固定化水解酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化水解酶及其制備方法和應(yīng)用。該固定化水解酶是將水解酶通過戊二醛吸附交聯(lián)于磁性殼聚糖復(fù)合微球上制備得到，磁性殼聚糖復(fù)合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戊二醛交聯(lián)而成。制備方法包括（1）將Fe3O4納米顆粒加入到殼聚糖溶液中，然后加入戊二醛溶液，得到磁性殼聚糖復(fù)合微球；（2）將磁性殼聚糖復(fù)合微球加入到戊二醛溶液中反應(yīng)，所得載體產(chǎn)物加入水解酶溶液中，制得固定化水解酶。本發(fā)明的固定化水解酶對熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑等穩(wěn)定性較強(qiáng)，不易失活，可回收再利用。該固定化水解酶可應(yīng)用于強(qiáng)化污泥水解過程，解決酶強(qiáng)化污泥水解過程中酶完全損失及酶的回收利用等問題。
【專利說明】固定化水解酶及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于污泥水解領(lǐng)域，具體涉及一種固定化水解酶及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]活性污泥法是目前世界上應(yīng)用最為廣泛的污水生物處理技術(shù)之一，此技術(shù)最大的弊端就是產(chǎn)生大量的剩余污泥。目前，我國污泥產(chǎn)生量約為2500萬噸/年(按含水率85%計(jì)算)，若不及時(shí)進(jìn)行妥善的處理與處置，將會(huì)對環(huán)境造成直接或潛在的污染。污泥厭氧消化是目前國內(nèi)外常用的污泥處理技術(shù)，水解是此過程的限速步驟，而剩余污泥可降解性差是制約厭氧消化的瓶頸問題，因此研發(fā)提高污泥水解速率的技術(shù)具有重要意義。
[0003]目前，促進(jìn)污泥水解的方法有機(jī)械法、超聲波法、熱堿法和生物法等。酶處理技術(shù)是近年來環(huán)境領(lǐng)域迅速發(fā)展起來的一種處理污泥的新技術(shù)，它可以縮短消化時(shí)間，改善污泥消化性能，而且經(jīng)濟(jì)高效，易控制，其產(chǎn)物對環(huán)境也無污染副作用。
[0004]酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其具有高催化活性、高選擇性、反應(yīng)條件溫和、環(huán)保無污染等特點(diǎn)。游離狀態(tài)的酶對熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑等穩(wěn)定性較差，易失活，純化困難，不能重復(fù)使用。為了克服這些問題，可以用載體將酶束縛或限制在一定的區(qū)域內(nèi)，使酶分子在此區(qū)域進(jìn)行特有和活躍的催化作用，酶分子不易失活，并可將其回收及重復(fù)使用，從而降低酶強(qiáng)化污泥處理技術(shù)的成本。
[0005]目前，固定酶的方法有吸附法、交聯(lián)法、包埋法和共價(jià)偶聯(lián)法等，固定化載體有殼聚糖、海藻酸、膠原和纖維素等。但是，由于污泥中含有大量的有機(jī)顆粒物，在污泥水解過程中運(yùn)用常規(guī)有機(jī)載體固定的水解酶存在固定化水解酶與污泥分離困難、回收再利用復(fù)雜、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，因此，需要尋求新方法來解決這些技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑等穩(wěn)定性較強(qiáng)，不易失活，可回收再利用的固定化水解酶及其制備方法和應(yīng)用。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種固定化水解酶，所述固定化水解酶是將水解酶通過戊二醛吸附交聯(lián)于磁性殼聚糖復(fù)合微球上制備得到，所述磁性殼聚糖復(fù)合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戍二醒交聯(lián)而成。
[0008]上述的固定化水解酶中,優(yōu)選的,所述水解酶包括蛋白酶或淀粉酶。
[0009]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種固定化水解酶的制備方法，包括以下步驟:
(O將殼聚糖溶解于醋酸溶液中，配制成殼聚糖溶液，然后將Fe3O4納米顆粒加入到殼聚糖溶液中，再加入戊二醛溶液，其中Fe3O4納米顆粒、殼聚糖、戊二醛的質(zhì)量比為1:1: 0.7~1.5，室溫下超聲振蕩使反應(yīng)完全后，磁力分離并去除上清液，將所得沉淀洗滌至中性，再經(jīng)真空冷凍干燥后，得到磁性殼聚糖復(fù)合微球；(2)將磁性殼聚糖復(fù)合微球加入到戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，磁性殼聚糖復(fù)合微球與戊二醛的質(zhì)量比為0.5~1: 1，室溫下水浴振蕩使反應(yīng)完全后，將所得載體產(chǎn)物洗滌至中性，然后加入到水解酶溶液中，水解酶與載體產(chǎn)物的質(zhì)量比為0.8~3: 1，室溫下利用水浴振蕩固定，再經(jīng)磷酸緩沖溶液清洗和真空冷凍干燥，得到固定化水解酶。
[0010]上述的制備方法中，優(yōu)選的，所述Fe3O4納米顆粒是通過化學(xué)共沉淀法制備得到:用N2作保護(hù)氣，在室溫非磁性攪拌條件下，向鐵鹽溶液中逐滴加入氨水，直至pH值為9.5~10.5，將產(chǎn)物在78°C~82°C熟化30min~40min，得到Fe3O4懸浮液，在攪拌作用下將Fe3O4懸浮液降至室溫，磁力分離后，去除上清液，所得沉淀用水洗滌至PH值為6.8~7.2，真空冷凍干燥24h~48h后,得到Fe3O4納米顆粒。
[0011 ] 上述的制備方法中，優(yōu)選的，所述鐵鹽溶液是Fe3+和Fe2+的混合溶液，所述鐵鹽溶液中Fe3+和Fe2+的摩爾比為1.6~2: I。
[0012]上述的制備方法中，優(yōu)選的，所述殼聚糖溶液中殼聚糖的濃度為3mg/mL~5mg/mL，所述醋酸溶液中醋酸的質(zhì)量濃度為1%~1.5% ;所述戊二醛溶液中戊二醛的質(zhì)量濃度為
1% ~2%。[0013]上述的制備方法中，優(yōu)選的，所述水解酶溶液包括蛋白酶溶液或淀粉酶溶液。
[0014]上述的制備方法中，優(yōu)選的，所述蛋白酶溶液是由以下方法制備得到:將工業(yè)級(jí)蛋白酶加入到磷酸緩沖溶液中，于48°C~52°C下充分?jǐn)嚢枞芙?，然后進(jìn)行離心處理，取上清液，得到蛋白酶溶液；
所述淀粉酶溶液是由以下方法制備得到:將工業(yè)級(jí)淀粉酶加入到磷酸緩沖溶液中，然后加入氯化鈉溶液作為淀粉酶的激活劑，所得混合液于48°C~52°C下充分?jǐn)嚢枞芙猓龠M(jìn)行離心處理，取上清液，得到淀粉酶溶液。
[0015]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的固定化水解酶或者上述的制備方法制得的固定化水解酶在污泥水解中的應(yīng)用。
[0016]上述的應(yīng)用包括以下步驟:將固定化水解酶加入污泥中進(jìn)行厭氧水解，水解溫度為48°C~52°C,水解時(shí)間為4h~5h,振蕩速度為IOOrmp~120rmp。
[0017]本發(fā)明中，磷酸緩沖溶液的pH值均可優(yōu)選為6.8~7.2，濃度均可優(yōu)選為0.08mol/L ~0.12mol/L。
[0018]本發(fā)明的固定化水解酶的制備方法中，步驟(1)和步驟(2)中的真空冷凍干燥的時(shí)間可優(yōu)選為24h~48h ;步驟(1)中的超聲振蕩時(shí)間可優(yōu)選為30min~40min ;步驟(2)中，兩次水浴振蕩的時(shí)間均可優(yōu)選為2h~4h ;步驟(1)中的沉淀和步驟(2)中的載體產(chǎn)物通常先用乙醇洗滌3次~4次，再用超純水洗滌至中性。
[0019]本發(fā)明中，在制備淀粉酶溶液時(shí)，氯化鈉在磷酸緩沖溶液中的最終質(zhì)量濃度可優(yōu)選為0.03%~0.1%，氯化鈉溶液的質(zhì)量濃度可優(yōu)選為0.3%~1%。
[0020]本發(fā)明的應(yīng)用中，一般地，污泥的總懸浮固體濃度(TSS)為8800mg/L~12000mg/L，揮發(fā)性固體濃度(VSS)為6050mg/L~8000mg/L，溶解性蛋白質(zhì)的濃度為73.0mg/L~100.0mg/L，溶解性碳水化合物的濃度為14.0mg/L~20.0mg/L，但并不局限于此。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明的固定化水解酶中的固定化載體是由殼聚糖包裹Fe3O4納米顆粒構(gòu)成的，從而賦予了其與水解酶吸附的基團(tuán)，通過戊二醛交聯(lián)劑的交聯(lián)作用來提高固定化水解酶的穩(wěn)定性。此外，F(xiàn)e3O4納米顆粒在強(qiáng)化水解酶的催化性能的同時(shí)，賦予了固定化水解酶磁學(xué)特性，在外界磁場存在的條件下，固定化水解酶的分離回收和再利用簡單方便。
[0022]本發(fā)明的固定化水解酶對熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑等穩(wěn)定性較強(qiáng)，不易失活，回收再利用簡單方便，可以極大地降低酶強(qiáng)化污泥水解過程的成本，具有良好的應(yīng)用前景。
[0023]本發(fā)明的制備方法通過結(jié)合Fe3O4納米顆粒、殼聚糖和水解酶各自的特點(diǎn)，先將Fe3O4納米顆粒與殼聚糖交聯(lián)成磁性殼聚糖復(fù)合微球，再將水解酶固定于微球載體上。Fe3O4納米顆粒尺寸小、比表面積大、表面可修飾，具有良好的吸附性能，對污泥中架橋的金屬離子具有吸附作用，可破壞污泥的絮體結(jié)構(gòu)，有利于有機(jī)物的溶出，同時(shí)水解酶能夠促進(jìn)有機(jī)物的進(jìn)一步降解，從而強(qiáng)化了污泥水解效率。
[0024]本發(fā)明的固定化水解酶能有效促進(jìn)污泥絮體中有機(jī)物的水解，可以解決酶強(qiáng)化污泥水解過程中酶完全損失及酶的回收利用這一關(guān)鍵性問題。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合具體優(yōu)選的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]以下實(shí)施例中采用的蛋白酶和淀粉酶均購于Solarbio生物有限公司，酶活分別為6000U/g和3700U/g，最適酶活溫度分別為40°C~50°C和50°C~70°C。
[0027]實(shí)施例1:
一種本發(fā)明的固定化水解酶，具體為固定化蛋白酶，該固定化蛋白酶是將蛋白酶通過戊二醛吸附交聯(lián)于磁性殼聚糖復(fù)合微球上制備得到，磁性殼聚糖復(fù)合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戊二醛交聯(lián)而成。
[0028]一種上述本實(shí)施例的固定化蛋白酶的制備方法，包括以下步驟:
1.制備Fe3O4納米顆粒
(I)稱取5.56g FeSO4.7H20和6.488g FeCl3，將其溶解于200mL的超純水中配制成鐵鹽溶液，其中Fe3+和Fe2+的摩爾比為2: I。
[0029](2)用N2作保護(hù)氣，在室溫非磁性快速攪拌條件下，向鐵鹽溶液中逐滴加入氨水，直至PH值為10，將產(chǎn)物在80°C熟化30min，得到Fe3O4懸浮液。
[0030](3)將Fe3O4懸浮液在攪拌作用下降至室溫，通過磁力分離，倒去上清液，所得沉淀用超純水洗滌多次直至PH值為7，再真空冷凍干燥24h，得到Fe3O4納米顆粒。
[0031]2.制備磁性殼聚糖復(fù)合微球
(I)將2.0g殼聚糖溶解于500mL lwt%的醋酸溶液中，配制成4mg/mL的殼聚糖溶液。
[0032](2)將400mg Fe3O4納米顆粒加入到IOOmL殼聚糖溶液中，然后加入30mL lwt%的戊二醛溶液(即含約0.28g戊二醛)，在室溫下超聲30min。
[0033](3)通過磁力分離后，倒去上清液，所得沉淀先用乙醇洗滌3次，再用超純水洗滌至中性，真空冷凍干燥24h，得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。
[0034]3.制備固定化蛋白酶
(1)0.5g工業(yè)級(jí)蛋白酶(含雜質(zhì)50wt%)溶解于IOmL pH為7.2、濃度為0.lmol/L的磷酸緩沖溶液中，然后加溫至50°C攪拌溶解5min，再將其于5000rmp轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心處理，離心后取上清液，得到蛋白酶溶液。
[0035](2)將0.05g磁性殼聚糖復(fù)合微球加入到IOmL lwt%的戊二醛溶液(即含約0.09g戊二醛)中，25 °C水浴振蕩4h。
[0036](3)通過磁力分離后，所得載體產(chǎn)物先用乙醇洗滌3次，再用超純水洗滌至中性，然后再將其加入到5mL的蛋白酶溶液中，25°C水浴振蕩固定，轉(zhuǎn)速為lOOrmp，固定時(shí)間為2h，最后用磷酸緩沖溶液清洗，真空冷凍干燥24h，得到固定化蛋白酶。
[0037]一種上述本實(shí)施例制備的固定化蛋白酶在污泥水解中的應(yīng)用，包括以下步驟:
分別稱取0.05g已制備好的固定化蛋白酶，投入到IOOmL總懸浮固體濃度(TSS)和揮發(fā)性固體濃度(VSS)分別為8800mg/L和6050mg/L，溶解性蛋白質(zhì)和溶解性碳水化合物濃度分別為73.0mg/L和14.0 mg/L的剩余污泥中，于50°C、IOOrmp水浴振蕩器上進(jìn)行4h的厭氧水解。反應(yīng)結(jié)束后，取樣進(jìn)行分析，溶解性蛋白質(zhì)濃度從73.0mg/L增加到782.0mg/L,溶解性碳水化合物濃度從14.0mg/L增加到192.0mg/L，而空白未加固定化水解酶組的溶解性蛋白質(zhì)濃度73.0mg/L增加到402.0mg/L，溶解性碳水化合物濃度從14.0mg/L增加到120.5mg/L。由此可知，固定化水解酶可以強(qiáng)化污泥的水解過程。待水解反應(yīng)結(jié)束后，通過磁力分離可回收固定化水解酶，從而使其重復(fù)使用。
[0038]實(shí)施例2:
一種本發(fā)明的固定化水解酶，具體為固定化淀粉酶，該固定化淀粉酶是將淀粉酶通過戊二醛吸附 交聯(lián)于磁性殼聚糖復(fù)合微球上制備得到，磁性殼聚糖復(fù)合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戊二醛交聯(lián)而成。
[0039]一種上述本實(shí)施例的固定化淀粉酶的制備方法，包括以下步驟:
1.制備Fe3O4納米顆粒
同實(shí)施例1的步驟I。
[0040]2.制備磁性殼聚糖復(fù)合微球 同實(shí)施例1的步驟2。
[0041]3.制備固定化淀粉酶
(1)0.5g工業(yè)級(jí)淀粉酶(含雜質(zhì)45wt%)溶解于9mL pH為6.8、濃度為0.lmol/L的磷酸緩沖溶液中，然后加入ImL質(zhì)量濃度為0.3%的氯化鈉溶液作為淀粉酶的激活劑，將所得混合液加溫至50°C攪拌溶解5min，再將其于5000rmp轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心處理，離心后取上清液，得到淀粉酶溶液。
[0042](2)將0.05g磁性殼聚糖復(fù)合微球加入到IOmL lwt%的戊二醛溶液(即含約0.09g戊二醛)中，25 °C水浴振蕩4h。
[0043](3)通過磁力分離后，所得載體產(chǎn)物先用乙醇洗滌3次，再用超純水洗滌至中性，然后再將其加入到5mL的淀粉酶溶液中，25°C水浴振蕩，轉(zhuǎn)速為lOOrmp，固定時(shí)間為2h，最后用磷酸緩沖溶液清洗，真空冷凍干燥24h，得到固定化淀粉酶。
[0044]—種上述本實(shí)施例制備的固定化淀粉酶在污泥水解中的應(yīng)用，包括以下步驟:
分別稱取0.05g已制備好的固定化淀粉酶，投入到IOOmL總懸浮固體濃度(TSS)和揮發(fā)性固體濃度(VSS)分別為8800mg/L和6050mg/L，溶解性蛋白質(zhì)和溶解性碳水化合物濃度分別為73.0mg/L和14.0 mg/L的剩余污泥中，于50°C、IOOrmp水浴振蕩器上進(jìn)行4h的厭氧水解。反應(yīng)結(jié)束后，取樣進(jìn)行分析，溶解性蛋白質(zhì)濃度從73.0mg/L增加到710.0mg/L,溶解性碳水化合物濃度從14.0mg/L增加到185.0mg/L，而空白未加固定化水解酶組的溶解性蛋白質(zhì)濃度從73.0mg/L增加到402.0mg/L,溶解性碳水化合物濃度從14.0mg/L增加到120.5mg/L。
[0045]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例。凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)該指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下的改進(jìn)和潤飾，也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種固定化水解酶，其特征在于，所述固定化水解酶是將水解酶通過戊二醛吸附交聯(lián)于磁性殼聚糖復(fù)合微球上制備得到，所述磁性殼聚糖復(fù)合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戊二醛交聯(lián)而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化水解酶，其特征在于，所述水解酶包括蛋白酶或淀粉酶。
3.一種固定化水解酶的制備方法，包括以下步驟: (O將殼聚糖溶解于醋酸溶液中，配制成殼聚糖溶液，然后將Fe3O4納米顆粒加入到殼聚糖溶液中，再加入戊二醛溶液，其中Fe3O4納米顆粒、殼聚糖、戊二醛的質(zhì)量比為1:1: 0.7~1.5，室溫下超聲振蕩使反應(yīng)完全后，磁力分離并去除上清液，將所得沉淀洗滌至中性，再經(jīng)真空冷凍干燥后，得到磁性殼聚糖復(fù)合微球； (2)將磁性殼聚糖復(fù)合微球加入到戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，磁性殼聚糖復(fù)合微球與戊二醛的質(zhì)量比為0.5~1: 1，室溫下水浴振蕩使反應(yīng)完全后，將所得載體產(chǎn)物洗滌至中性，然后加入到水解酶溶液中，水解酶與載體產(chǎn)物的質(zhì)量比為0.8~3: 1，室溫下利用水浴振蕩固定，再經(jīng)磷酸緩沖溶液清洗和真空冷凍干燥，得到固定化水解酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述Fe3O4納米顆粒是通過化學(xué)共沉淀法制備得到:用N2作保護(hù)氣，在室溫非磁性攪拌條件下，向鐵鹽溶液中逐滴加入氨水，直至PH值為9.5~10.5 ，將產(chǎn)物在78°C~82°C熟化30min~40min，得到Fe3O4懸浮液，在攪拌作用下將Fe3O4懸浮液降至室溫，磁力分離后，去除上清液，所得沉淀用水洗滌至pH值為6.8~7.2，真空冷凍干燥24h~48h后，得到Fe3O4納米顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述鐵鹽溶液是Fe3+和Fe2+的混合溶液，所述鐵鹽溶液中Fe3+和Fe2+的摩爾比為1.6~2: I。
6.根據(jù)權(quán)利要求3~5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖溶液中殼聚糖的濃度為3mg/mL~5mg/mL，所述醋酸溶液中醋酸的質(zhì)量濃度為1%~1.5% ;所述戊二醛溶液中戊二醛的質(zhì)量濃度為1%~2%。
7.根據(jù)權(quán)利要求3~5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述水解酶溶液包括蛋白酶溶液或淀粉酶溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述蛋白酶溶液是由以下方法制備得到:將工業(yè)級(jí)蛋白酶加入到磷酸緩沖溶液中，于48°C~52°C下充分?jǐn)嚢枞芙?，然后進(jìn)行離心處理，取上清液，得到蛋白酶溶液； 所述淀粉酶溶液是由以下方法制備得到:將工業(yè)級(jí)淀粉酶加入到磷酸緩沖溶液中，然后加入氯化鈉溶液作為淀粉酶的激活劑，所得混合液于48°C~52°C下充分?jǐn)嚢枞芙?，再進(jìn)行離心處理，取上清液，得到淀粉酶溶液。
9.一種如權(quán)利要求1或2所述的固定化水解酶或者如權(quán)利要求3~8中任一項(xiàng)制備方法制得的固定化水解酶在污泥水解中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟:將固定化水解酶加入污泥中進(jìn)行厭氧水解，水解溫度為48°C~52°C,水解時(shí)間為4h~5h,振蕩速度為IOOrmp~120rmpo
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK103898086SQ201410167562
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】羅琨, 廖興盛, 龐婭, 李雪, 裴習(xí)君 申請人:長沙學(xué)院