iig目的細胞對應的抗體。
[0029] 優(yōu)選地，步驟c)中所述的"單鏈核苷酸/抗體/細胞"復合物與"磁珠/單鏈核苷 酸"復合物的個數(shù)比為1:5-1:100。
[0030] 優(yōu)選地，步驟b)反應條件為2-8°C，5-30min。
[0031] 優(yōu)選地，步驟c)反應條件為15-25°C，5-30min。
[0032] 本發(fā)明另涉及一種從細胞樣品中分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞的方法，它包括 以下步驟：
[0033] a)合成三對互補的單鏈核苷酸，制備三種"磁珠/單鏈核苷酸"和三種"抗體/單 鏈核苷酸"復合物，所述的抗體分別為CD3、CD56和HLA-DR抗體，所述的三對單鏈核苷酸片 段的序列分別如SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0. 6所示；
[0034] b)在細胞樣品中加入三種"抗體/單鏈核苷酸"復合物，形成"單鏈核苷酸/抗體 /細胞"復合物；
[0035] c)將三種"磁珠/單鏈核苷酸"復合物加入到"單鏈核苷酸/抗體/細胞"復合物 中，形成"磁珠/雙鏈核苷酸/抗體/細胞"復合物；
[0036] d)通過外加磁場的作用，分離獲得與磁珠結合的細胞；
[0037] e)針對不同的目的細胞，分別使用限制性內切酶BamH I、EcoR I、Hind III逐次 洗脫。
[0038] 優(yōu)選地，步驟b)中細胞樣品的體積、細胞樣品中目的細胞個數(shù)、目的細胞對應的 抗體質量的比例為：lmL細胞樣品：10 6_109個目的細胞：5-100iig目的細胞對應的抗體。
[0039] 優(yōu)選地，步驟c)中所述的"單鏈核苷酸/抗體/細胞"復合物與"磁珠/單鏈核苷 酸"復合物的個數(shù)比為1:5-1:100。
[0040] 優(yōu)選地，步驟b)反應條件為2-8°C，5-30min。
[0041] 優(yōu)選地，步驟c)反應條件為15-25°C，5-30min。
[0042] 本文中，所述的"細胞分選介質"包含所有用于分選細胞的介質，只要能達到分選 的目的的介質都是可以的，例如磁珠、分離柱、聚陽離子納米顆粒等其他可以達到分選目的 的介質。所述的第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質的修飾方式并不限 于以上內容記載的方式，任何可以使這些分子結合的方式都是可以接受的。本發(fā)明優(yōu)點在 于：
[0043] 本發(fā)明在常規(guī)細胞分選技術的基礎上引入了兩種特異性識別機制（限制性內切 酶對雙鏈核苷酸序列的特異性識別、抗體與抗原的特異性識別），實現(xiàn)一次吸附再多次分離 得到多種目的產(chǎn)物。
[0044] 本發(fā)明的細胞分選技術可以彌補現(xiàn)有技術的不足，與流式細胞技術相比對細胞傷 害小；與免疫磁珠技術相比，可同時分選多種細胞，且獲得的目的細胞能夠與細胞分選介質 分離，因而細胞可用于再次分選。本發(fā)明的技術可進行大量及脆弱細胞的分選，細胞得率和 存活率高。
[0045] 本發(fā)明的技術在細胞分選基礎上，可作為細胞治療中的配套技術，為細胞治療提 供高純度、有活力的細胞，也可用于檢測分析領域，與微量的核酸檢測設備聯(lián)合使用，對不 同的目標物進行定量檢測。其為臨床診斷、細胞分離、檢測、細胞療法等領域帶來福音。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1是免疫磁珠分選技術的原理與流程圖。
[0047] 圖2是本發(fā)明基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統(tǒng)的原理與流程圖。
[0048] 圖3是單鏈核苷酸與抗體通過Thiol/Malemide結合示意圖。Ab :抗體；Oligo :單 鏈核苷酸；SH-:巰基。
[0049] 圖4是本發(fā)明分選的NK細胞流式細胞術檢測結果。
[0050] 圖5是本發(fā)明分選的CIK細胞流式細胞術檢測結果。
[0051] 圖6是本發(fā)明分選的DC細胞流式細胞術檢測結果。
[0052] 圖7是兩種方法分選的NK細胞培養(yǎng)后形態(tài)。A.流式細胞儀分選的細胞形態(tài)，B.本 發(fā)明分選的細胞形態(tài)。

【具體實施方式】
[0053] 下面結合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0054] 本發(fā)明基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統(tǒng)分選流程圖如圖2所示，步驟 包括：
[0055] ①選擇不同的抗體對不同目的細胞表面標記，合成兩個互補的單鏈寡核苷酸（約 20bp)，一個單鏈寡核苷酸末端修飾有Thiol (巰基），另一個單鏈寡核苷酸末端修飾有 Biotin (生物素）。
[0056] ②兩個單鏈寡核苷酸分別與被Maleimide(順丁烯二酰亞胺）修飾的抗體以及 Streptavidin(鏈霉親和素）包被的細胞分選介質表面進行反應，分別形成"細胞分選介質 /單鏈核苷酸"和"抗體/單鏈核苷酸"兩種結構。
[0057] ③在細胞樣品中加入"抗體/單鏈核苷酸"復合物，抗體將識別目的細胞上的表面 標記，并與細胞結合，形成"單鏈核苷酸/抗體/細胞"結構。
[0058] ④隨后將"細胞分選介質/單鏈核苷酸"結構加入到分離體系中，兩條單鏈核苷酸 通過堿基互補配對，形成"細胞分選介質/雙鏈核苷酸/抗體/細胞"結構。
[0059] ⑤當所述的細胞分選介質為磁珠時，則通過外加磁場的作用，目的細胞將被磁性 吸附，從而去除非目的細胞；當所述的細胞分選介質為磁珠以外的其它介質時，則使用相應 的吸附該介質的方法以去除非目的細胞。
[0060] ⑥針對不同的目的細胞，每次使用不同的限制性內切酶來剪切含有特定識別序列 的核苷酸，可以逐次洗脫不同的目的細胞，完成一次結合分離多種不同目的細胞。
[0061] 其中，以上步驟中，也可以先將"抗體/單鏈核苷酸"復合物與"細胞分選介質/單 鏈核苷酸"結合，隨后再加入到細胞樣品中。
[0062] 實施例1
[0063] 以免疫細胞治療為主導的細胞治療在癌癥治療方面有很大的作用，免疫細胞治療 中用到的主要細胞類型有：DC細胞、NK細胞和CIK細胞。這些細胞因培養(yǎng)條件不同，所以需 要分開后再進行培養(yǎng)才能取得良好的擴增效果。本實施例的目的是一次分離血液中的這三 種細胞，具體的分離方案如下：
[0064] 1實驗材料
[0065]① CD3、CD56 和 HLA-DR 抗體，購于 Biolegend 公司；
[0066] ②巰基與生物素修飾的單鏈核苷酸片段，合成于金唯智公司；
[0067] ③核酸內切酶BamH I、EcoR I、Hind III，購于NEB公司；
[0068] ④鏈霉親和素磁珠，購于東莞市漢諾生物技術有限公司；
[0069]⑤細胞培養(yǎng)基 X-VIV0?15Chemically Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium，購于美國Lonza公司；
[0070] ⑥洗脫緩沖液（限制性核酸內切酶的反應體系即NEB公司核酸內切酶的通用 Buffer)；
[0071] ⑦人外周血單核細胞，提取方法如下：
[0072] a收集人外周血樣品10mL，用2-4倍體積的PBS稀釋樣品；50mL離心管中加入15mL 淋巴細胞分離液；
[0073]b將稀釋的血液樣品緩慢加入到淋巴細胞分離液上，盡量使血液樣品保持在淋巴 細胞分離液上層；
[0074] c室溫X400gX30min，收集云霧層的PBMC細胞；
[0075]d 40mL無菌的PBS重懸PBMC細胞，室溫X200gX10min，去上清；
[0076]e 40mL無菌的PBS重懸一次，室溫X200gX10min，用凍存液重懸分裝凍存。
[0077] 2實驗方法
[0078] CD3、CD5和HLA-DR抗體（各種細胞表面的抗體如表1)分別與不同的單鏈核苷酸 片段結合，同時與其配對的單鏈核苷酸序列與不同的磁珠結合（核苷酸序列及核酸內切酶 如表2)，特異性的核酸內切酶配置在洗脫緩沖液中。
[0079] 生物素修飾的單鏈核苷酸與鏈霉親和素包被的磁珠結合反應條件為：二者混合在 37°C 反應 30min。
[0080] 巰基修飾的單鏈核苷酸與順丁烯二酰亞胺修飾的抗體結合反應使用Thermo公 司的 Imject Maleimide-Activated Mariculture KLH and Kit 試劑盒。具體原理為： sulfo-SMCC交聯(lián)劑修飾過的Malemide具有與巰基緊密結合的特性，且很穩(wěn)定；抗體與單鏈 核苷酸的連接依賴抗體蛋白的氨基與sulfo-SMCC交聯(lián)劑的S<V的相互作用；Malemide可 以與帶有巰基的單鏈核苷酸相互作用形成穩(wěn)定的硫醚鍵（參見圖3)。
[0081] 表1.各種細胞的主要表面標記
[0082]

【權利要求】
1. 基于核酸內切酶特異性識別的細胞分選系統(tǒng)在分選細胞中的應用，其特征在于，所 述的分選系統(tǒng)包含以下組分：第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質、限制 性內切酶；所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷酸互補，且互補區(qū)域含有所述限制性內 切酶的識別位點；所述的第一單鏈核苷酸、第二單鏈核苷酸、抗體、細胞分選介質均被修飾， 修飾后的第一單鏈核苷酸可與修飾后的抗體相連接，修飾后的第二單鏈核苷酸可與修飾后 的細胞分選介質相連接。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的第一單鏈核苷酸和第二單鏈核苷 酸為部分序列互補或完全互補。
3. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈核苷 酸的長度為6bp-lkb。
4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的第一單鏈核苷酸或第二單鏈核苷 酸的長度為18bp-50bp。
5. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的細胞分選介質為磁珠、分離柱或聚 陽離子納米顆粒。
6. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的第一單鏈核苷酸被巰基修飾，所述 的第二單鏈核苷酸被生物素修飾，所述的抗體被順丁烯二酰亞胺修飾，所述的磁珠被鏈霉 親和素修飾。
7. 分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞的試劑盒在分選DC細胞、NK細胞和CIK細胞中 的應用，其特征在于，所述的試劑盒包含以下組分：巰基與生物素修飾的三對單鏈核苷酸， ⑶3、⑶56和HLA-DR抗體，鏈霉親和素磁珠，限制性內切酶BamH I、EcoR I、Hind III。
8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的三對單鏈核苷酸的互補區(qū)域分別 包含限制性內切酶BamH I、EcoR I、Hind III的識別位點。
9. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的三對單鏈核苷酸的序列分別如SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6 所示。
【文檔編號】C12N5/0783GK104450617SQ201410737627
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權日:2014年12月5日
【發(fā)明者】藍田, J·蓋茨, 鄭敦武 申請人:賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司