鼻咽癌診治標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及鼻咽癌診治標(biāo)志物及其應(yīng)用，更具體的 涉及mir-326和/或miR-326在診治鼻咽癌中的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] miRNA通常由RNA聚合酶II (Pol II)轉(zhuǎn)錄生成。Pol II結(jié)合在以后形成發(fā)夾結(jié) 構(gòu)的頸環(huán)DNA序列附近。生成的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)修飾添加5'帽子結(jié)構(gòu)和3'末端多腺苷酸尾巴結(jié) 構(gòu)，并剪切，生成的產(chǎn)物稱為初級miRNA (pri-miRNA)，該產(chǎn)物可能長達(dá)數(shù)千或數(shù)百核苷酸， 可能包含多個miRNA環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0003] 單個pri-miRNA可能含一到六個miRNA前體。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)每個由約70nt左右的 核苷酸組成。每個發(fā)卡結(jié)構(gòu)附以部分序列以利于有效剪切處理。pri-miRNA中的雙鏈發(fā)夾 RNA 結(jié)構(gòu)被叫做 DGCR8 的核蛋白（DiGeorge Syndrome Critical Region 8)辨認(rèn)，DGCR8 同 Drosha酶一起形成微處理（microprocessor)復(fù)合體。在該復(fù)合體中，DGCR8組織Drosha 蛋白的RNase III結(jié)構(gòu)域使其在距離發(fā)卡結(jié)構(gòu)約11個核苷酸處切割pri-miRNA，使其釋放 發(fā)卡結(jié)構(gòu)。釋放的發(fā)卡結(jié)構(gòu)即為前miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在3'存在兩個懸空的核 苷酸，pre-miRNA 5'為磷酸集團(tuán)，3'為羥基集團(tuán)。
[0004] 在胞漿中，pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)經(jīng)RNase III Dicer切割處理。這種內(nèi)源性核糖 核酸酶（endoribonuclease)與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3'相互作用并在環(huán)的3'和5'臂上完成切割， 產(chǎn)生長約22nt并不完美匹配的miRNA :miRNA*雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0005] miRNA與靶mRNA的典型作用方式主要有兩種。在大多數(shù)情況下，復(fù)合物中的單 鏈miRNA與靶mRNA的3' UTR不完全互補配對，阻斷靶基因的翻譯，從而調(diào)芐基因表達(dá)。這 種方式主要影響蛋白表達(dá)水平，并不影響mRNA的穩(wěn)定性。近來，有研宄對翻譯抑制理論提 出質(zhì)疑，發(fā)現(xiàn)被抑制的革G mRNAs和miRNAs共同聚集于胞衆(zhòng)中被稱為P小體（processing bodies，P_bodies)的區(qū)域，這個區(qū)域還濃縮了許多參與mRNA降解的酶類。P小體可能是作 為未翻譯mRNA進(jìn)行暫時的可逆儲存的容器，減少一些特定P小體組成蛋白的表達(dá)能夠緩和 miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制作用。P小體是胞漿中的一定區(qū)域，它包含參與多種轉(zhuǎn)錄后過程 的蛋白質(zhì)，例如：mRNA 降解（mRNA degradation)、無義介導(dǎo) mRNA 衰退（nonsense-mediated mRNA decay, NMD)，轉(zhuǎn)錄抑制及 RNA 介導(dǎo)的基因沉默（RNA-mediated gene silencing)。
[0006] 另一種作用方式與siRNA類似，當(dāng)miRNA與mRNA完全互補配對時，Ago2蛋白通過 切割mRNA直接導(dǎo)致其降解，實現(xiàn)基因沉默。以siRNA參與的RNAi為例：siRNA可與RISC結(jié) 合，作為模板識別mRNA靶子，通過堿基互補配對原則，mRNA與siRNA中的反義鏈結(jié)合，置換 出正義鏈。雙鏈mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下產(chǎn)生22nt左右的siRNA，siRNA 繼續(xù)同RISC形成復(fù)合體，與siRNA互補的mRNA結(jié)合，使mRNA被RNA酶裂解。這個過程也 稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS)。
[0007] 總之，當(dāng)前認(rèn)為miRNA以何種方式與目的基因作用和miRNA與目的基因的配對程 度有關(guān)。miRNA與目的基因配對不完全時，miRNA就以抑制目的基因的表達(dá)發(fā)揮作用；miRNA 與目的基因某段序列配對完全時，就可能引起目的基因在互補區(qū)斷裂而導(dǎo)致基因沉默。另 外，miRNAs有時候也導(dǎo)致組氨酸修飾和啟動子區(qū)的DNA甲基化，從而影響靶基因的表達(dá)。除 此外，近來發(fā)現(xiàn)快速脫腺苷酸化（accelerated deadenylation)是miRNA抑制基因表達(dá)的 新機制。在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-125b和let-7能夠促進(jìn)mRNA聚腺苷酸尾巴（polyA tail)的去除。用3'組蛋白莖-環(huán)結(jié)構(gòu)取代聚腺苷酸尾巴，不但可以消除miR-125b對mRNA 含量的影響，還可以降低對蛋白質(zhì)合成的作用，可見miRNA能通過降低翻譯效率和聚腺苷 酸化mRNA的濃度來抑制基因表達(dá)。
[0008] 鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種發(fā)生于鼻咽粘膜，具有較高惡性 程度和極強轉(zhuǎn)移能力的惡性腫瘤。鼻咽癌是多基因遺傳性疾病，其發(fā)病與遺傳因素（遺傳 易感性）、EB病毒感染、環(huán)境因素、飲食習(xí)慣等多種因素有關(guān)，早期診斷、早期治療是挽救患 者生命和提高生活質(zhì)量的最有效手段。遺憾的是，鼻咽癌起病隱匿，具有強烈的轉(zhuǎn)移傾向。 據(jù)統(tǒng)計，約75%的患者在就診時就已到達(dá)晚期，發(fā)生局部淋巴結(jié)和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療后復(fù) 發(fā)或轉(zhuǎn)移則預(yù)后極差，成為鼻咽癌治療失敗的主要原因。因此，篩查鼻咽癌的腫瘤標(biāo)記物， 爭取早期發(fā)現(xiàn)、選擇最佳治療方案、預(yù)測預(yù)后、監(jiān)測復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移對鼻咽癌診療具有重要的臨 床意義。
[0009] 本發(fā)明通過高通量測序分析鼻咽癌組織，獲得其miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)而進(jìn)行生物 信息學(xué)分析，選取后備miRNA進(jìn)行分子生物學(xué)驗證，結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的miRNA和鼻咽 癌密切相關(guān)，可用于臨床診斷及預(yù)防檢測，具有很好的實際應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供mir-326和/或其成熟miRNA在制備預(yù)防、診斷和/或治療 肺腺癌轉(zhuǎn)移試劑中的應(yīng)用。mir-326的序列見序列表SEQ ID NO 1。mir-326的成熟miRNA 為miR-326其序列見序列表SEQ ID NO 2。
[0011] 進(jìn)一步，所述的預(yù)防、診斷肺腺癌轉(zhuǎn)移試劑包括基于高通量測序方法和/或基于 定量PCR方法和/或基于探針雜交方法檢測肺腺癌樣本中mir-326和/或miR-326的轉(zhuǎn) 錄或基于免疫檢測方法檢測肺腺癌樣本中miR-326調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況，優(yōu)選采用 northern雜交方法、miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺腺癌樣本中mir-326和/或miR-326的轉(zhuǎn)錄；采用ELISA和/或膠體金 試紙條檢測肺腺癌樣本中miR-326調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。
[0012] 優(yōu)選的，所述的基于定量PCR方法包括特異性擴增mir-326和/或miR-326的引 物；所述的基于探針雜交方法包括與mir-326和/或miR-326的核酸序列雜交的探針；所述 免疫檢測方法包括與miR-326調(diào)控基因表達(dá)蛋白特異性結(jié)合的抗體。
[0013] 進(jìn)一步，所述的治療肺腺癌轉(zhuǎn)移試劑包括抑制劑和/或抑制劑組合物下調(diào) mir-326和/或miR-326的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-326的活性。
[0014] 優(yōu)選的，采用反義寡核苷酸、antagomiRs、miRNA 海綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-326和/或miR-326的轉(zhuǎn)錄和/或阻 斷miR-326的活性。
[0015] 本發(fā)明的目的還在于提供一種抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于，所述抑制肺腺 癌轉(zhuǎn)移試劑包含：
[0016] (a)抑制劑和/或抑制劑組合物，所述的抑制劑和/或抑制劑組合物下調(diào)mir-326 和/或miR-326的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷miR-326的活性；
[0017] (b)藥劑學(xué)上能接受的載體。
[0018] 優(yōu)選的，采用反義寡核苷酸、antagomiRs、miRNA 海綿、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀點反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-326和/或miR-326的轉(zhuǎn)錄和/或阻 斷miR-326的活性。
[0019] 本發(fā)明的目的還在于提供一