本發(fā)明涉及一種殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶及其制備方法，屬于生物催化工程領(lǐng)域。
技術(shù)背景
氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,HPL)是植物脂質(zhì)氧化途徑中脂肪氧合酶(LOX)下游的酶，可將LOX作用下多不飽和脂肪酸形成的脂肪酸氫過氧化物裂解形成含氧酸和揮發(fā)性醛類。根據(jù)底物過氧基位置的差異，HPL可分為兩類：第一類可裂解13位氫過氧化產(chǎn)物生成C6醛和C12含氧酸，稱為13-HPL；第二類可裂解9位氫過氧化物生成C9醛類和C9含氧酸，稱為9-HPL。由13-LOX和13-HPL共同催化得到的C6醛類(包括己醛，己烯醛)具有清新芳香風味，在國外被稱為“Green note”。這些揮發(fā)性醛類被廣泛應用于香精/香水制造和食品工業(yè)，例如用于長期存儲或殺菌后果蔬新鮮氣味的重塑。
HPL的不穩(wěn)定性是制約這一生物合成途徑實現(xiàn)工業(yè)化的重要障礙。大多 數(shù)植物來源的HPL通常會在反應開始的20分鐘之內(nèi)完全喪失活力。HPL的不穩(wěn)定性主要體現(xiàn)在以下三個方面：(1)作為反應底物的氫過氧化物性質(zhì)非?；顫?，具有攻擊性，易造成HPL蛋白的氧化而使酶失活；(2)Gargouri等人推測的反應機理表明HPL反應過程中產(chǎn)生的自由基會攻擊HPL酶，使其喪失活性；(3)反應產(chǎn)物(包括己醛和己烯醛)也都會對HPL活力產(chǎn)生較強的抑制作用。
一般而言，固定化被認為是提高酶活力和穩(wěn)定性最為便捷的方法。許多酶在經(jīng)過固定化之后穩(wěn)定性得到了顯著的提高。例如，來源于熒光假單胞菌的脂肪酶在羊毛纖維上的固定化顯著提高了脂肪酶的操作穩(wěn)定性。除此之外，固定化也可以比較方便地實現(xiàn)酶的重復使用而大大降低酶用量，同時也使得反應器的設計更為容易。因此，無論是在實驗室水平還是工業(yè)化生產(chǎn)中，固定化酶都是很有優(yōu)勢的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個目的是合成一種間隔臂偶聯(lián)的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，得到的固定化HPL具有較高的酶活力以及較好的操作穩(wěn)定性。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，它的化學名稱為：1，6-己二胺殼聚糖-γ-卡拉膠復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶。它的初始酶活力為6-8U/g，其在重復使用7次之后仍保留70-90％的相對酶活力。
這種殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶采用下列方法制備得到：
(1)將殼聚糖復合水凝膠微球浸入EDC水溶液中，然后加入含有HPL的PBS溶液，之后于4～10℃下震蕩10～30min，過濾，得到殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶。
(2)用PBS及去離子水清洗殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶兩次。
(3)清洗過后的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。
步驟(1)所述殼聚糖復合水凝膠微球與EDC的摩爾比為1:1～10；所述HPL與殼聚糖復合水凝膠微球的摩爾比為1:1。
步驟(1)所述殼聚糖復合水凝膠微球的制備包括如下步驟：
a.將殼聚糖和γ-卡拉膠加入到的乙酸溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。
b.使用注射器將步驟a所得混合溶液逐滴滴入NaOH溶液中并攪拌形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。
c.在步驟b所得水凝膠微球中加入過量戊二醛，得到醛基活化水凝膠微球。
d.在步驟c所得醛基活化水凝膠微球中加入1，6-己二胺。
e.過濾得到表面連接著1，6-己二胺的殼聚糖復合水凝膠微球。
步驟a所述混合溶液中含有殼聚糖2.5wt％～7.5wt％；γ-卡拉膠2.5wt％～7.5wt％；乙酸溶液5％～25％v/v。
步驟b所述NaOH溶液的濃度為0.5M～2.5M，混合溶液與NaOH溶液的體積比1:5～10；所述攪拌過程：攪拌轉(zhuǎn)速為10～50rpm，攪拌時間為1～5天。
步驟d所述1，6-己二胺的添加量為1，6-己二胺：殼聚糖中-NH2摩爾比＝0.5～1.0:1。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶的制備方法，包含如下步驟：
(A)將殼聚糖復合水凝膠微球浸入EDC水溶液中，殼聚糖復合水凝膠微球與EDC的摩爾比為1:1～10，然后加入含有HPL的PBS溶液，HPL與殼聚糖復合水凝膠微球的摩爾比為1:1，之后于4～10℃下震蕩10～30min，過濾，得到聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶。
(B)用PBS及去離子水清洗聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶兩次。
(C)清洗過后的聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。
步驟(A)所述復合液中殼聚糖復合水凝膠微球與EDC的摩爾比為1:1～10；步驟(A)所述反應液中HPL與殼聚糖復合水凝膠微球的摩爾比為1:1。
步驟(A)所述殼聚糖復合水凝膠的制備方法為：
(a).將2.5wt.％～7.5wt.％的殼聚糖和2.5wt.％～7.5wt.％的γ-卡拉膠加入到含有5％～25％v/v乙酸的溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。
(b).使用注射器將步驟a所得混合溶液逐滴滴入濃度為0.5M～2.5M的NaOH溶液中，混合液和NaOH溶液的體積比1:5～10，然后攪拌形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。
(c).在步驟b所得水凝膠微球中加入過量戊二醛，得到醛基活化水凝膠微球。
(d).在步驟c所得醛基活化水凝膠微球中加入1，6-己二胺，1，6-己二胺的添加量為1，6-己二胺：殼聚糖中-NH2摩爾比＝0.5～1.0:1。
(e).過濾得到表面連接著1，6-己二胺的殼聚糖復合水凝膠微球。
本發(fā)明的殼聚糖復合水凝膠微球可以應用到其他多種植物來源氫過氧化物裂解酶的固定化中。
本發(fā)明的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶可以應用于芳香性風味成分C6醛的制備。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：
本發(fā)明制備的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶具有相比于其他固定化氫過氧化物裂解酶更高的酶活力及操作穩(wěn)定性。
附圖說明
圖1是循環(huán)次數(shù)對酶相對活力圖，用于表征本發(fā)明所述殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶的操作穩(wěn)定性。
具體實施例
下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明。應該理解的是，本發(fā)明的實施例僅僅是用于本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的改進或簡化都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
固定化HPL的酶活檢測方法為頂空氣相色譜法(HS-GC)。具體的檢測步驟如下：與分光光度檢測法相同的反應溶液經(jīng)2min的保溫之后迅速將酶 滅活。反應產(chǎn)物使用氣相色譜儀進行測定，即待測樣品迅速轉(zhuǎn)移至氣相頂空進樣器，70℃下保溫平衡30min并自動進樣?？瞻诪橹缓坞x粗酶液或固定化酶的PBS。反應生成的產(chǎn)物的濃度通過以下公式確定：
Cs＝As/A0×C0
其中，As為反應樣品峰面積；A0為標準樣品峰面積；Cs為反應樣品濃度；C0為標準樣品濃度。
1U酶活的定義為每分鐘生成1μmoL的2(E)-己烯醛所需的加酶量。
本發(fā)明所用HPL均采用如下所述方法制得：去掉根和莖之后，將新鮮莧菜葉切碎并與pH 8.5的Tris-HCl緩沖液(0.1M并含有0.5％(m/v)PVP K-30)按照1:3的比例混合，均漿1min(10s×6次)。四層紗布過濾之后所得濾液在4℃下18000×g離心30min。離心沉淀加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.02M，pH 6.8)，PBS中含10mM DTT以及0.5％(v/v)Triton X-100。4℃下攪拌1h之后于同樣溫度下18000×g離心30min，所得上清液經(jīng)30％硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述含有DTT以及Triton X-100的PBS中，即得游離HPL粗酶液。
實施例1
制備殼聚糖復合水凝膠：將2.5g殼聚糖和2.5gγ-卡拉膠加入到100g含有5％v/v的乙酸溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。隨后使用注射 器逐滴滴加50ml混合溶液至500ml濃度為0.5M的NaOH溶液中并緩慢攪拌(50rpm)1天，以形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。使用過量的戊二醛活化水凝膠微球表面的氨基以引入醛基，隨后加入7.75mmol的1，6-己二胺，反應后1，6-己二胺(HMDA)通過活性醛基被連接在殼聚糖復合水凝膠微球的表面。
氫過氧化物裂解酶的固定化：將15.5mmol表面連接著1，6-己二胺(HMDA)的殼聚糖復合水凝膠微球浸入300ml含有155mmol EDC的水溶液中，然后加入100ml含有15.5mmol的HPL的PBS溶液，于4℃下震蕩30min，過濾，得到殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶；之后用PBS及去離子水清洗殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶兩次；最后清洗過后的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。
由表1可知，殼聚糖-γ-卡拉膠相比其他凝膠具有較好的固定化酶活力、載體蛋白載量及酶活收率，而碳二亞胺固定化的HPL其固定化酶活力及酶活收率均高于戊二醛固定化HPL。
表1不同聚電解質(zhì)形成的復合水凝膠微球以及不同的結(jié)合方式對固定化HPL的影響
由圖1可知，所制得的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶在重復使用7次之后仍保留70-90％的相對酶活力，具有良好的操作穩(wěn)定性。
實施例2
制備殼聚糖復合水凝膠：將7.5g殼聚糖和7.5gγ-卡拉膠加入到100g含有25％v/v的乙酸溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。隨后使用注射器逐滴滴加50ml混合溶液至250ml濃度為2.5M的NaOH溶液中并緩慢攪拌(10rpm)5天，以形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。使用過量的戊二醛活化水凝膠微球表面的氨基以引入醛基，隨后加入46.56mmol的1，6-己二胺，反應后1，6-己二胺(HMDA)通過活性醛基被連接在殼聚糖復合水凝膠微球的表面。
氫過氧化物裂解酶的固定化：氫過氧化物裂解酶的固定化：將46.56mmol表面連接著1，6-己二胺(HMDA)的殼聚糖復合水凝膠微球浸入300ml含有46.56mmol EDC的水溶液中，然后加入100ml含有46.56mmol HPL的 PBS溶液，于10℃下震蕩10min，過濾，得到殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶；之后用PBS及去離子水清洗殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶兩次；最后清洗過后的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。
所得殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶性能與實施例1相似。
實施例3
制備殼聚糖復合水凝膠：將3.0g殼聚糖和4.0gγ-卡拉膠加入到100g含有10％v/v的乙酸溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。隨后使用注射器逐滴滴加50ml混合溶液至400ml濃度為1.0M的NaOH溶液中并緩慢攪拌(45rpm)1.5天，以形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。使用過量的戊二醛活化水凝膠微球表面的氨基以引入醛基，隨后加入18.63mmol的1，6-己二胺，反應后1，6-己二胺(HMDA)通過活性醛基被連接在殼聚糖復合水凝膠微球的表面。
氫過氧化物裂解酶的固定化：氫過氧化物裂解酶的固定化：氫過氧化物裂解酶的固定化：將18.63mmol表面連接著1，6-己二胺(HMDA)的殼聚糖復合水凝膠微球浸入300ml含有93.15mmol EDC的水溶液中，然后加入100ml含有18.63mmol HPL的PBS溶液，于5℃下震蕩25min，過濾，得 到殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶；之后用PBS及去離子水清洗殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶兩次；最后清洗過后的殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。
所得殼聚糖復合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶性能與實施例1相似。