本發(fā)明涉及一種基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA提取試劑盒及其方法，屬于法醫(yī)物證DNA提取技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著法醫(yī)DNA檢驗技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)場提取的生物物證種類范圍越來越廣，用于刑事案件偵破、固定證據(jù)等需求的生物物證范圍不再局限于傳統(tǒng)的血痕、唾液斑、精斑等常規(guī)物證，各種疑難、微量生物物證被納入到法醫(yī)物證DNA檢驗的范疇中來，在實際工作中也有相當(dāng)一部分成功的案例是通過對上述疑難、微量生物物證的檢驗而獲得偵破線索，顯著提高了案件偵破率。與之相對應(yīng)的是上述疑難、微量生物物證的受理數(shù)及檢驗數(shù)顯著增加。如2013年濟南市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所DNA檢驗室受理各類生物物證1835份，其中擦蹭痕、指紋印、手套印、陳舊血痕、水洗血痕等疑難、微量生物物證約422份，占到23％。2014年受理各類生物物證2117份，其中擦蹭痕、指紋印、手套印、陳舊血痕、水洗血痕等疑難、微量生物物證約818份，占到50％左右。到2015年，受理各類生物物證2854份，其中擦蹭痕、指紋印、手套印、陳舊血痕、水洗血痕等疑難、微量生物物證約1725份，占到61％以上。2016年1-3月份受理各類生物物證840份，疑難微量物證585份，占到70％。因受行政編制所限，在這三年之中該實驗室檢驗鑒定人員始終維持在7人。根據(jù)我們在全省范圍內(nèi)的調(diào)研以及與國內(nèi)其他省市同行的交流發(fā)現(xiàn)：物證受理數(shù)呈幾何式增長；疑難、微量物證比重顯著增加；檢驗鑒定人員數(shù)量補充不足。這三點是當(dāng)前全省乃至全國公安機關(guān)刑事案件生物物證DNA檢驗鑒定實驗室所共同面臨的主要矛盾。

隨著新刑事訴訟法對證據(jù)制度的進一步完善及規(guī)范，刑事技術(shù)尤其是素有“證據(jù)之王”美譽的DNA鑒定技術(shù)在指導(dǎo)偵查、收集證據(jù)、認(rèn)定犯罪方面將被進一步強化并發(fā)揮更加重要的作用。全國各級公安機關(guān)刑事案件生物物證DNA檢驗的工作量將會更加繁重。在“降低財政供養(yǎng)人員數(shù)量”及檢驗鑒定人員培養(yǎng)需要一定的周期等背景下，通過增加鑒定人數(shù)量短期內(nèi)無法解決上述矛盾。因此研發(fā)一種經(jīng)濟適用、提取效果穩(wěn)定、檢出率高、速度快、適用于自動化程度高、大通量工作站的疑難、微量生物物證的DNA提取試劑勢在必行。

目前自動化生物物證DNA檢驗工作站主要分為兩大類：1、用于違法犯罪人員血樣檢驗的自動化血樣DNA提取工作站。2、用于常規(guī)及部分疑難生物物證DNA檢驗的小通量自動化DNA提取工作站。受其配套DNA提取試劑所限，上述兩種工作站的優(yōu)缺點十分明顯：

前者，用于違法犯罪人員血樣檢驗的自動化血樣DNA提取工作站，優(yōu)點在于：在2008年到2013年之間，以瑞士tecan等公司的實驗平臺為基礎(chǔ)，被國內(nèi)公安機關(guān)DNA實驗室大范圍引進，普及率高。且該類工作站通量大，一次可以提取96份甚至更多的血樣DNA。但 其缺點也十分明顯，其配套的DNA提取試劑提取檢材范圍僅限于純凈血樣，范圍有限。試劑所需實驗步驟多、流程繁瑣，自動化檢驗過程中穩(wěn)定性稍差。受配套試劑性能所限，目前該類工作站在國內(nèi)大部分公安機關(guān)DNA實驗室基本處于閑置狀態(tài)。

后者，小通量自動化工作站，國內(nèi)引進的以美國AB公司的AutoMate Express等設(shè)備為主，優(yōu)點在于：其配套的DNA提取試劑提取檢材范圍較上述自動化工作站更加寬泛，部分非血痕類物證如精斑、骨骼等物證可以手動消化后半自動化完成DNA提取。但其缺點在于工作站本身通量低，一般在6-13個物證范圍之間，相對于目前公安機關(guān)的物證受理量無異于杯水車薪。該類工作站技術(shù)及其配套的DNA提取試劑受國外專利及技術(shù)保密等原因，無法對其進行增大通量的改造，且該類工作站及相關(guān)耗材均為進口，單臺工作站的引進費用以百萬計，單個物證的DNA提取試劑成本在120元左右，費用較高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA提取試劑盒及其方法。采用本發(fā)明所述試劑盒能從疑難、微量檢材中提取物證DNA，顯著提高檢案成功率，且能夠?qū)崿F(xiàn)40分鐘內(nèi)完成一次實驗可以提取4-93份疑難、微量生物物證DNA。

術(shù)語說明

檢材：擦蹭痕、指紋印、手套印、陳舊血痕、水洗血痕。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA提取試劑盒，包括：

DNA提取磁珠，所述的DNA提取磁珠為表面疏水、粒徑為1～4μm的球形磁珠，核酸結(jié)合能力大于20μg DNA/mg磁珠，飽和磁化強度大于40emu/g；磁珠的多分散系數(shù)小于0.2；

裂解液，所述裂解液中含有濃度為0.3～3M的鹽酸胍、濃度為1～4M的異硫氰酸胍、濃度為10～50mM的Tris-HCL、濃度為10～50mM的乙二胺四乙酸(EDTA)、體積百分比濃度為3～6％的Tween-20、體積百分比濃度為5～20％的Triton-X100，pH7.5～9.0；

洗滌液，所述洗滌液含有濃度為5～20mM的Tris-HCL、體積百分比濃度65～85％的乙醇，pH 7.0～8.0；

DNA洗脫液，所述的DNA洗脫液含有濃度為5～20mM的Tris-HCL、濃度為0.5～2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，pH7.5～9.0。

本發(fā)明所述的DNA提取磁珠主要用來專一性結(jié)合基因組DNA，而不與蛋白質(zhì)、RNA以及其他擴增抑制劑結(jié)合；裂解液用于將檢材中基因組DNA釋放到裂解液中；洗滌液能有效去除磁珠上殘留的擴增抑制物，并保證DNA不從磁珠上丟失；DNA洗脫液能有效的將基因組DNA從磁珠上洗脫下來，各成分需要協(xié)調(diào)配合，從而保證高通量、完全的提取檢材中的DNA成分。

優(yōu)選地，所述的DNA提取磁珠為表面疏水性、粒徑為1μm的球形磁珠。

優(yōu)選地，所述的DNA提取磁珠采用海貍納米科技(蘇州)有限公司的海貍納米羥基磁珠(Mag OH-1000貨號：70950)。

DNA提取磁珠是具有超順磁性、大小均一的疏水性微珠，每個微珠內(nèi)部有均勻分布的超順磁性物質(zhì)(γFe₃O₄)，其外部包被一薄層疏水性物質(zhì)以隔離磁性物質(zhì)。超順磁性使得磁珠在磁場中表現(xiàn)出磁性而離開磁場后失去磁性，大小，形狀，和表面積的均一性(CV＜3％)提供了最佳反應(yīng)動力學(xué)，球性、均一的表面減少了化學(xué)性粘附和非特異性結(jié)合。

優(yōu)選地，所述裂解液中含有濃度為0.8M的鹽酸胍、濃度為1.6M的異硫氰酸胍、濃度為30mM的Tris-HCL、濃度為30mM的乙二胺四乙酸(EDTA)、體積百分比濃度為5％的Tween-20、體積百分比濃度為5％的Triton-X100，pH 8.0。

優(yōu)選地，所述洗滌液含有濃度為10mM的Tris-HCL、體積百分比濃度為80％的乙醇，pH7.5。

優(yōu)選地，所述的DNA洗脫液含有濃度為10mM的Tris-HCL、濃度為1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0。

上述裂解液、洗滌液和DNA洗脫液的配制按本領(lǐng)域的常規(guī)操作進行配制即可。

利用上述基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA提取試劑盒提取DNA的方法，包括如下步驟：

(1)將檢材置于離心提籃套管后，自動化工作站在每個離心籃中加入150～600μl的裂解液后，在80～95℃的金屬浴上進行裂解，時間20～50min，離心去除脫除DNA后的檢材，套管中即為制得的DNA混合液；

(2)自動化工作站將步驟(1)制得的DNA混合液與DNA提取磁珠混合，DNA提取磁珠與DNA混合液混合體積比為1：(10～30)，固液分離，取固體，制得吸附有DNA的磁珠；

(3)自動化工作站將步驟(2)制得的吸附有DNA的磁珠用洗滌液洗滌，吸附有DNA的磁珠與洗滌液的混合體積比為1：(10～80)，制得洗滌后的吸附有DNA的磁珠；

(4)自動化工作站將步驟(3)制得的洗滌后的吸附有DNA的磁珠用洗脫液在50～70℃條件下洗脫，洗滌后的吸附有DNA的磁珠與洗脫液的混合體積比為1：(4～10)，固液分離，取液體，制得DNA溶液。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，裂解條件為：90℃裂解30min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，離心條件為：9000～12000轉(zhuǎn)/min離心1～3min；進一步優(yōu)選的，所述步驟(1)中，離心條件為：12000轉(zhuǎn)/min離心1min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，混合條件為：室溫、1000轉(zhuǎn)/min震蕩混合2～10min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，洗滌條件為：室溫、1000轉(zhuǎn)/min震蕩清洗0.5～2min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，洗脫條件為：65℃、1200轉(zhuǎn)/min震蕩洗脫0.1～1min。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)和(4)中，固液分離為離心，條件為9000～12000轉(zhuǎn)/min離心1～3min；進一步優(yōu)選的，所述步驟(2)和(4)中，離心條件為：12000轉(zhuǎn)/min離心1min。

有益效果

1、本發(fā)明所述DNA提取方法采用磁珠吸附，通過裂解液、DNA提取磁珠、洗滌液和DNA洗脫液相互協(xié)同作用，從疑難微量檢材中提取DNA，可利用現(xiàn)有瑞士tecan自動化工作站實施，40分鐘內(nèi)完成一次實驗可以提取4-93份疑難、微量生物物證DNA，穩(wěn)定性好，顯著提高檢案成功率，且單份檢材提取成本可控制在35元左右，顯著降低檢驗成本；

2、本發(fā)明所述試劑盒中的DNA提取磁珠為表面疏水、粒徑為1～4μm的球形磁珠，核酸結(jié)合能力大于20μg DNA/mg磁珠，飽和磁化強度大于40emu/g；磁珠的多分散系數(shù)小于0.2；實驗證明，該磁珠在本發(fā)明所述的裂解液中專一性高效吸附基因組DNA，通過洗滌液去除殘留物，可方便用于自動化工作站實現(xiàn)高通量提取。

附圖說明

圖1本發(fā)明微量血痕64倍稀釋提取擴增后電泳圖；

圖2 Promega公司IQ試劑盒微量血痕64倍稀釋提取擴增后電泳圖；

圖3中國復(fù)鑒藍盾手動硅珠微量血痕64倍稀釋提取擴增后電泳圖；

圖4 AB公司AutoMate Express自動工作站微量血痕64倍稀釋提取擴增后電泳圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。法醫(yī)領(lǐng)域人員可以借鑒本文內(nèi)容，移植到不同的品牌的自動化工作站中或優(yōu)化相關(guān)參數(shù)。特別強調(diào)指出的是，所有類似的自動化工作站移植和優(yōu)化對法醫(yī)領(lǐng)域人員來說都是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的試劑盒極其方法通過相關(guān)對比驗證實驗進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本發(fā)明所述的方法和應(yīng)用進行適當(dāng)?shù)母膭踊蚪M合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

實施例所述DNA提取磁珠來源于海貍納米科技(蘇州)有限公司的羥基磁珠Mag OH-1000，貨號：70950，該DNA提取磁珠核酸結(jié)合能力大于20μg DNA/mg磁珠，飽和磁化強度大于40emu/g，磁珠的多分散系數(shù)小于0.2。

實施例中所述的自動化工作站為瑞士tecan公司的EVO100-4自動化工作站。

實施例1：微量血痕倍增稀釋實驗

一種基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA的提取試劑盒，包括：

DNA提取磁珠，所述的DNA提取磁珠為表面疏水、粒徑為2μm的球形磁珠；

裂解液，所述裂解液中含有濃度為0.8M的鹽酸胍、濃度為1.6M的異硫氰酸胍、濃度為30mM的Tris-HCL、濃度為30mM的EDTA、體積百分比濃度為5％的Tween-20、體積百分比濃度為5％的Triton-X100，pH8.0；

洗滌液，所述洗滌液含有濃度為10mM的Tris-HCL、體積百分比濃度80％的乙醇，pH 7.5；

DNA洗脫液，所述的DNA洗脫液含有濃度為10mM的Tris-HCL、濃度為1mM的EDTA，pH8.0。

檢材的準(zhǔn)備

取血球計數(shù)實驗為10×10⁹的已知DNA分型結(jié)果的正常志愿者抗凝血以生理鹽水進行稀釋，稀釋倍數(shù)分為8倍、16倍、32倍、64倍、128倍；將各倍數(shù)稀釋血液取1μl加入到離心提籃套管中，每倍數(shù)稀釋血液重復(fù)取20次，即20管；

利用上述基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA的提取試劑盒提取DNA的方法，包括如下步驟：

(1)DNA混合液的制備：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂吸取裂解液300μl加入到每個離心提籃套管中；

人工將離心提籃套管在金屬浴上95℃30min；

離心提籃套管在12000轉(zhuǎn)/min下離心1min，拋棄提籃；將離心后的含有DNA的溶液的套管放回工作站實驗臺上。

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將DNA溶液從2ml離心管中轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中，制得DNA混合液；

(2)DNA混合液中的DNA吸附至磁珠上：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將8μl DNA提取磁珠加到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將裝有DNA混合液+磁珠的96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩混合5min，使磁珠充分吸附DNA；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的溶液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中，制得吸附有DNA的磁珠；

(3)吸附有DNA的磁珠的洗滌：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將350μl洗滌液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩清洗30sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的洗滌液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將150ul洗滌液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩清洗30sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置

30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的洗滌液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到深孔板加熱器上，在85℃下烘干5min；烘干后工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到磁力架上，制得洗滌后的吸附有DNA的磁珠；

(4)DNA溶液的獲得：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將40μl的DNA洗脫液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中，并通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上12000轉(zhuǎn)/min震蕩15sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到深孔板加熱器上，在85℃下孵育6min；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從深孔板加熱器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂吸取30μl，即得到DNA溶液。

所提DNA的檢測

提取后的DNA以Identifiler plus試劑盒進行擴增、以3500xl遺傳分析儀電泳、以GeneMapper軟件進行分析。取12個及以上位點與志愿者DNA分型結(jié)果一致的檢驗結(jié)果為有效結(jié)果。

所提DNA與其他提取試劑/方法進行對比實驗

美國Promega公司手動磁珠DNA提取試劑、中國復(fù)鑒藍盾手動硅珠DNA提取試劑、美國AB公司AutouMate Express自動化DNA提取工作站取上述實驗制備的DNA樣品，按照各自流程提取DNA，并與本實驗結(jié)果進行對比，對比結(jié)果如表1所示。

表1

微量血痕倍增稀釋實驗，1μl抗凝血稀釋64倍后提取DNA，12個及以上位點與志愿者DNA分型結(jié)果一致的檢驗結(jié)果個數(shù)，本發(fā)明自動化工作站檢出數(shù)為20個，Promega公司IQ試劑盒手動檢出數(shù)20個，復(fù)鑒藍盾硅珠試劑盒手動檢出數(shù)為7個，AB公司AutoMate Express 自動工作站檢出數(shù)為16個。

以上實驗表明，本發(fā)明與手動提取的Promeg公司IQ磁珠試劑盒相比，對微量血痕及脫落細(xì)胞類微量檢材的檢驗效果無顯著差異但具有自動化高通量的優(yōu)勢。

實施例2：案件相關(guān)疑難微量檢材的提取

一種基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA的提取試劑盒，包括：

DNA提取磁珠，所述的DNA提取磁珠為表面疏水、粒徑為1μm的球形磁珠；

裂解液，所述裂解液中含有濃度為3M的鹽酸胍、濃度為4M的異硫氰酸胍、濃度為50mM的Tris-HCL、濃度為50mM的EDTA、體積百分比濃度為5％的Tween-20、體積百分比濃度為20％的Triton-X100，pH8.0；

洗滌液，所述洗滌液含有濃度為20mM的Tris-HCL、體積百分比濃度85％的乙醇，pH 7.5；

DNA洗脫液，所述的DNA洗脫液含有濃度為20mM的Tris-HCL、濃度為2mM的EDTA，pH8.0。

檢材的準(zhǔn)備

選取已知DNA檢驗結(jié)果的檢材如下：

指紋痕拭子10枚、擦蹭痕拭子10枚、手套印拭子10枚、放置5年以上的陳舊血痕濾紙10份。

將上述拭子類檢材剪取約3mm×3mm大小、血痕濾紙剪取約2mm×2mm大小。將制備好的檢材加入到離心提籃套管中。

利用上述基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA的提取試劑盒提取DNA的方法，包括如下步驟：

(1)DNA混合液的制備：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂吸取裂解液300μl加入到每個離心提籃套管中；

人工將離心提籃套管在金屬浴上95℃30min；

離心提籃套管在12000轉(zhuǎn)/min下離心1min，拋棄提籃；將離心后的含有DNA的溶液的套管放回工作站實驗臺上。

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將DNA溶液從2ml離心管中轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中，制得DNA混合液；

(2)DNA混合液中的DNA吸附至磁珠上：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將8μl DNA提取磁珠加到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將裝有DNA混合液+磁珠的96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩混合5min，使磁珠充分吸附DNA；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的溶液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中，制得吸附有DNA的磁珠；

(3)吸附有DNA的磁珠的洗滌：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將350μl洗滌液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩清洗30sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的洗滌液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將150μl洗滌液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩清洗30sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的洗滌液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到深孔板加熱器上，在85℃下烘干5min；烘干后工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到磁力架上，制得洗滌后的吸附有DNA的磁珠；

(4)DNA溶液的獲得：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將40μl的DNA洗脫液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中，并通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上12000轉(zhuǎn)/min震蕩15sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到深孔板加熱器上，在85℃下孵育6min；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從深孔板加熱器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂吸取30μl，即得到DNA溶液。

所提DNA的檢測

提取后的DNA以Identifiler plus試劑盒進行擴增、以3500xl遺傳分析儀電泳、以GeneMapper軟件進行分析。取12個及以上位點與已知DNA分型結(jié)果一致的檢驗結(jié)果為有效結(jié)果。

所提DNA與其他提取試劑/方法進行對比實驗

美國Promega公司手動磁珠DNA提取試劑、中國復(fù)鑒藍盾手動硅珠DNA提取試劑、美國AB公司AutouMate Express自動化DNA提取工作站取上述實驗制備的DNA樣品，按照各自流程提取DNA，并與本實驗結(jié)果進行對比，對比結(jié)果如表2所示。

表2

三類常見痕跡拭子(指紋痕跡拭子、擦蹭痕跡拭子、手套印拭子)的總檢出率分別為：

實施例2 76％.6；Promega磁珠：63.3％；復(fù)鑒藍盾硅珠：23.3％；AutouMate Express：76％.6。

上述實驗表明對于實際案件中常見的痕跡拭子類檢材本發(fā)明具有較高的檢出率，優(yōu)于兩種常用的手動試劑盒，與AB公司AutoMate Express自動工作站檢驗結(jié)果不相上下。對于陳舊血痕本發(fā)明檢出率為100％，優(yōu)于AB公司AutoMate Express自動工作站。

實施例3：微量脫落細(xì)胞DNA提取效率實驗

一種基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA的提取試劑盒，包括：

DNA提取磁珠，所述的DNA提取磁珠為表面疏水、粒徑為1μm的球形磁珠；

裂解液，所述裂解液中含有濃度為0.3M的鹽酸胍、濃度為1M的異硫氰酸胍、濃度為10mM的Tris-HCL、濃度為10mM的EDTA、體積百分比濃度為5％的Tween-20、體積百分比濃度為5％的Triton-X100，pH8.0；

洗滌液，所述洗滌液含有濃度為5mM的Tris-HCL、體積百分比濃度65％的乙醇，pH 7.5；

DNA洗脫液，所述的DNA洗脫液含有濃度為5mM的Tris-HCL、濃度為0.5mM的EDTA，pH 8.0。

檢材的準(zhǔn)備

由已知DNA分型結(jié)果的正常志愿者戴潔凈乳膠手套，正?；顒?小時以上。將該乳膠手套內(nèi)側(cè)面用棉簽擦拭后以純凈水浸泡，取50μl浸泡液伊紅染色后進行400倍顯微鏡下觀察并根據(jù)觀察結(jié)果進行稀釋；最終制備成30-50個有核細(xì)胞/全視野的脫落細(xì)胞溶液、10-20個有核細(xì)胞/全視野的脫落細(xì)胞溶液、10個有核細(xì)胞以下/全視野的脫落細(xì)胞溶液。取上述脫落細(xì)胞溶液100μl加入到離心提籃套管中，重復(fù)5次，即5管；

利用上述基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA的提取試劑盒提取DNA的方法，包括如下步驟：

(1)DNA混合液的制備：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂吸取裂解液300μl加入到每個離心提籃套管中；

人工將離心提籃套管在金屬浴上95℃30min；

離心提籃套管在12000轉(zhuǎn)/min下離心1min，拋棄提籃；將離心后的含有DNA的溶液的套管放回工作站實驗臺上。

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將DNA溶液從2ml離心管中轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中，制得DNA混合液；

(2)DNA混合液中的DNA吸附至磁珠上：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將8μl DNA提取磁珠加到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將裝有DNA混合液+磁珠的96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩混合5min，使磁珠充分吸附DNA；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的溶液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中，制得吸附有DNA的磁珠；

(3)吸附有DNA的磁珠的洗滌：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將350μl洗滌液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩清洗30sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的洗滌液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將150μl洗滌液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩清洗30sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的洗滌液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到深孔板加熱器上，在85℃下烘干5min；烘干后工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到磁力架上，制得洗滌后的吸附有DNA的磁珠；

(4)DNA溶液的獲得：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將40μl的DNA洗脫液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中，并通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上12000轉(zhuǎn)/min震蕩15sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到深孔板加熱器上，在85℃下孵育6min；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從深孔板加熱器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂吸取30μl，即得到DNA溶液。

所提DNA的檢測

提取后的DNA以Identifiler plus試劑盒進行擴增、以3500xl遺傳分析儀電泳、以GeneMapper軟件進行分析。取12個及以上位點與志愿者DNA分型結(jié)果一致的檢驗結(jié)果為有效結(jié)果。

所提DNA與其他提取試劑/方法進行對比實驗

美國Promega公司手動磁珠DNA提取試劑、中國復(fù)鑒藍盾手動硅珠DNA提取試劑、美國AB公司AutouMate Express自動化DNA提取工作站取上述實驗制備的DNA樣品，按照各自流程提取DNA，并與本實驗結(jié)果進行對比，對比結(jié)果如表3所示。

表3

微量脫落細(xì)胞DNA提取效率實驗，鏡下細(xì)胞數(shù)為10-20個時，12個及以上位點與志愿者DNA分型結(jié)果一致的檢驗結(jié)果個數(shù)，本發(fā)明自動化工作站檢出數(shù)為18個，Promega公司IQ試劑盒手動檢出數(shù)19個，復(fù)鑒藍盾硅珠試劑盒手動檢出數(shù)為8個，AB公司AutoMate Express自動工作站檢出數(shù)為13個。

以上實驗表明，本發(fā)明對脫落細(xì)胞類微量檢材的檢驗效果優(yōu)于復(fù)鑒藍盾硅珠試劑盒、AB公司AutoMate Express自動工作站，且具有自動化高通量的優(yōu)勢。

實施例4：微量血痕稀釋實驗極限D(zhuǎn)NA提取穩(wěn)定性重復(fù)實驗與微量脫落細(xì)胞DNA提取效率穩(wěn)定性重復(fù)實驗

一種基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA的提取試劑盒，包括：

DNA提取磁珠，所述的DNA提取磁珠為表面疏水、粒徑為1μm的球形磁珠；

裂解液，所述裂解液中含有濃度為2M的鹽酸胍、濃度為2.5M的異硫氰酸胍、濃度為20mM的Tris-HCL、濃度為30mM的EDTA、體積百分比濃度為5％的Tween-20、體積百分比濃度為10％的Triton-X100，pH8.0；

洗滌液，所述洗滌液含有濃度為15mM的Tris-HCL、體積百分比濃度75％的乙醇，pH7.5；

DNA洗脫液，所述的DNA洗脫液含有濃度為10mM的Tris-HCL、濃度為1.5mM的EDTA，pH 8.0。

檢材的準(zhǔn)備

取實施例1中64倍稀釋的血1μl滴入離心提籃套管中，做93個做重復(fù)性檢驗；取實施例3中10-20個有核細(xì)胞/全視野的脫落細(xì)胞溶液取100μl于離心提籃套管中，做93個做重復(fù)性檢驗。

利用上述基于自動化工作站的疑難微量法醫(yī)物證DNA的提取試劑盒提取DNA的方法，包括如下步驟：

(1)DNA混合液的制備：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂吸取裂解液300μl加入到每個離心提籃套管中；

人工將離心提籃套管在金屬浴上95℃30min；

離心提籃套管在12000轉(zhuǎn)/min下離心1min，拋棄提籃；將離心后的含有DNA的溶液的套管放回工作站實驗臺上。

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將DNA溶液從2ml離心管中轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中，制得DNA混合液；

(2)DNA混合液中的DNA吸附至磁珠上：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將8μl DNA提取磁珠加到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將裝有DNA混合液+磁珠的96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩混合5min，使磁珠充分吸附DNA；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的溶液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中，制得吸附有DNA的磁珠；

(3)吸附有DNA的磁珠的洗滌：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將350μl洗滌液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩清洗30sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的洗滌液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將150μl洗滌液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上，室溫以1000轉(zhuǎn)/min震蕩清洗30sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從振蕩器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將96孔深孔板中的洗滌液吸出轉(zhuǎn)移到廢液槽中；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到深孔板加熱器上，在85℃下烘干5min；烘干后工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到磁力架上，制得洗滌后的吸附有DNA的磁珠；

(4)DNA溶液的獲得：

EVO100-4自動化工作站通過加液臂將40μl的DNA洗脫液轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中，并通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到振蕩器上12000轉(zhuǎn)/min震蕩15sec；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板轉(zhuǎn)移到深孔板加熱器上，在85℃下孵育6min；

EVO100-4自動化工作站通過機械手將96孔深孔板從深孔板加熱器上轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置30sec；

EVO100-4自動化工作站通過加液臂吸取30μl，即得到DNA溶液。

所提DNA的檢測

提取后的DNA以Identifiler plus試劑盒進行擴增、以3500xl遺傳分析儀電泳、以GeneMapper軟件進行分析，取12個及以上位點與志愿者DNA分型結(jié)果一致的檢驗結(jié)果為有效結(jié)果；

檢出率計算方法：12個及以上位點與志愿者DNA分型結(jié)果一致的檢驗結(jié)果個數(shù)/93；

表4

本實驗表明：在高通量的前提下，對于微量血痕、脫落細(xì)胞類檢材本發(fā)明具有較為穩(wěn)定的實驗結(jié)果重復(fù)性。且在大通量檢驗時耗材成本是較為重要的考量因素，本發(fā)明單次檢驗成本約為30元，顯著低于Promega公司的IQ試劑盒，AB公司Automate Express自動化工作站試劑盒，中國復(fù)鑒藍盾手動硅珠DNA提取試劑三家的試劑成本。

對比例

對比組1，如實施例1所述的試劑盒，不同之處在于：

DNA提取磁珠采用Promega公司的IQ試劑盒磁珠。

對比組2，如實施例1所述的試劑盒，不同之處在于：

裂解液采用Promega公司的IQ試劑盒裂解液。

對比組3，如實施例1所述的試劑盒，不同之處在于：

洗滌液采用Promega公司的IQ試劑盒洗滌液。

對比組4，如實施例1所述的試劑盒，不同之處在于：

DNA洗脫液采用Promega公司的IQ試劑盒洗脫液。

采用實施例1所述的DNA提取方法采用對比組1～4的試劑盒進行DNA提取操作，結(jié)果見表5、6。

表5、微量血痕穩(wěn)定性重復(fù)實驗64倍稀釋

表6、微量脫落細(xì)胞穩(wěn)定性重復(fù)實驗10-20個細(xì)胞/全視野檢出數(shù)及檢出率

通過本對比例可以看出，磁珠、裂解液、洗滌液、洗脫液四種組分尤其是磁珠與裂解液對于實驗結(jié)果的影響最為明顯，裂解液對于細(xì)胞的裂解、釋放DNA的效率與在特定的裂解液環(huán)境中磁珠結(jié)合DNA的效率高低是影響實驗結(jié)果的重要因素。本發(fā)明選取的裂解液與磁珠相互配合才能取得較為理想的實驗結(jié)果。洗滌液與DNA洗脫液對實驗結(jié)果的影響較前兩者稍小但如不能與前兩者較好的配合仍會影響實驗結(jié)果。綜合上述因素，本發(fā)明所選用的磁珠、裂解液、洗滌液和DNA洗脫液共同作用是保證本發(fā)明具有較高的檢驗成功率的關(guān)鍵。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于法醫(yī)領(lǐng)域人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以移植到不同的品牌的自動化工作站中或優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，這些不同品牌自動化工作站間的移植和優(yōu)化也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護范圍。