專利名稱：miRNA-219化合物作為腦膠質(zhì)瘤標(biāo)志物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種RNA小分子的用途，尤其是涉及miRNA-219的用途，屬于生物醫(yī)學(xué) 材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
最近的研究表明，miRNAs可以起到腫瘤抑制基因或者癌基因的功能，其突變或者 異位表達(dá)與人類癌癥密切相關(guān)。腦膠質(zhì)瘤是成年人最為頻發(fā)的腦惡性腫瘤。研究報(bào)道顯示， 腦膠質(zhì)瘤中一些miRNAs(如miR-21, miR-10b, miR-221/222, miR-26a, miR-124, miR-128 和miR-34a)發(fā)生失調(diào)會(huì)影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、浸潤、轉(zhuǎn)移和血管新生。尋找miRNA靶基 因，揭示其作用機(jī)制，不僅是后基因組時(shí)代需要解決的問題之一，也有望為腫瘤和其它疾病 的診斷和治療提供新的策略。
miRNAs在腦中的表達(dá)極為豐富，但對(duì)其功能的詮釋仍處于起步階段。Miska等利 用Northern印跡方法對(duì)在特定組織器官表達(dá)的miRNA進(jìn)行了研究時(shí)發(fā)現(xiàn)7個(gè)miRNA在人 腦中特異表達(dá)，這些 miRNA 是 miRNA-9，-124a, -124b, -135，-153，-183 和-219。已有的研 究表明，miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著極其重要的作用，如miRNA-219能調(diào)控少突膠質(zhì) 細(xì)胞的發(fā)育，miRNA-134可以調(diào)控大鼠神經(jīng)元樹突棘的大小。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞在miRNA-134的存 在的情況下，樹突數(shù)量會(huì)減少，從而減弱突出的形成；當(dāng)miRNA-134被抑制后，樹突數(shù)量就 會(huì)增加，突觸連接也因此增強(qiáng)。進(jìn)一步的研究表明，miRNA-134對(duì)神經(jīng)元樹突形成影響的可 能機(jī)制是其能抑制Limkl基因的表達(dá)。由于Limkl基因缺失與威廉綜合征相關(guān)，因此推測(cè) miRNA-134可能與一些神經(jīng)疾病如弱智和自閉癥相關(guān)。Krichevsky等的研究發(fā)現(xiàn)miRNA_9 和miRNA-131在PS-I敲除小鼠E17. 5顯著下調(diào)，因此推斷它們?cè)谏窠?jīng)退行性疾病中發(fā)揮調(diào) 控作用。
關(guān)于miRNA-219作為腦膠質(zhì)瘤一種抑癌基因的用途和作為腦膠質(zhì)瘤診斷的一種 標(biāo)志物的用途目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供miRNA-219作為腦膠質(zhì)瘤臨床診斷標(biāo)志物的應(yīng)用。
本發(fā)明旨在提供miRNA-219作為制備治療腦腫瘤藥物的應(yīng)用。
首先采用整胚原位雜交檢測(cè)了 miR-219在斑馬魚胚胎^ipf到7 ipf時(shí)空表達(dá)模 式，觀察到在16hpf已經(jīng)在后腦明顯表達(dá)(圖1A)。新近研究表明，miR-219在小鼠對(duì)少突 膠質(zhì)前體細(xì)胞具有調(diào)控作用。因此，設(shè)想miR-219可能在斑馬魚神經(jīng)管發(fā)育過程中也發(fā)揮 重要作用。采用反義抑制技術(shù)和過表達(dá)技術(shù)(圖IB和C)研究了 miR-219在斑馬魚胚胎發(fā) 育過程中所起到的作用。采用TUNEL法我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-219會(huì)引起斑馬魚胚胎頭部細(xì) 胞凋亡現(xiàn)象(圖2A)。B)pH3染色觀察抑制miR-219表達(dá)則引起斑馬魚胚胎頭部細(xì)胞的增 生(圖2B)。對(duì)miR-219、NtlA和Siha整胚原位雜交的組織學(xué)分析表明，miR-219在神經(jīng)管 中特異表達(dá)(圖2C)。綜合這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，采用本研究室發(fā)展的斑馬魚miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件ZfinTar對(duì)miR-219靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Gl i2a的3 ‘UTR區(qū)和Pdgfra的CDS區(qū)含有miR-219 結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。進(jìn)一步我們克隆了含有miR-219結(jié)合位點(diǎn)的基因序列進(jìn)行斑馬魚的體 內(nèi)3，UTR報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果顯示miR-219能結(jié)合在Gli2a的3 ‘UTR區(qū)和Pdgfra的CDS 區(qū)，而不能結(jié)合它們的突變體序列上。因此推測(cè)Glih和Pdgfra可能是miR-219的直接靶 標(biāo)(圖3B)。
已有研究表明，Gli2和Pdgfra不僅在胚胎發(fā)育過程中對(duì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞具 有調(diào)控作用，而且在腦腫瘤的發(fā)生中起著重要作用。因此在上述工作的基礎(chǔ)上，采用猜想 miR-219可能在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中調(diào)控Gli2和Pdgfra，充當(dāng)抑癌基因角色。為此，采集 了腦膠質(zhì)瘤臨床樣本對(duì)其miRNA進(jìn)行De印-sequencing分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-219在腦膠質(zhì) 瘤組織樣品中顯著下調(diào)(圖4A)。為了證實(shí)這個(gè)的發(fā)現(xiàn)，用RNA印跡雜交技術(shù)分析了腦膠質(zhì) 瘤臨床樣本和6個(gè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(SW1783，U138, U251, U87, U373，TJ905)及1個(gè)神經(jīng) 母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SK-N-SH)，發(fā)現(xiàn)miR-219在所有組織樣品和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中均顯著下 調(diào)(圖4B)。進(jìn)一步的分析表明，過表達(dá)miR-219可顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲作用(圖 4C)和引起腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡(圖4D)。蛋白免疫印跡分析Caspase-3的表達(dá)情況進(jìn)一步 證實(shí)miR-219在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)會(huì)介導(dǎo)CaSpaSe-3(C3)的激活(圖4E)。隨后，通過 MiRanda vl. Ob (Enright et al. 2003)預(yù)測(cè)軟件針對(duì)miR-219可能作用靴基因的3，UTR和 ⑶S區(qū)域進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)人類Gli2和Pdgfra的⑶S序列中含有miR-219的保守作用位點(diǎn)。 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)mir-219能能分別結(jié)合在Gli2和Pdgfra的⑶S區(qū)，顯著抑制Gli2 和Pdgfra質(zhì)粒的熒光表達(dá)(圖5A)。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，在U87和U251細(xì)胞系中過表 達(dá)miR-219可顯著抑制Gli2和Pdgfra蛋白的生成(圖5B)。這些研究結(jié)果均提示miR-219 在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中可能通過抑制Gli2和Pdgfra的生成而發(fā)揮抑癌基因的作用。
最后，本發(fā)明探討了 miRNA-219在腦膠質(zhì)瘤早期診斷中的意義。對(duì)miR-219在人 腦膠質(zhì)瘤組織樣品進(jìn)行了定量檢測(cè)。人腦膠質(zhì)瘤組織樣品包括正常組8例，II期7例，III 期7例，IV期8例。研究證實(shí)miRNA-219在腦膠質(zhì)瘤發(fā)展的不同臨床時(shí)期的表達(dá)水平均顯 著下調(diào)(圖6A)。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析表明Pdgfra、Gli2、ERKl/2和pErkl/2在腦膠質(zhì)瘤 組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著上調(diào)(圖6B)，進(jìn)一步證實(shí)了 Pdgfra和Gli2同miR-219的 相互關(guān)系。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)miR-219在腦膠質(zhì)瘤和神經(jīng)管發(fā)育過程中均能調(diào)控Hh-Gli信號(hào) 傳導(dǎo)通路。作為腫瘤抑制基因，miR-219能顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和浸潤。對(duì)腦膠質(zhì) 瘤臨床標(biāo)本進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)，miR-219在腦膠質(zhì)瘤各時(shí)期的表達(dá)均顯著下調(diào)。研究結(jié)果表明， 通過檢定或干涉人腦膠質(zhì)瘤中miR-219的表達(dá)可為腦膠質(zhì)瘤提供新的診斷或治療方案。


圖1. miR-219時(shí)空表達(dá)模式。
A)整胚原位雜交檢測(cè)斑馬魚^ipf到72hpf的mir-219的表達(dá)，紫色區(qū)域(BM Purple顯色)表明miR-219的表達(dá)部位，在16hpf已經(jīng)在后腦明顯表達(dá)。
B)整胚原位雜交檢測(cè)注射M0219的胚胎在30hpf時(shí)miR219的表達(dá)情況。
ONorthern Blotting 檢測(cè)注射 Pre-mir-219 和 M0219 的胚胎在 30hpf 時(shí) miR219 的表達(dá)情況.圖2. miR-219在斑馬魚中的靶標(biāo)預(yù)測(cè)。
A) TUNEL法檢測(cè)整胚細(xì)胞凋亡情況。
B) pH3染色觀察M0-219注射后細(xì)胞的增生情況。
C)miR-219、NtlA和Shha整胚原位雜交的組織學(xué)分析。結(jié)果表明miR-219在神經(jīng) 管中特異表達(dá)。這提示miR-219可能參與了少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的調(diào)控。
D)本研究室發(fā)展的斑馬魚miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件ZfinTar工作流程。
圖 3. miR-219 靴向作用 Gli2a and Pdgfra。
Α)采用本研究室發(fā)展的ZfinTar軟件預(yù)測(cè)miR-219的靶標(biāo)。結(jié)果表明Gli2a的 3 ‘UTR區(qū)和Pdgfra的CDS區(qū)含有miR-219結(jié)合位點(diǎn)。
B)斑馬魚的體內(nèi)3’UTR報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果提示miR-219能顯著抑制Gli2a and Pdgfra的翻譯過程。
圖4. miR-219在腦膠質(zhì)瘤中充當(dāng)抑癌基因角色。
A) Deep-sequencing檢測(cè)miR-219在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。
B) RNA印跡雜交分析miR_29a在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。miR_29a在正常人腦組織中 高表達(dá)而在腦膠質(zhì)瘤tissue及細(xì)胞系中低表達(dá)。
C)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251轉(zhuǎn)染miR-29a后侵襲實(shí)驗(yàn)分析(X 200)。
D) Annexin V細(xì)胞染色標(biāo)定檢測(cè)凋亡。圖示右下峰為早期凋亡的細(xì)胞，而右上峰 則為晚期凋亡的細(xì)胞。在U87和U251細(xì)胞系中，miR-29a可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
E)蛋白免疫印跡分析Caspase-3的表達(dá)情況。miRj9a在U87細(xì)胞系中過表達(dá)會(huì) 介導(dǎo)Caspase_3(C3)的激活。Bet-actin (bA)作為內(nèi)參照。
圖 5. miR-219 靴向作用于 Gli2 和 Pdgfra。
A)mir-219在U87細(xì)胞中的過表達(dá)可顯著抑制Gli2和Pdgfra報(bào)告質(zhì)粒的熒光表 達(dá)。(n=3;*p < 0.05)。下圖示miR-219對(duì)Gli2和Pdgfra的預(yù)測(cè)位點(diǎn)及其在不同物種中 的保守情況。首先通過MiRanda vl. Ob (Enright et al. 2003)預(yù)測(cè)軟件針對(duì)miRj9a可 能作用靶基因的3’UTR和CDS區(qū)域進(jìn)行搜索，然后在UCSC的基因組窗口瀏覽器中分析預(yù)測(cè) 位點(diǎn)的保守型情況(NCBI36/hgl8，http://genome, ucsc. edu/,紅色框標(biāo)示相應(yīng)預(yù)測(cè)位點(diǎn))。
B)蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Gli2和Pdgfra在U87和U251細(xì)胞系中的表達(dá)。Gli2 和Pdgfra均呈顯著下調(diào)。
圖6，mir-219在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)同惡性程度負(fù)相關(guān)。
A)實(shí)時(shí)定量PCR分析mir19a/b在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。正常組織來源于無病 個(gè)體(n=8);II期(n=7);III期(n=7);IV期(n=8)。U6 rRNA作為對(duì)照。Cl和C2分別為淋 巴瘤和肺癌腦轉(zhuǎn)移癌癥樣品。
B)和C)分別為蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析Pdgfra、Gli2、ERKl/2和pErkl/2在腦膠 質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況。結(jié)果表明Pdgfra、Gli2、ERK1/2和pErkl/2在腦膠質(zhì) 瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著上調(diào)。N:正常人腦組織；Cl-6: U138, U351, U87, U373, TJ905和SK-N-SH。Beta-actin作為對(duì)照。Mann-Whitney檢驗(yàn)被用來比較腫瘤組織及腫 瘤細(xì)胞與正常組織的差異。散點(diǎn)圖標(biāo)示miR-29a在三個(gè)不同組的表達(dá)，橫線標(biāo)示中值。數(shù) 據(jù)分析使用GraphPad prism5軟件，p<0. 05具有統(tǒng)計(jì)顯著性。
具體實(shí)施方式
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用斑馬魚均為TUbingen品系，購自上海第二醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)基因組國家重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室。繁殖飼養(yǎng)與交配取卵參照斑馬魚手冊(cè)中的方法進(jìn)行，水溫為28. 5°C，明/暗光照周 期為14h/10h，胚胎培養(yǎng)液為Holtfreter buffer,部分胚胎用0. 003%的PTU處理來阻止色 素形成。
2.反義抑制技術(shù)和過表達(dá)技術(shù)為了獲得miRNA功能研究中的Loss of Function表型，我們利用morpholinos寡 核苷酸的反義抑制技術(shù)。系列M0、標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照morpholino (MO-NC)和p53的MO均購自 Gene Tools 公司，每個(gè)包裝為 300nmol。除 M0-219 之外設(shè) miR_34a、miR_9*、miR_146b、 miR-181a、miR_92b、miR_125b、miR-129、miR_130a、miR-139、miR-148、miR_153a、miR-183 和miR-210作為平行對(duì)照。為了獲得miRNA功能研究中的feiin of Function表型，我 們利用miRNA前體分子的?；瘜W(xué)合成miRNA前體分子和標(biāo)準(zhǔn)前體對(duì)照(Pre-miR-NC)購自 Ambion公司(Pre-miR miRNA Precursor Molecule系列產(chǎn)品)，除Pre-miR-219之外，設(shè)置 Pre-miR-let7b 作為陽性對(duì)照，miR-130a、miR-148、miR-204、miR- 146b、miR-143、miR_124 和miR-155作為平行對(duì)照。
3.斑馬魚胚胎顯微注射顯微注射設(shè)備為尼康IM-9B操作手臂和Motic體視顯微鏡，注射針為尼康OT-I雙層毛 細(xì)管拉制。注射溶液包含0. 05%的酚紅作為指示劑，胚胎在瓊脂槽上排好角度后被注射進(jìn) 卵黃區(qū)，注射體積均為每個(gè)胚胎2nl。所有顯微注射用的胚胎均為1細(xì)胞受精卵階段。所 有的 morpholinos 被溶解在 IXDanieau 緩沖液(58 mmol/L NaCl, 0. 7 mmol/L KCl, 0.4 mmol/L MgSO4, 0.6 mmol/L Ca (NO3) 2, 5.0 mmol/L HEPES pH 7. 6).注射濃度為 4. 1 ng/ nL (500ymol/L)，同時(shí)設(shè)高濃度和低濃度組，分別為750 μ mol/L和250 μ mol/L。為了排 除morpholinos引起的非特異現(xiàn)象，同時(shí)設(shè)MO和1. 5倍的M0_p53聯(lián)合注射。前體miRNA 都溶解在DEPC-Treated水中，高中低濃度分別為5 μ mol/L、2· 5 μ mol/LU ymol/L，前 體陰性對(duì)照和陽性對(duì)照(Pre-let7b)注射濃度為5 μ mol/L。對(duì)于mir_219過表達(dá)表型的 拯救實(shí)驗(yàn)，我們采用Pre-219 (1 μ mol/L)和pCS2-ntl_cds (50ng/ μ L)聯(lián)合注射，對(duì)于in vivo 3，UTR 實(shí)驗(yàn)，我們注射 Pre-219 (2. 5 μ mol/L)、EGFP-gli2a_UTR 和 EGFP-Pdgfra-CDS 的capped mRNA (50ng/μ L)聯(lián)合注射，對(duì)于聯(lián)合注射我們采用兩種組分分別注射，首先注 射Pre-219，然后再注射質(zhì)粒或mRNA。注射后的胚胎在觀.5° C的Holtfreter溶液中培養(yǎng) 觀察，將未分裂或死亡的胚胎及時(shí)清除，MO的觀察時(shí)間點(diǎn)為ldpf、2dpf、3dpf、4dpf和5dpf ，Pre的觀察時(shí)間點(diǎn)為IOhpf U6hpf,24hpf、48hpf和72hpf。胚胎麻醉后放于洲的甲基 纖維素溶液內(nèi)，用園頭的玻璃針調(diào)整胚胎的姿勢(shì)。
4.探針制備Ntla, Shha, GlUa和Pdgfra的探針用IOhpf胚胎的反轉(zhuǎn)cDNA產(chǎn)物PCR得到產(chǎn)物，連 入PSPT18載體中。探針質(zhì)粒經(jīng)線性化后用T7酶體外轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行DIG的摻入標(biāo)記。產(chǎn)物分 裝于-80度保存。
5. mRNA體外轉(zhuǎn)錄PCS2-EGFP報(bào)告基因質(zhì)粒線性化后，利用Ambion公司的SP6 mMessage mMachine Kit6進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。參考MEGA Clear說明書純化得到的mRNA產(chǎn)物。
6.總RNA抽提及實(shí)時(shí)熒光定量PCR樣品按Trizol法抽提總RNA，測(cè)定濃度后取Iug總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參考invitrogen 的SuperScript III Reverse ^Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，得到的cDNA產(chǎn)物 稀釋兩倍用于RT-PCR的模板，每個(gè)PCR體系加2ul模板，參考Takara公司的STOR Premix Ex Taq (Perfect Real Time)的說明書進(jìn)行，對(duì)于引物的序列參見附錄，lectin用作內(nèi) 參對(duì)照。儀器為Mratagene公司的Mx3000 p，PCR條件為兩步法95度10s，95度5s， 60度20s，40個(gè)循環(huán)。將生成的Ct值導(dǎo)入定量PCR相對(duì)表達(dá)軟件REST (http://www. gene-quantification, de/download. html)來分析處理組和對(duì)照組之間的差異。
7. RNA印跡實(shí)驗(yàn)RNA樣品(25yg)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(15%)和尿素變性凝膠電泳(8 M)。待前 沿指示劑恰好跑出凝膠后，停止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(Amersham Biosciences).將樣品轉(zhuǎn)至膜 上后于80°C烘干2 h，進(jìn)而用互補(bǔ)序列的寡聚核苷酸探針進(jìn)行雜化處理。該探針為5’-末 端[Y_32P]ATP標(biāo)記的多聚核苷酸激酶。于39°C下在ULTRAhyb -寡聚雜化緩沖溶液 (Ambion)中雜化16 h。繼而在42°C下用含0. 1% SDS的SSC (2X)洗滌三次。移除寡聚核 苷酸后，于65°C下在1% SDS中重雜化30 min。miRNA探針的序列為 mir-219, 5' - AGAATTGCGTTTGGACAATCA-3‘禾Π mir-124a, 5' -TGGCATTCACCGCGTGCCTTAA-3，。
參照組則用一個(gè)互補(bǔ)序列的U6 RNA(5，-GCTAATCTTCTCTGTATCGTTCCAATT- TT-3，) 進(jìn)行雜化，最后在成像系統(tǒng)(scanner Storm 860, Sunnyvale, CA)得到印跡信號(hào)。寡居核 苷酸由Biaosune公司合成(上海，中國)。
8.斑馬魚整體胚胎原位雜交(Whole Mount ISH)斑馬魚整體胚胎復(fù)水75%、50%、25%的甲醇/PBST室溫旋轉(zhuǎn)混勻各10分鐘，PBST清洗 快洗一次，室溫旋轉(zhuǎn)混勻5分鐘，快洗一次。第二次固定4%多聚甲醛4度混勻20分鐘， PBST清洗。蛋白酶K消化24hpf以下的不消化，24hpf的用10ug/ml，48hpf的用20ug/ ml，72hpf以上的用100ug/ml。第三次固定4%多聚甲醛4度混勻1小時(shí)。PBST快速洗三 次后轉(zhuǎn)移到M孔板內(nèi)，每孔不超過10個(gè)胚胎。預(yù)雜交加入提前預(yù)熱到68度的預(yù)雜交液， 每孔1ml，68度孵育Ih以取出非特異性。雜交加入預(yù)熱的雜交液300ul，68度孵育l_4h。 加入DIG標(biāo)記的mRNA探針，終濃度為20_100pM，68度雜交過夜。對(duì)于miR-219的LNA探 針而言，雜交溫度和清洗溫度均為49度。預(yù)熱68度的hSSCT 50%甲酰胺清洗兩次，每次 30min ；2XSSCT 68度清洗15min —次；0. 2xSSCT 68度清洗30min兩次。用MABT洗，室溫輕 搖5min三次。用終止液室溫輕搖Ih終止反應(yīng)，每孔加:3ml。將DIG抗體用終止液1 :10稀 釋成工作液，使用時(shí)500倍稀釋使每孔抗體濃度為1 :5000，4度孵育過夜。在終止液中室溫 輕搖 30min，MABT 室溫輕搖 lh，在 staining buffer 中輕搖 5min 三次，在 IOOmM 的 Tris-HCL (PH 9. 5)室溫清洗5min。檢測(cè)用Roche的BM Purple顯色4度過夜。PSBT常溫洗5min兩 次終止顯色反應(yīng)。將顯色完全的胚胎放置于凹玻片上，在洲的羧甲基纖維素中調(diào)整位置， 用體視顯微鏡加環(huán)形反射光拍照。
9.冰凍切片選取顯色完成的f的胚胎在4%的多聚甲醛再固定，用玻璃針調(diào)胚胎整方位后再緩慢滴加熔化的瓊脂蔗糖溶液，凝固后用鋒利的刀片修塊，保持胚胎距邊緣3-4mm左右。將 包含胚胎的瓊脂塊放入30%的蔗糖溶液中，4度放置到胚胎完全沉底。在標(biāo)本盤上涂抹一 層OCT包埋劑，將瓊脂塊頭部的方向粘在標(biāo)本盤上，用鑷子固定瓊脂塊的方向，再滴加適量 OCT包埋劑。放置于冰凍切片機(jī)的速凍架上迅速冷凍lOmin。切片溫度_20度，切片厚度 25um。水溶性封片劑封片后放大200倍觀察。
10. pH3免疫組化胚胎去卵殼后4%多聚甲醛固定過夜，用甲醇/PBST梯度脫水(50%，70%, 95%，100%)各 5min。加入丙酮，-20度固定lOmin。PBST室溫洗三次，每次5min。用新鮮配制的0.1%檸 檬酸鈉+0. 1%的TritonX-IOO處理15min，PBST室溫洗兩次，每次lOmin，在封閉液中輕搖 lh，加入pH3抗體(用封閉液按1 :500稀釋)，4度輕搖過夜。PBST室溫洗4次，每次30min。 加入二抗(1 :500)室溫輕搖4小時(shí)，PBST室溫洗4次，每次30min。用DAB顯色試劑盒室溫 避光顯色lOmin，PBST終止顯色。
11. Whole mount TUNEL 檢測(cè)對(duì)于Pre-219和前體陰性對(duì)照，選擇高濃度5 μ mol/L注射的胚胎進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于 M0-219、M0-219加p53聯(lián)合注射和MO陰性對(duì)照，我們選擇500 μ mol/L注射的胚胎進(jìn)行檢 測(cè)，所有胚胎的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均為ldpf。Roche試劑盒中的的TUNEL反應(yīng)緩沖液(含F(xiàn)ITC標(biāo) 記的dUTP)和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在在冰上混合后加入EP管內(nèi)，按照每個(gè)胚胎IOul 的量添加。放于濕盒內(nèi)4度孵育過夜，取出后放37度孵育30min。PBS清洗終止反應(yīng)，熒光 顯微鏡采集照片處理圖象。
12.斑馬魚3，UTR EGFP報(bào)告基因法斑馬魚GlUa基因3，UTR和PDGFRA基因CDS用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 Gli2-3UTR -F: 5’ - CCGGCTCGAGACCAAGTGCCTCAAGTAA -3’ ， Gli2-3UTR -R: 5’ - CGGCTCGAGGAAGTCCTTTTAGTATGCG -3，， PDGFRA- CDS -F: 5’ - GGCCTCGAGAACTATGTCTCCAAAGGAA -3， PDGFRA- CDS -R: 5’ - GCGCTCGAGCTGTAGTCTTCGTTAGA -3’。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BioI單酶切后連入pCS2-EGFP (中科院健康所劉廷析惠贈(zèng))，用 NotI線性化后片段純化溶于DEPC水中。然后用sp6 mMessage mMachine kit (Ambion) 在37度反應(yīng)2小時(shí)，產(chǎn)物用MEGA Clear回收，將mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與Pre_219聯(lián)合注射，觀察 24hpf的熒光表達(dá)，并收集拍照后的胚胎，進(jìn)行GFP檢測(cè)。miR-219突變體甲氧基寡核苷酸 由上海吉瑪公司化學(xué)合成。
13.細(xì)胞培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SW1783、U138、U251、U87、U373和人源神經(jīng)母細(xì)胞株SK-N-SH購自 ATCC (Manassas，VA)，人源胎兒腎細(xì)胞株 293A 購自 Invitrogen (Carlskid, CA) SW1783、 U138、U87、U373和SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)在MEM培養(yǎng)基(Gibco, CA)中，U251細(xì)胞培養(yǎng)在 RPIM 1640 培養(yǎng)基(Gibco)中，上述培養(yǎng)基都含有 10% 的 FBS (PAA Laboratories, Linz, Austria)、青霉素(100單位/mL)和鏈霉素(100 ng/mL)。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS,2 mM L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)和青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。所 有細(xì)胞置37°C培養(yǎng)箱、5%C02，每天傳代一次。
14.細(xì)胞轉(zhuǎn)染8甲氧基寡核苷酸由上海吉瑪公司化學(xué)合成，microRNA前體購自美國Ambion公司 (Ambion Pre-mir miRNA precursor CaU No. 17100)，轉(zhuǎn)染另設(shè)正常對(duì)照組，miRNA前體組和 miRNA前體通用陰性對(duì)照組。細(xì)胞于鋪板18-24h后至70%_80%融合開始轉(zhuǎn)染，所用試劑為 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)。轉(zhuǎn)染按本室常規(guī)方法并參照說明書進(jìn)行。細(xì)胞于鋪 板18-24h后約有70%-80%融合開始轉(zhuǎn)染，所用試劑為Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 具體轉(zhuǎn)染方法參照說明書進(jìn)行，寡核苷酸及siRNA的工作濃度均為lOOnmol/L。
15.體外侵潤實(shí)驗(yàn)用miRNA-219轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞，24h后將細(xì)胞接種于鋪有膠原膜的小室上層，下層加入 含10%血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)M h。未吸附的細(xì)胞用棉簽小心移除。侵入膠原膜 下表面的細(xì)胞用細(xì)胞染色劑染色，繼而計(jì)數(shù)，最終用微孔板讀取器于560 nm處定量測(cè)定。
16.流式細(xì)胞分析U87細(xì)胞和U251細(xì)胞以50%密度接種于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)對(duì)h，轉(zhuǎn)染miRNA_29a前體 (100 nM) 3 后收集所得細(xì)胞并用70%的乙醇于4°C下固定。所得細(xì)胞用Armexin V標(biāo)定 再進(jìn)fi"、流式細(xì)胞分析(BD FACSaria cell sorter, BD Bioscences, San Jose, CA, USA)。
17.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)將分別轉(zhuǎn)染miR-219 (100 nM) U87和U251細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h。收集細(xì) 胞，抽取蛋白液進(jìn)行PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。多克隆抗體Gli2 (CST, USA)和PDGFRA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)按照使用說明書稀釋并于4° C下孵育過夜。隨 后與AP-標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗室溫孵育2 h。最后采用BCIP/NBT (Ameresco)顯色并 用 Labworks Instrument software (UVP LLC, Upland, CA)進(jìn)行定量分析。β-肌動(dòng)蛋白 表達(dá)水平作為內(nèi)參照。
18.細(xì)胞熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)人源Gli2基因CDS和PDGFRA基因3，UTR用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 Gli2-CDS-F: 5’ - GGTACCGAGGATGCCAGTTAGGC -3’ ， Gli2-CDS-R: 5’ - TCTAGACGGGAGGAGTTCTGGGAG -3，， PDGFRA-3UTR-F: 5' - GAATTCGCTACTTCCCACTGTATG -3， PDGFRA-3UTR-R: 5' - CTCGAGTTTGTATTGGTAGACCCTA -3’。
PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到 pmd_19t 載體(TaKaRa)，繼而克隆到 pGL3_Control vector (Promega)熒光素下游。核苷酸替換突變基于PCR的方法(KOD-Plus-Mutagenesis Kit, T0Y0B0) ο 引物為Mut of Gli2 CDS: 5’ - GGTCATCCCGGGCTACAGTCCGCAAGGC -3，禾口 5’ - CCAAAGGCAGGCTTCTGCTGCACCACCG -3’ ；Mut of PDGFRA 3’ UTR: 5’ - CTGTTAGTAAGCCGGCCTGAGAAACA -3，禾口 5’ - ATCATAAAAATAGAAAGTAGGAAAG -3’。
上述質(zhì)粒載體采用Lipofectamine 2000 Qnvitrogen)分別與miRj9a前體共轉(zhuǎn) 染U87細(xì)胞，48小時(shí)后按Promega提供的方法處理細(xì)胞，在多功能酶標(biāo)儀(BioTek)讀取熒 光值。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次。
19.腦膠質(zhì)瘤臨床樣品采集正常腦組織樣品及腦膠質(zhì)瘤組織樣品從復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院取得。手術(shù)取出后，組織塊以PBS或生理鹽水清洗干凈，迅速將組織切成小塊，部分樣品放入2ml凍存管中于液氮 中保存?zhèn)溆?。其他用多聚甲醛固定后用于組織切片分析。用于分子分析的樣本在液氮中研 磨為粉末后分別提取RNA或蛋白質(zhì)。
20.斑馬魚miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)ZFIN的的基因表達(dá)和突變表型數(shù)據(jù)庫http://WWW. zfin. org/。不同物種的miR-219 前體序列比對(duì)用hvitrogen的Vector NTI Advance 10. 0。斑馬魚miR-219的靴基因預(yù)測(cè) 采用斑馬魚miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件ZfinTar。
權(quán)利要求
1.miRNA-219化合物作為腦膠質(zhì)瘤臨床診斷標(biāo)志物的應(yīng)用。
2.miRNA-219化合物作為制備治療腦腫瘤藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種人腦膠質(zhì)瘤新的標(biāo)志物miR-219的用途。首次證實(shí)了miR-219在人腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)均顯著下調(diào)，并證實(shí)miR-219在胚胎早期神經(jīng)管發(fā)育和腦膠質(zhì)瘤發(fā)生中能直接調(diào)控Hh-Gli2和Pdgfra信號(hào)通路，且能顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和浸潤。進(jìn)一步對(duì)不同級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本進(jìn)行定量分析表明miR-219能作為腦膠質(zhì)瘤檢測(cè)的標(biāo)志物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102041316SQ20101056551
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者呂艷, 張小龍, 李丹, 董道遠(yuǎn), 賴立輝, 鄒超 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)