1.一種獲得抗草甘膦植物的方法，包括如下步驟：僅將目的植物的內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的第8位的蘇氨酸替換為異亮氨酸，第12位的脯氨酸替換為絲氨酸，所得植物即為抗草甘膦植物；所述內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO：2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述“僅將目的植物的內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的第8位的蘇氨酸替換為異亮氨酸，第12位的脯氨酸替換為絲氨酸”是通過如下實(shí)現(xiàn)的：向所述目的植物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入如下a)或b)或c)或d)或e)或f)，再將導(dǎo)入后的細(xì)胞或組織培養(yǎng)成完整植株；
a)遺傳物質(zhì)1、遺傳物質(zhì)2和donor載體；所述遺傳物質(zhì)1為能夠表達(dá)序列特異性核酸酶1的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；所述遺傳物質(zhì)2為能夠表達(dá)序列特異性核酸酶2的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；
b)遺傳物質(zhì)12和所述donor載體；所述遺傳物質(zhì)12為既能夠表達(dá)所述序列特異性核酸酶1也能表達(dá)所述序列特異性核酸酶2的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；
c)非遺傳物質(zhì)1、非遺傳物質(zhì)2和所述donor載體；所述非遺傳物質(zhì)1為表達(dá)所述序列特異性核酸酶1的mRNA；所述非遺傳物質(zhì)2為表達(dá)所述序列特異性核酸酶2的mRNA；
d)非遺傳物質(zhì)1、非遺傳物質(zhì)2和所述donor載體；所述非遺傳物質(zhì)1為體外表達(dá)序列特異性核酸酶1的蛋白質(zhì)；所述非遺傳物質(zhì)2為體外表達(dá)序列特異性核酸酶2的蛋白質(zhì)；
e)所述donor載體；
f)既能夠表達(dá)序列特異性核酸酶1也能表達(dá)序列特異性核酸酶2的donor載體；
所述donor載體為攜帶有突變目的靶序列的載體；所述突變目的靶序列含有將所述目的植物的基因組中包含待突變核苷酸的自靶標(biāo)片段1的5’末端起到靶標(biāo)片段2的3’末端止的這段DNA片段進(jìn)行核苷酸突變后得到的DNA片段序列；所述靶標(biāo)片段1位于所述目的植物的基因組中編碼所述內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸的核苷酸序列上游的內(nèi)含子區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)；所述靶標(biāo)片段2位于所述目的植物的基因組中編碼所述內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列下游的內(nèi)含子區(qū)或3’-UTR區(qū)；所述核苷酸突變?yōu)槟軌驅(qū)崿F(xiàn)僅將所述目的植物的內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的第8位的蘇氨酸替換為異亮氨酸，第12位的脯氨酸替換為絲氨酸的突變；
所述序列特異性核酸酶1能夠特異性切割所述目的植物的基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段1；所述序列特異性核酸酶2能夠特異性切割所述目的植物的基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述序列特異性核酸酶1為CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN核酸酶、鋅指核酸酶或所有能實(shí)現(xiàn)基因組編輯的核酸酶；所述序列特異性核酸酶2為CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN核酸酶、鋅指核酸酶或所有能實(shí)現(xiàn)基因組編輯的核酸酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；
具體的，所述單子葉植物為禾本科植物；
更加具體的，所述禾本科植物為水稻。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述靶標(biāo)片段1位于所述目的植物的基因組中編碼所述內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列上游的內(nèi)含子區(qū)，將該內(nèi)含子區(qū)記為內(nèi)含子區(qū)1；所述內(nèi)含子區(qū)1的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:3的第1-704位；所述序列特異性核酸酶1和所述序列特異性核酸酶2均為CRISPR/Cas9核酸酶，所述靶標(biāo)片段1為序列表中SEQ ID NO:3的第1-704所示核苷酸序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列規(guī)則的片段；N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30，且X為整數(shù)，NX表示X個(gè)連續(xù)的核苷酸；和/或
所述靶標(biāo)片段2位于所述目的植物的基因組中編碼所述內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列下游的內(nèi)含子區(qū)，將該內(nèi)含子區(qū)記為內(nèi)含子區(qū)2；所述內(nèi)含子區(qū)2的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:3的第950-1030位；所述序列特異性核酸酶1和所述序列特異性核酸酶2均為CRISPR/Cas9核酸酶，所述靶標(biāo)片段2為序列表中SEQ ID NO:3的第950-1030位所示核苷酸序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列規(guī)則的片段；N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30，且X為整數(shù)，NX表示X個(gè)連續(xù)的核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述靶標(biāo)片段1的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:4；所述靶標(biāo)片段2的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述遺傳物質(zhì)1為將pHUN411載體的兩個(gè)限制性內(nèi)切酶BsaI的切割位點(diǎn)之間的片段替換為序列表中SEQ ID NO:4的第1-20位所示核苷酸片段后得到的重組質(zhì)粒；所述遺傳物質(zhì)2為將pHUN411載體的兩個(gè)限制性內(nèi)切酶BsaI的切割位點(diǎn)之間的片段替換為序列表中SEQ ID NO:5的第1-20位所示核苷酸片段后得到的重組質(zhì)粒；或
所述donor載體上攜帶的所述突變目的靶序列的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:6。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于：所述細(xì)胞為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細(xì)胞；所述組織為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織；
具體的，所述細(xì)胞為原生質(zhì)體細(xì)胞或懸浮細(xì)胞；所述組織為愈傷組織、幼胚或成熟胚；
向所述目的植物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入所述a)或所述b)或所述c)或所述d)或所述e)的方法為基因槍法、農(nóng)桿菌侵染法、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法或其他任何導(dǎo)入方法。
9.如下生物材料中的任一種：
(1)蛋白質(zhì)，為僅將水稻內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列的第8位的蘇氨酸替換為異亮氨酸，第12位的脯氨酸替換為絲氨酸后所得的蛋白；所述水稻內(nèi)源EPSPS蛋白的保守區(qū)氨基酸序列為序列表中序列2；
(2)所述蛋白質(zhì)的編碼基因；
(3)含有所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
10.一種在目的生物中對(duì)目的基因中的目的核苷酸進(jìn)行替換的方法，是通過向目的生物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入如下a)或b)或c)或d)或e)，實(shí)現(xiàn)對(duì)所述目的生物中所述目的基因的目的核苷酸的替換：
a)遺傳物質(zhì)1、遺傳物質(zhì)2和donor載體；所述遺傳物質(zhì)1為能夠表達(dá)序列特異性核酸酶1的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；所述遺傳物質(zhì)2為能夠表達(dá)序列特異性核酸酶2的DNA環(huán)狀質(zhì)粒或DNA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；
b)遺傳物質(zhì)12和所述donor載體；所述遺傳物質(zhì)12為既能夠表達(dá)所述序列特異性核酸酶1也能表達(dá)所述序列特異性核酸酶2的DNA環(huán)狀質(zhì)?；駾NA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA；
c)非遺傳物質(zhì)1、非遺傳物質(zhì)2和所述donor載體；所述非遺傳物質(zhì)1為表達(dá)所述序列特異性核酸酶1的mRNA；所述非遺傳物質(zhì)2為表達(dá)所述序列特異性核酸酶2的mRNA；
d)非遺傳物質(zhì)1、非遺傳物質(zhì)2和所述donor載體；所述非遺傳物質(zhì)1為體外表達(dá)序列特異性核酸酶1的蛋白質(zhì)；所述非遺傳物質(zhì)2為體外表達(dá)序列特異性核酸酶2的蛋白質(zhì)；
e)既能夠表達(dá)序列特異性核酸酶1也能表達(dá)序列特異性核酸酶2的donor載體；
所述donor載體為攜帶有突變目的靶序列的載體；所述突變目的靶序列含有將所述目的生物的基因組中包含待替換核苷酸的自靶標(biāo)片段1的5’末端起到靶標(biāo)片段2的3’末端止的這段DNA片段進(jìn)行所述目的核苷酸替換后得到的DNA片段序列；所述靶標(biāo)片段1位于所述目的生物的基因組中所述目的基因的目的核苷酸上游的內(nèi)含子區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)；所述靶標(biāo)片段2位于所述目的生物的基因組中所述目的基因的目的核苷酸下游的內(nèi)含子區(qū)或3’-UTR區(qū)；
所述序列特異性核酸酶1能夠特異性切割所述目的生物的基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段1；所述序列特異性核酸酶2能夠特異性切割所述目的生物的基因組中和所述donor載體中的所述靶標(biāo)片段2。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于：所述序列特異性核酸酶1為CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN核酸酶、鋅指核酸酶或所有能實(shí)現(xiàn)基因組編輯的核酸酶；所述序列特異性核酸酶2為CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN核酸酶、鋅指核酸酶或所有能實(shí)現(xiàn)基因組編輯的核酸酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求10-11中任一項(xiàng)的方法，其特征在于：所述目的生物是植物，包括單子葉植物或雙子葉植物，例如水稻或擬南芥。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于：所述細(xì)胞為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細(xì)胞；所述組織為任何能作為導(dǎo)入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織；
具體的，所述細(xì)胞為原生質(zhì)體細(xì)胞或懸浮細(xì)胞；所述組織為愈傷組織、幼胚或成熟胚；
向所述目的植物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入所述a)或所述b)或所述c)或所述d)或所述e)的方法為基因槍法、農(nóng)桿菌侵染法、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法或其他任何導(dǎo)入方法。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述植物是擬南芥，所述目的基因是SEQ ID NO:9所示的Atsnc1(At4g16890)，其中所述序列特異性核酸酶1包含對(duì)應(yīng)SEQ ID NO:13的sgRNA，所述序列特異性核酸酶2包含對(duì)應(yīng)SEQ ID NO:14的sgRNA，所述突變目的靶序列示于SEQ ID NO：14，所述目的核苷酸的替換使得Atsnc1外顯子3編碼的序列由SEQ ID NO：10突變?yōu)镾EQ ID NO：11，由此賦予植物對(duì)Pseudomonas syringae pv maculicola ES4326和Peronosporaparasitica Noco2的抗性。