甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及品種純度鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID3-5為特異性片段進(jìn)行檢測(cè)哈翠種子的純度。本發(fā)明提供一種快速高效的、無(wú)季節(jié)依賴(lài)性的、準(zhǔn)確的哈翠種子純度的檢測(cè)方法，該方法以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5為特異性片段進(jìn)行檢測(cè)，父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5是哈翠父母本間的穩(wěn)定差異片段序列，通過(guò)這兩個(gè)特異性片段進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)更為迅速，準(zhǔn)確。
【專(zhuān)利說(shuō)明】甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及品種純度鑒定領(lǐng)域，具體而言，涉及一種甜瓜品種哈翠種子純度的快 速檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 甜瓜是世界范圍的重要經(jīng)濟(jì)作物，在世界上的種植面積僅次于柑橘與香蕉，是全 球第三大水果作物，2009年全球的產(chǎn)量超過(guò)2500萬(wàn)噸。亞洲是甜瓜產(chǎn)量最大的產(chǎn)區(qū)，中國(guó) 是全球最大的甜瓜生產(chǎn)國(guó)。2010年全國(guó)甜瓜播種面積590萬(wàn)畝，總產(chǎn)量1226. 7萬(wàn)噸，產(chǎn)值 達(dá)460億元（許勇，2012)。甜瓜產(chǎn)業(yè)在全國(guó)種植業(yè)發(fā)展中占有極其重要的地位，對(duì)提高農(nóng) 民收入水平有重要的作用。哈密型甜瓜主要原產(chǎn)我國(guó)新疆，暢銷(xiāo)全國(guó)，揚(yáng)名海外，是世界上 的著名甜瓜類(lèi)型。隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展及育種家的不斷努力，使得哈密型甜瓜在新疆以外 的地區(qū)種植成功，極大地促進(jìn)了哈密瓜的生產(chǎn)。
[0003] 甜瓜新型品種"哈翠"是通過(guò)新疆哈密型甜瓜親本和亞洲型甜瓜親本雜交成功的 一個(gè)哈密型甜瓜優(yōu)良品種。該品種口感脆爽，果大美觀，產(chǎn)量高，主要種植于江浙及長(zhǎng)江流 域，深受市場(chǎng)喜愛(ài)。但目前甜瓜"哈翠"的制種仍是采用母本去雄雜交的方式進(jìn)行，這在操作 過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)母本去雄不完全從而導(dǎo)致雜交種不純的現(xiàn)象，對(duì)農(nóng)戶造成極大地?fù)p失， 同時(shí)會(huì)給公司的種子銷(xiāo)售帶來(lái)極大風(fēng)險(xiǎn)。目前，鑒定"哈翠"雜交種純度的方法主要是田間 性狀觀察，這樣既耗工又耗時(shí)。一種新型快速精確的鑒定方法迫在眉睫。
[0004] 鑒定種子純度的研究早已開(kāi)展，從早期的蛋白質(zhì)、同工酶、AFLP到目前的應(yīng)用 較廣泛的SSR標(biāo)記等。SSR標(biāo)記是一類(lèi)基于簡(jiǎn)單重復(fù)（simple sequence repeat)序列 的多態(tài)性標(biāo)記，目前廣泛應(yīng)用于各類(lèi)作物的多態(tài)性分析，遺傳作圖、基因定位及分子標(biāo)記 輔助育種等方面。現(xiàn)已報(bào)道的SSR引物已有1.3萬(wàn)多條（CuGen DB, Cucurbit Genomics Database)。SRAP標(biāo)記是由美國(guó)加州大學(xué)Li和Quiros于2001年提出的序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài) 性（sequence-related amplified polymorphism, SRAP)。SRAP 是在總結(jié)已有的 DNA 分子標(biāo) 記優(yōu)缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的一種新的基于PCR的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。其特點(diǎn)是針對(duì)基因外顯 子里GC含量豐富而啟動(dòng)子和內(nèi)含子里AT含量豐富的特點(diǎn)對(duì)ORFs (open reading frames, 開(kāi)放閱讀框）進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物長(zhǎng)17bp，5'端的前IObp是一段非 特異性的填充序列，緊接著是CCGG，它們一起組成核心序列，然后是靠著3'端的3個(gè)選擇 性堿基，對(duì)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。反向引物長(zhǎng)18bp，即由5'的11個(gè)無(wú)特異性的填充序列和緊 接著的AATT組成的核心序列，及3'的3個(gè)選擇性堿基，對(duì)內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異 擴(kuò)增。通過(guò)不同引物的組合測(cè)試，從而尋找和發(fā)現(xiàn)因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與 間隔長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物。SRAP標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、中等產(chǎn)量、高共顯性、重復(fù)性、易 于分離條帶及測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，也可以用于嘗試鑒定雜交種的種子的雜交情況及種子真實(shí)度， 從而獲得種子純度的數(shù)據(jù)較為可靠地?cái)?shù)據(jù)，對(duì)種子的繁育及銷(xiāo)售意義重大。
[0005] 在現(xiàn)有的文獻(xiàn)或?qū)＠?，SSR標(biāo)記主要用于生物性狀的標(biāo)記。在中國(guó)公布的專(zhuān)利 中，黃瓜種子純度的快速檢測(cè)方法中公開(kāi)了 SSR標(biāo)記在黃瓜純度檢測(cè)上的應(yīng)用。而如何將 SSR標(biāo)記應(yīng)用于甜瓜純度檢測(cè)中亟待研究。
[0006] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，該方法 通過(guò)選定哈翠種子的父本和母本的特異性基因序列，以該序列為基準(zhǔn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將樣 本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與純父本和純母本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比，來(lái)判斷樣本的純度，從而得知 哈翠種子是否為雜交種。本發(fā)明通過(guò)PCR擴(kuò)增的方式進(jìn)行檢測(cè)，更為客觀，準(zhǔn)確率高，并且 檢測(cè)快速高效、無(wú)季節(jié)依賴(lài)性。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0009] 甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5為特異性片段進(jìn)行檢測(cè)哈翠種子的純度；
[0010] 其中，父本序列SEQ ID 1-2為：
[0011] TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTATTTTCTCAAAAATCATATTATCTGA AACA- (GA) 18_19
[0012] - GTGTTTTTTGTTTATTTTATTTTTGAGTTGAATGAGAGTAAAAGCA ；
[0013] 母本序列SEQ ID 3-5為：
[0014] TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTATTTTCTCAAAAATCATATTATCTGA AACACA -（GA) 36_39- GTGTTTTTTGTTTATTTTTATTTTTGAGTTGAATGAGAGTAAAAGCA。
[0015] 針對(duì)目前甜瓜哈翠種子純度的檢測(cè)主要依靠對(duì)待測(cè)樣品農(nóng)藝性狀的觀察，費(fèi)工費(fèi) 時(shí)、占用大量土地且準(zhǔn)確率低下的方式，本發(fā)明提供一種快速高效的、無(wú)季節(jié)依賴(lài)性的、準(zhǔn) 確的哈翠種子純度的檢測(cè)方法，該方法以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5為 特異性片段進(jìn)行檢測(cè)，父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5是哈翠父母本間的穩(wěn) 定差異片段序列，通過(guò)這兩個(gè)特異性片段進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)更為迅速，準(zhǔn)確。
[0016] 其中，父本序列SEQ ID 1-2中的（GA) 18_19為18-19個(gè)GA重復(fù)序列；母本序列SEQ ID 3-5中的（GA) 36_39為36-39個(gè)GA重復(fù)序列。
[0017] 優(yōu)選地，以引物CMAGN75分別對(duì)哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母 本種子基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)哈翠種子純度；
[0018] 其中，所述引物CMAGN75為：
[0019] F :5' -TGGGTTTTCTTCTACTACTG-3'
[0020] R : 5，-TGCTTTTACTCTCATTCAAC-3，。
[0021] 通過(guò)多個(gè)引物的篩選，引物CMAGN75在甜瓜品種哈翠雜交種中穩(wěn)定存在；引物 CMAGN75在雜交種、父本和母本中的基因組中均能PCR擴(kuò)增得到條帶，但是，該引物在父本 中擴(kuò)增后得到的條帶較小，該引物在母本中擴(kuò)增后得到的條帶較大，該引物在雜交種中擴(kuò) 增后得到的條帶既含有父本的條帶也含有母本的條帶，通過(guò)這種區(qū)別，即可很好的將父本、 母本和雜交種很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)。
[0022] 通過(guò)分別將哈翠種子基因組、父本基因組和母本基因組以引物CMAGN75進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別得到待測(cè)哈翠種子的擴(kuò)增產(chǎn)物、父本基因組擴(kuò)增產(chǎn)物和母本基因組擴(kuò)增產(chǎn)物；將 待測(cè)哈翠種子的擴(kuò)增產(chǎn)物與父本基因組擴(kuò)增產(chǎn)物和母本基因組擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行條帶對(duì) t匕，從而得到種子的純度。具體為：若條帶只含有母本條帶，則哈翠種子雜交未成功，仍然只 是母本的基因序列；若條帶只含有父本條帶，則哈翠種子雜交未成功，仍然只是父本的基因 序列；若條帶既含有父本的條帶又含有母本的條帶，則哈翠種子雜交成功，為雜交種。
[0023] 采用CTAB法提取哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組， 簡(jiǎn)單易行，且提取得到的基因組雜質(zhì)含量少，濃度高，PCR擴(kuò)增的條帶清晰，雜帶少。優(yōu)選地， 哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組均通過(guò)CTAB法進(jìn)行提取。為 了便于提取種植的基因組，優(yōu)選地，提取基因組前將種子去除種皮。
[0024] 優(yōu)選地，引物CMAGN75的PCR反應(yīng)體系為10μ 1，包括以下成分：基因組15-25ng， 濃度為1〇1^上下游引物各0.24 1;1.254]\1的(1階1^2.754 1，10\131^€61'14 1，151111 MgCl2, 1 % Triton Χ-1002 μ I，5U/L 的 Taq DNA 聚合酶(λ 1 μ 1，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊至 10 μ 1 ;
[0025] 其中，IOXbuffer 中含有 500mM KCl, IOOmM Tris-HCl，Tris-HCl 在 25°C 的 pH 為 9. 0 〇
[0026] 以該成分的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，得到的PCR產(chǎn)物條帶的單一性強(qiáng)，且條帶清晰。 此外，PCR反應(yīng)體系也可以為常用的15 μ 1、20 μ 1、50 μ 1的體系，其中的成分相應(yīng)地增加即 可。
[0027] 優(yōu)選地，引物CMAGN75的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性3-5分鐘；94°C變性1分鐘； 54°C退火45秒；72°C延伸1分鐘；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5-10分鐘；產(chǎn)物4°C保存。以該程 序擴(kuò)增的產(chǎn)物含有雜帶少，條帶的濃度適當(dāng)，很好的滿足檢測(cè)的需要。
[0028] 進(jìn)一步地，引物CMAGN75的PCR產(chǎn)物用1. 8-2. 5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用 1. 8-2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)引物CMAGN75的PCR產(chǎn)物，即可將PCR產(chǎn)物分離開(kāi)來(lái)，很 好的達(dá)到檢測(cè)的目的。
[0029] 進(jìn)一步地，還包括以引物a20b37分別對(duì)哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和 哈翠母本種子基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)哈翠種子純度；
[0030] 所述引物a20b37為：
[0031] F : 5，-TGAGTCCAAACCGGCAT-3，
[0032] R : 5，-GACTGCGTACGAATTGCA-3，。
[0033] 由于育種方式的原因，商業(yè)化的栽培品種在父本間或者母本間仍存在一定的多樣 性，因此，單個(gè)父母本間擴(kuò)增出的差異條帶并不一定說(shuō)明是父母本間的穩(wěn)定的差異條帶。本 發(fā)明還從多對(duì)引物中挑選出引物a20b37,以引物a20b37分別對(duì)哈翠種子基因組、哈翠父本 種子基因組和哈翠母本種子基因組進(jìn)行擴(kuò)增，引物a20b37在哈翠父本種子基因組和哈翠 種子基因組中能穩(wěn)定的擴(kuò)增出約205bp大小的條帶；而在哈翠母本種子基因組中不能擴(kuò)增 出該條帶。由于引物a20b37能在父本和哈翠種子中均能擴(kuò)增出特定大小的條帶，以此，可 以鑒別得到種子是否只是母本的序列，從而排除只是母本的狀況。
[0034] 優(yōu)選地，引物a20b37的反應(yīng)總體系為10μ 1，包括以下成分：基因組15_25ng，濃 度為 ΙΟμΜ 上下游引物各 0·12μ1，1·25μΜ 的 dNTPs 1.2yl，10Xbyffer 1μ1，15πιΜ MgCl2, I % Triton X-100L 4 μ 1，5U/L 的 Taq DNA 聚合酶 0.12 μ 1，無(wú)菌重蒸水補(bǔ)齊至 10μ 1 ；
[0035] 其中，IOXbuffer 中含有 500mM KCl, IOOmM Tris-HCl，Tris-HCl 在 25°C 的 pH 為 9. 0 〇
[0036] 以該成分的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，得到的PCR產(chǎn)物條帶的單一性強(qiáng)，且條帶清晰。 此外，PCR反應(yīng)體系也可以為常用的15 μ 1、20 μ 1、50 μ 1的體系，其中的成分相應(yīng)地增加即 可。
[0037] 優(yōu)選地，引物a20b37的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3-5分鐘，94°C變性1分鐘、 35°C退火1分鐘、72°C延伸1分鐘，5個(gè)循環(huán)，94°C預(yù)變性1分鐘、50°C退火1分鐘、72°C延 伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，產(chǎn)物4°C保存。以該程序擴(kuò)增的產(chǎn)物含有雜帶少， 條帶的濃度適當(dāng)，很好的滿足檢測(cè)的需要。
[0038] 引物a20b37擴(kuò)增出的條帶較多，瓊脂糖電泳對(duì)條帶的分辨率較低，因此，選用 5-7%的非變性聚丙烯酰胺凝膠即可將條帶很好的分離開(kāi)來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的目的，進(jìn)一步 地，引物a20b37的PCR產(chǎn)物用5-7 %非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0040] (1)以父本序列SEQ ID 1-2和母本序列SEQ ID 3-5為特異性片段進(jìn)行檢測(cè)哈翠 種子的純度，可快速高效的、無(wú)季節(jié)依賴(lài)性的、準(zhǔn)確的檢測(cè)出哈翠種子的純度；
[0041] (2)特定選用引物CMAGN75鑒定哈翠種子的純度，很好的區(qū)分出雜交種子、父本種 子和母本種子，檢測(cè)方便易行，準(zhǔn)確率高；
[0042] (3)輔以引物a20b37鑒定哈翠種子的純度，進(jìn)一步確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性，使檢測(cè)更 為準(zhǔn)確。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0043] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0044] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中不同引物在父本和母本中擴(kuò)增的條帶；
[0045] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中引物CMAGN75在父本和母本中擴(kuò)增的條帶；
[0046] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中引物CMAGN75在父本、母本和雜交種中擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂 糖凝膠上的條帶；
[0047] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中引物a20b37在在父本、母本和雜交種中擴(kuò)增的條帶；
[0048] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中引物a20b37在父本和母本中擴(kuò)增的條帶。

【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過(guò)市售獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0050] 實(shí)施例1
[0051] 分別取哈翠母本種子、哈翠父本種子，分別剝?nèi)シN皮，利用CTAB法分別提取得到 哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組；
[0052] 將得到的基因組分別采用引物1-12(如表1所示）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系均 為1〇μ 1，包括以下成分：基因組15-25ng，濃度為ΙΟμΜ上下游引物各0. 2μ 1 ;1.25μΜ 的 dNTPs 2.75yl，10Xbuffer 1μ1，15πιΜ MgCl2，l %Triton X-100)2yl，5U/L 的 Taq DNA聚合酶0. 1 μ 1，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊至10 μ I ;其中，10Xbuffer中含有500mM KCl, IOOmM Tri s-HCl，Tris-HCl 在 25 °C 的 pH 為 9. 0 ;
[0053] 表1不同引物的基因序列
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征在于，以父本序列SEQ ID 1-2和母 本序列SEQ ID 3-5為特異性片段進(jìn)行檢測(cè)哈翠種子的純度； 其中，父本序列SEQ ID 1-2為： TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTA TTTTCTCAAAAATCATATTATCTGAAACA- (GA) 18_19 - GTGTTTTTTGTTTATTTTATTTTTGAGTTGAATGAGA GTAAAA GCA ； 母本序列SEQ ID 3-5為： TGGGTTTTCTTCTACTACTGTAATAATAAACAATTGAGTTTCTA TTTTCTCAAAAATCATATTATCTGAAACACA- (GA) 36-39- GTGTTTTTTGTTTATTTTTATTTTTGAGTTGAATG AGAGTAAAA GCA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征在于，以引 物CMAGN75分別對(duì)哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)哈翠種子純度； 其中，所述引物CMAGN75為： F :5' -TGGGTTTTCTTCTACTACTG-3' R :5' -TGCTTTTACTCTCATTCAAC-3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征在于，哈翠 種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組均通過(guò)CTAB法進(jìn)行提?。粌?yōu)選 地，提取基因組前將種子去除種皮。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征在于，弓丨 物CMAGN75的PCR反應(yīng)體系為lOiil，包括以下成分：基因組15-25ng，濃度為lOiiM上下 游引物各0.2111;1.2511]\1的（1階138 2.75111，10\1311打61'1111，1511111%(：12，1%1'1'行〇11 X-1002 ill，5U/L的Taq DNA聚合酶0? 1 ill，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊至10 ill ; 其中，lOXbuffer 中含有 500mM KC1, 100mM Tris-HCl，Tris-HCl 在 25°C的 pH 為 9. 0。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征在于，引物 CMAGN75的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性3-5分鐘；94°C變性1分鐘；54°C退火45秒；72°C 延伸1分鐘；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5-10分鐘；產(chǎn)物4°C保存。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征在于，還包 括以引物a20b37分別對(duì)哈翠種子基因組、哈翠父本種子基因組和哈翠母本種子基因組進(jìn) 行PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)哈翠種子純度； 所述引物a20b37為： F :5, -TGAGTCCAAACCGGCAT-3， R :5' -GACTGCGTACGAATTGCA-3'。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征在于，弓丨 物a20b37的反應(yīng)體系為lOiil，包括以下成分：基因組15-25ng，濃度為10iiM上下游 引物各 0? 12 y 1，1. 25 ii M 的 dNTPs 1. 2 y 1，10Xb ii ffer 1 y 1，15mM MgCl2, 1 % Triton X-1001.4iil，5U/L的Taq DNA聚合酶0. 12iU，無(wú)菌重蒸水補(bǔ)齊至lOiil ; 其中，lOXbuffer 中含有 500mM KC1, lOOmM Tris-HCl，Tris-HCl 在 25°C的 pH 為 9. 0。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征在于，引物 a20b37的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3-5分鐘，94°C變性1分鐘、35°C退火1分鐘、72°C延 伸1分鐘，5個(gè)循環(huán)，94°C預(yù)變性1分鐘、50°C退火1分鐘、72°C延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)，72°C 延伸10分鐘，產(chǎn)物4°C保存。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征在 于，引物CMAGN75的PCR產(chǎn)物用1. 8-2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的甜瓜品種哈翠種子純度的快速檢測(cè)方法，其特征 在于，引物a20b37的PCR產(chǎn)物用5-7%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104404155SQ201410737266
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】巫水欽, 郭誠(chéng), 肖建成, 余永輝, 俞金龍 申請(qǐng)人:浙江美之奧種業(yè)有限公司